Method Article

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

DOI:

10.3791/53447

⸱

March 1st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Stem Cell & Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito describe la creación de tejidos cardíacos de ingeniería definidos utilizando la expresión de marcadores de superficie y la clasificación de células. Los tejidos definidos se pueden utilizar en un biorreactor multitejido para investigar los mecanismos de la terapia celular cardíaca con el fin de proporcionar un sistema modelo funcional, pero controlado, del corazón humano.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ingeniería de tejidos cardíacos humanos puede tener un impacto fundamental en el descubrimiento terapéutico mediante el desarrollo de nuevos sistemas de cribado específicos de especies que replican la biofidelidad del miocardio humano nativo tridimensional, al tiempo que permiten un nivel controlado de complejidad biológica y permiten una monitorización longitudinal no destructiva de la función contráctil de los tejidos. Inicialmente, los tejidos cardíacos de ingeniería humana (hECT) se crearon utilizando toda la población celular obtenida de la diferenciación dirigida de células madre pluripotentes humanas, que normalmente producían menos del 50% de los cardiomiocitos. Sin embargo, para crear modelos predictivos fiables del miocardio humano y dilucidar los mecanismos de interacción heterocelular, es esencial controlar con precisión la composición biológica de los tejidos modificados.

Para abordar esta limitación, utilizamos la clasificación de células vivas para el marcador de superficie cardíaca SIRPα y el marcador de fibroblastos CD90 para crear tejidos que contienen una proporción de 3:1 de estos tipos de células, respectivamente, que luego se mezclan y se agregan a una solución de matriz a base de colágeno. Por lo tanto, los TEC resultantes están completamente definidos tanto en su composición celular como en la de la matriz extracelular.

Aquí describimos la construcción de hECTs definidas como un sistema modelo para entender los mecanismos de las interacciones célula-célula en terapias celulares, utilizando un ejemplo de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea humana (hMSC) que se están utilizando actualmente en ensayos clínicos en humanos. La composición tisular definida es imprescindible para comprender cómo las hMSC pueden estar interactuando con los tipos de células cardíacas endógenas para mejorar la función tisular. También se describe un sistema de biorreactor que cultiva simultáneamente seis hECTs en paralelo, lo que permite un uso más eficiente de las células después de la clasificación.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ingeniería de tejido cardiaco ha avanzado considerablemente en la última década, con múltiples grupos editoriales resultados de tejidos totalmente funcionales, superando confeccionada con cardiomiocitos murinos 1-6 y, más recientemente, los miocitos cardíacos derivados de células madre humanas 7-12. El campo de la ingeniería de tejido cardiaco se debe a dos objetivos primarios y esencialmente independientes entre sí: 1) para desarrollar injertos exógenos que pueden trasplantarse en su defecto corazones para mejorar la función 4-6; y 2) el desarrollo de modelos in vitro para el estudio de la fisiología y la enfermedad, o como instrumentos de evaluación para el desarrollo terapéutico 2,7.

Tridimensional (3-D) de cultivo celular se considera esencial para el desarrollo de herramientas de detección de próxima generación, como la matriz 3-D refleja un microambiente cardiaca más natural que la cultura tradicional monocapa de células 2-D; de hecho, algunos aspectos de la biología celular son fundamentalmente diferentes en 2-D culturas vs. 3-D 13,14 . Además, los tejidos cardíacos ingeniería se construyen a partir de componentes completamente definidas: una matriz extracelular, y una población de células. Para los tejidos cardíacos humanos de ingeniería tradicionales, mientras que la composición de la matriz extracelular (por lo general de fibrina o colágeno 9 7,8,10) está estrictamente controlada, la composición celda de entrada no está bien definido, con toda la mezcla de células a partir de una diferenciación cardiaca dirigido de cualquiera células madre embrionarias (ESC 7,9) o células madre pluripotentes inducidas (IPSC 10,12) que se añaden a los tejidos. Dependiendo de la línea celular específica y la eficiencia del protocolo de diferenciación se utiliza, el porcentaje resultante de los cardiomiocitos puede variar desde menos de 25% a más del 90%, el fenotipo de cardiomiocitos específico (es decir, ventricular-, atrial-, o similar al marcapasos) también puede variar, aunque la fracción no cardiomiocitos puede ser muy heterogéneo 15,16 y alterar la madurez de la m cardiaca diferenciadayocytes 17.

Recientes trabajos de ingeniería de tejido cardiaco ha intentado controlar la población de entrada de las células, ya sea con una superficie de la línea de células madre embrionarias humanas reportero cardiaca 8 o 18 células marcadores se utiliza para aislar el componente de los cardiomiocitos de la diferenciación. Aunque en un principio un tejido compuesto de sólo miocitos cardíacos parece ser el ideal, esto es, de hecho, no es el caso; hECTs compuestas únicamente de los miocitos cardíacos no pueden compactar en tejidos funcionales, con algunos grupos encontrar una relación 3: 1 de los miocitos cardíacos: fibroblastos producir la más alta fuerza de contracción 8. Mediante el uso de diferentes métodos de selección de células, incluyendo marcadores de la superficie para la clasificación de células en vivo, es posible crear hECTs con poblaciones de células definidas. Mientras que los marcadores de las células del estroma no cardíacas han estado disponibles durante algún tiempo, tal como el marcador de fibroblastos putativo CD90 19,20, marcadores de superficie de los miocitos cardíacos han sido más difícilesidentificar. SIRPα estaba entre los primeros marcadores de superficie cardíacos identificados para los miocitos cardiacos humanos 18 y se ha demostrado ser altamente selectivo para el linaje cardiaco. Recientemente, hemos encontrado que la doble clasificación para SIRPα + y CD90 - células rendimientos cardiomiocitos casi puros, con el CD90 + de la población que presenta un fenotipo similar a fibroblastos (Josowitz, observaciones no publicadas). Sobre la base de estos hallazgos recogidos, Aquí se describe la creación de hECTs utilizando una mezcla 3: 1 de combinación SIRPα + / CD90 - cardiomiocitos y fibroblastos CD90 +.

La capacidad de diseñar un tejido cardiaco humano completamente definido es esencial no sólo para la creación de herramientas de detección sólidas, sino también para el desarrollo de sistemas modelo para investigar por células emergentes y las terapias basadas en genes cardiacos. En particular, numerosas terapias con células para la insuficiencia cardíaca, utilizando tipos de células incluyendo las células madre mesenquimales (MSC) 21 , las células madre cardiacas 22 y las células mononucleares de médula ósea 23-25, se han probado en ensayos clínicos. Mientras que muchos de los resultados iniciales han sido prometedores 21,23,25, el beneficio inicial con frecuencia disminuye con el tiempo 26-29. Una tendencia similar se ha reportado en los tejidos cardiacos murinos ingeniería, que muestran un beneficio funcional significativa debido a la suplementación MSC, pero el beneficio no se mantiene durante el cultivo a largo plazo 1. Subyace el rendimiento subóptimo es nuestro conocimiento limitado de los mecanismos que regulan las terapias celulares. Una comprensión más profunda de cómo las células terapéutica ejercer su influencia beneficiosa, así como las posibles consecuencias negativas de las interacciones de los miocitos-nonmyocyte, permitiría el desarrollo de mejores terapias produciendo beneficios clínicamente significativos y sostenidos, con efectos secundarios mínimos, para los pacientes con insuficiencia cardíaca.

A continuación, describimos el uso de hECTs definidos para interrogcomió mecanismos de terapia basada en células. La composición del tejido controlada es esencial para identificar los factores específicos que afectan el rendimiento de los cardiomiocitos. Directamente complementar hECTs con el tipo de célula terapéutico de interés (por ejemplo, MSC), puede revelar los efectos sobre el rendimiento de miocitos cardiacos, como hemos demostrado en el ECTS rata 1.

El siguiente protocolo multi-paso comienza con la diferenciación de células madre cardiaca dirigida, seguido por la fabricación del biorreactor multi-tejido, y concluyendo con una descripción de la construcción de tejidos y análisis funcional. Nuestros experimentos se realizaron con la línea de células madre de embriones humanos aprobados por el NIH H7 (células madre). Sin embargo, los siguientes protocolos también se han probado utilizando una línea de células madre adicionales y tres líneas de célula madre pluripotente inducida (hiPSC) con resultados similares. Hemos encontrado que la eficiencia en la diferenciación de los cardiomiocitos y el éxito en Hect fabricación puede ser línea celular dependiente, particularmente folíneas r hiPSC derivadas de pacientes individuales. Siguiendo este protocolo, dos placas de 6 pocillos se sembraron con un total de 1,68 millones de hESCs (140.000 células por pocillo), que produce aproximadamente 2,5 millones de miocitos después de la diferenciación durante 20 días y clasificación, lo suficiente como para hacer seis tejidos definidos.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nota: Realice todas las manipulaciones celulares en condiciones asépticas utilizando una cabina de seguridad biológica con filtro HEPA de clase II y esterilizar todas las soluciones filtrando a través de un filtro de 0,2 micras. Realizar creación de tejidos y pruebas de función, ya sea en las mismas condiciones asépticas o una campana de flujo laminar.

1. Siembra de hESCs H7 en preparación para la diferenciación cardiaca

  1. (Día 1) Preparación de la membrana basal para la matriz
    1. Descongelar 150 l alícuota de la matriz de la membrana basal cualificado células madre en el hielo durante la noche a 4 ° C.
  2. (Día 0-4) Revestimiento de hESCs sobre placas recubiertas
    1. Diluir la matriz descongelado en 12 ml de helado de DMEM / F12 y mezclar bien.
    2. Transferir 1 ml de la solución / F12-matriz de DMEM en cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos tratada. Cada alícuota de la matriz de la capa es posible que dos placas de 6 pocillos.
    3. Se incuban las placas recubiertas a temperatura ambiente durante al menos 1 hora.
      Nota: Ennuestra experiencia, placas revestidas sellados con parafina se puede almacenar en solución de matriz a 4 ° C durante un máximo de 10 días antes de su uso.
    4. En aproximadamente 75% de confluencia, disociar el H7 hESCs de la placa de 10 cm usando 6 ml del reactivo de disociación no enzimática. Después de 5 min, raspar suavemente las células de la superficie de cultivo usando un rascador de células desechable y transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml estéril.
    5. Retirar 0,5 ml de la solución de disociación con las células desde el tubo de 15 ml y la transferencia a un nuevo tubo estéril ml 15 (dejando 5,5 ml del reactivo de disociación de disociar aún más la hESCs) para la propagación de la línea de células madre.
    6. Se precipitan los 0,5 ml de células a 300 xg durante 5 min a 20 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente en 8 ml de medio de células madre pluripotentes que contiene penicilina-estreptomicina al 1% y luego transferir a una nueva, recubiertas, 10 cm placa de cultivo tisular y mantener 37 ° C y 5% de CO 2 para mantener la línea de células madre.
      Nota: Mantenga los medios de células madre pluripotentes en hielo durante los cambios de los medios de comunicación.
    7. Mientras tanto, añadir 5,5 l de 10 mM inhibidor ROCA Y-27632 de la solución restante 5,5 ml de la disociación y continuar incubar a temperatura ambiente durante otros 5 a 10 min. Mezclar suavemente las células con una pipeta serológica de 5 ml. Continuar incubar hasta que se consigue una suspensión de células, entonces sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    8. Resuspender las células en 5 ml de medio de células madre pluripotentes y realizar un recuento de células usando un hemocitómetro.
    9. Seed cada pocillo de la placa de 6 pocillos a una densidad de 140.000 células por pocillo. Seed dos placas de 6 pocillos para crear un total de seis tejidos definidos. Disponer de cualquier resto de las células después de la siembra.
    10. Llenar los bien a 1 ml con medios de células madre pluripotentes y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2. Veinticuatro horas más tarde, saque la tarjeta y añadir 2 ml de medio de células madre pluripotentes fresca a cada pocillo (Figura 1A ).
    11. Compruebe la confluencia de las placas de cada día y comenzar la diferenciación una vez que las células alcanzan aproximadamente el 75% de confluencia (Figura 1B - D).

2. (día 4-24) diferenciación de células madre embrionarias humanas a cardiomiocitos 30,31

  1. (Día 4-7, 0-3 Diferenciación Día) mesodermo Inducción
    1. Preparar RPMI medio de diferenciación I (Tabla 1) mediante la combinación de 500 ml RPMI 1640 con 10 ml de suplemento B27 (sin insulina) y 5 ml de la solución madre de penicilina-estreptomicina (10.000 IU / ml de penicilina; 10.000 g / ml de estreptomicina). Alícuota, en el hielo, en tubos de 50 ml y se almacena a 4 ° C.
    2. (Día 4, Diferenciación Día 0) Preparar los medios de inducción del mesodermo mediante la adición de 2,4 l de la CHIR99021 pequeña molécula inhibidora de GSK3 (madre 10 mM, 6 mM de concentración final) a 12 ml de medio RPMI diferenciación I. Quitar medio de células madre pluripotentes de cada pocillo unnd sustituir con 2 ml de los medios de inducción del mesodermo por pocillo. Devolver la placa a la incubadora.
      Nota: la muerte celular significativa se produce normalmente con la adición de CHIR99021 (Figura 1E). La monocapa se recuperará, pero es importante para enjuagar las células muertas de la distancia con el enjuague DMEM / F12.
    3. (Día 5, diferenciación Día 1) preparar los medios de inducción del mesodermo fresco como se describe anteriormente. Eliminar los viejos medios de cada pocillo y se lava una vez con 1 ml de DMEM / F12 por pocillo. Añadir 2 ml de medio de inducción mesodermo fresco a cada pocillo.
      Nota: Enjuague de cada día desde el día 0 hasta 10 aumenta en gran medida el rendimiento y la pureza de los miocitos cardíacos.
    4. (Día 6, Diferenciación Día 2) Eliminar los medios de inducción cardíacos y enjuagar una vez con 1 ml de DMEM / F12 por pocillo. Vuelva a colocar el enjuague con 2 ml de RPMI medio de diferenciación I (no hay moléculas pequeñas añadido, pero aún con la B27 (sin insulina suplemento)) y volver a la incubadora.
  2. (Día 7-13, Diferenciación Day 3-10) mesodermo cardíaco Inducción
    1. (Día 7, Día Diferenciación 3) Preparar los medios de inducción del mesodermo cardíaco mediante la adición de 6 l de la pequeña molécula inhibidor de Wnt-1 IWR (madre 10 mM, 5 mM final) a 12 ml de RPMI medio de diferenciación I.
    2. Retire el medio de cada pocillo, se lava una vez con 1 ml de DMEM / F12 por pocillo y reemplazar con 2 ml de medio de inducción del mesodermo cardíaco por pocillo.
    3. (Día 8 de Diferenciación día 4) Preparar un adicional de 12 ml de medio de inducción del mesodermo cardíaco como se ha descrito anteriormente. Eliminar los medios de comunicación añadió el día anterior, se lava una vez con 1 ml de DMEM / F12 por pocillo y se reemplaza con 2 ml de medio de diferenciación del mesodermo cardíaco fresco por pocillo y volver a la incubadora.
    4. (Día 9-10, Diferenciación Día 5-6) En ambos días, retire los medios de inducción del mesodermo cardíaco y enjuagar cada pocillo con 1 ml de DMEM / F12.
    5. Añadir 2 ml de RPMI fresco medio de diferenciación I (no hay moléculas pequeñas añadieron pero aún con la B27 (sin insulina) suplemento)a cada pocillo y la placa de volver a la incubadora.
  3. (Día 11-24, Diferenciación Día 7-20) derivado de HES cardiaca Organización de los miocitos / Maduración
    1. Preparar el RPMI medio de diferenciación II (Tabla 1) mediante la combinación de 500 ml RPMI 1640 con 10 ml de suplemento B27 (con insulina) y 5 ml de la solución madre de penicilina-estreptomicina. Alícuota, en el hielo, en tubos de 50 ml y se almacena a 4 ° C.
    2. (Día 11, Día Diferenciación 7) Retire medio de diferenciación RPMI (sin insulina) de cada pocillo y enjuague con 1 ml de DMEM / F12. Reemplazar con 2 ml de los nuevos medios de diferenciación RPMI II (con insulina) a cada pocillo y volver a la incubadora.
      Nota: latido espontáneo primero debe observarse entre los días 7 y 10. Si golpeo no se observa durante este tiempo, por lo general indica una pobre eficiencia de diferenciación. El protocolo puede ser continuado hasta el día 15 en un esfuerzo por observar que late, pero si hay golpeo se observó el día 15 lo mejor es steres una nueva diferenciación.
    3. (Día 12-24, Diferenciación Día 8-20) Todos los días, quitar los viejos medios de diferenciación y reemplazar con 2 ml de RPMI medio de diferenciación II por pozo para permitir la maduración de las células y la organización de la monocapa de golpeo (Figura 1F, Video Figura 1 ).
      Nota: Dependiendo de la muerte celular residual, puede ser necesario enjuagar con 1 ml de DMEM / F12 hasta el día 10 de diferenciación.

3. (Día 24, Día Diferenciación 20) El aislamiento de miocitos cardíacos y células similares a fibroblastos

  1. Disociar celdas de la monocapa
    1. Retire el medio de diferenciación y se lava una vez con 1 ml de PBS.
    2. Disociar las monocapas con 1 ml de la solución de disociación enzimática (0,04% de tripsina / 0,03% de EDTA) a cada pocillo.
    3. Mueva la placa en la incubadora durante 10 minutos. Mientras tanto, añadir 12 l de inhibidor de Rock a 6 ml de solución de tripsina neutralización.
    4. GenTLY Agregar 1 ml de la solución de tripsina de neutralización que contiene el inhibidor de la roca para cada pocillo de la placa para neutralizar la solución de tripsina.
    5. Con una pipeta de transferencia estéril, mezclar suavemente cada pocillo para separar los grupos de células.
    6. Transferir los 12 ml de la placa de 6 pocillos a un tubo de centrífuga de 15 ml.
      Nota: Puesto que dos placas de 6 pocillos se utilizan en este protocolo, se necesitarán dos tubos de 15 ml.
    7. Transferencia de 3 ml de PBS a un pocillo de la placa, y luego transferir secuencialmente los mismos 3 ml a cada pocillo subsiguiente para recoger las células residuales en el plato. La transferencia de los restantes 3 ml de la final bien en el mismo tubo de centrífuga de 15 ml que contiene las células.
    8. Pellet a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
  2. Preparar las células para la clasificación de células en vivo por FACS
    1. Preparar el tampón de tinción mediante la adición de 5 ml de suero bovino fetal a 45 ml de PBS en hielo con 50 l de inhibidor de la roca.
    2. Eliminar el sobrenadante de la pel celulardejar que (en 3.1.8) y se vuelve a suspender en 1,2 ml de tampón de tinción.
    3. Transferir 200 l de la suspensión celular a un nuevo, pre-refrigerado, 50 ml tubo de centrífuga en hielo. Este será el control de la tinción negativa.
    4. Transferir el restante 1 ml de suspensión celular a un nuevo, pre-refrigerado, 50 ml tubo de centrífuga en hielo y añadir 2 l SIRPα-PE / Cy7 (dilución 1: 500) y 4 l de CD90-FITC (dilución 1: 250) . Mezclar suavemente la suspensión de células con una pipeta de transferencia y volver al hielo.
    5. Incubar tanto el control negativo y la muestra, en un agitador de eje de balancín, en hielo, a 4 ° C durante 1 hr.
    6. Preparar tubos de recogida de muestras mediante la adición de 3 ml de medio RPMI (con insulina) a dos tubos de centrífuga de 15 ml. Añadir 3 l de inhibidor de roca para cada tubo y almacenar en hielo.
    7. Sedimentar las células teñidas a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y enjuagar dos veces con al menos 10 ml de PBS enfriado con hielo por enjuague.
    8. Añadir 1 l de DAPI (1 mg / ml) a 5 ml de tampón de tinción. Suavementeresuspender el precipitado muestra con 1-3 ml del tampón de tinción que contiene DAPI-utilizando una pipeta de transferencia.
    9. Añadir 500 l de tampón de tinción (sin DAPI añadido) con el control negativo.
    10. filtrado suavemente tanto el control negativo y la muestra a través de un filtro de 40 micras de células para eliminar grupos de células y transferir al poliestireno tubos FACS en hielo. Inmediatamente traer muestras a la clasificación de células.
    11. Similares a células vivas establecido métodos de clasificación 18, use el control negativo para ajustar las puertas, seleccionar las células vivas (DAPI negativo) y recogen tanto el FITC + (es decir, CD90 + fibroblastos) y PE Cy7 + (es decir, SIRPα + cardiomiocitos / ) las poblaciones de forma independiente a 20 psi (Figura 2).
      Nota: Después de ajustar las puertas, el control negativo puede ser fijado en el 4% PFA para determinar la eficiencia de la diferenciación mediante la tinción de troponina T cardiaca.
      Nota: Algunos investigadores prefieren utilizar unacontrol de isotipo en lugar del control sin teñir para ajustar las puertas a fin de compensar por la unión de anticuerpo no específica. Un control de llamada de fluorescencia menos uno (FMO) es otra posibilidad. Debido a la clara distribución bimodal de las señales de PE-Cy7 FITC, y DAPI, que GaTeD de la población positiva, de manera conservadora que apunta lejos en la puerta positiva, lo que posiblemente excluye algunos verdaderos positivos, pero ayuda a minimizar los falsos positivos.
  3. Reagrupamiento de células en preparación para la Ingeniería de Tejidos
    1. Después de que el tipo de células, Pellet ambos tubos de recogida y volver a suspender en 1 ml de DMEM que contiene 10% de suero bovino neonatal, 1% de penicilina-estreptomicina y 0,2% de anfotericina B ( "medios NBS").
    2. Recombinar la SIRPα + y células CD90 + en una proporción de 3: 1 y la placa de las células combinadas en una cultura no tejido tratado placa de Petri a una densidad de 2 millones de células por 60 cm 2 (10 cm plato). Añadir 10 ml de medios del NBS y 101; l de inhibidor ROCA Y-27632.
    3. Coloque suspensión de células en la incubadora de cultivo de tejidos durante 48 horas para permitir la reagregación de células en pequeños clusters.

4. Ingeniería de Tejidos Humanos cardiaca

  1. Fabricar el biorreactor Multi-tejido
    Nota: Para complementar las ilustraciones de la figura 3A, archivos CAD con esquemas de diseño de biorreactores detallada están disponibles bajo petición de los autores.
    1. Máquina del molde maestro PDMS mediante la perforación de seis agujeros uniformemente espaciados de 0,5 mm de diámetro en un 9 x 33 x 3,25 mm paralelepípedo de politetrafluoroetileno.
    2. El uso de una fresa radial, máquina de un fotograma de polisulfona de 25 x 35 x 11 mm 3. El propósito de la trama es mantener los puestos de PDMS (construidas a partir del fundido hecho anteriormente) en alineación con los pozos de la placa de base.
    3. El uso de un 1 mm de fresa radial, máquina de 6 pocillos (6 x 1 x 1 mm 3), 4 mm de separación, en un 20 x 40 x 5 mm 3 pieza de poli negrotetrafluoroetileno para formar la placa de base.
    4. Mezclar la base elastomérica y agente de curado para el polidimetilsiloxano (PDMS) en un 10: 1 w / w proporción y añadir al molde politetrafluoroetileno personalizado (etapa 4.1.1) para crear dos filas de seis puestos de detección de fuerza, y se incuba durante la noche y bajo vacío a 80 ° C. Después del curado, retire con cuidado el PDMS del molde principal y marque cuidadosamente la parte superior de cada poste con un marcador permanente negro para mejorar el contraste y automatizado de seguimiento posterior de desviación en tiempo real.
      Nota: politetrafluoretileno es bastante suave y se puede dañar fácilmente. Tenga cuidado al limpiar el molde maestro antes de PDMS fundición para garantizar la longevidad del sistema y la geometría palo PDMS consistente. Un alambre de 0,5 mm se puede usar para limpiar los orificios de los mensajes después de cada uso, pero tenga cuidado de no raspar el interior de los agujeros.
      Nota: Una alternativa es para desgasificar los PDMS bajo vacío durante varias horas a temperatura ambiente, a continuación, dejar que la cura mezcla a presión ambiente.Esto puede dar lugar a un menor número de burbujas de gas residual que se forman en el PDMS durante el proceso de curado.
    5. Esterilizar todos los componentes en un autoclave de vapor.
      Nota: El molde de PDMS maestra (paso 4.1.1) y el marco de polisulfona (paso 4.1.2) son tanto reutilizable. Los mensajes creados a partir de PDMS del molde (paso 4.1.4) también es reutilizable pero sólo durante unos 10 usos. Sin embargo, más puestos de PDMS se pueden crear como sea necesario con el molde maestro.
  2. Recoger las células cardiacas reagregadas
    1. Eliminar las células reagregadas de la incubadora y transferir los 10 ml de los medios de comunicación reagregación a un tubo de centrífuga de 50 ml.
    2. Aclarar la placa con 3 ml de PBS y transferir el enjuague a la misma 50 ml tubo de centrífuga que contiene los medios de comunicación reagregación.
    3. Añadir 3 ml de 0,04% de tripsina / 0,03% de EDTA a la placa de 10 cm y volver a la incubadora durante 5 min.
    4. Después de 5 minutos, examinar la placa con un microscopio compuesto invertida en un aumento de 10X para asegurar dissocia celular completala de la placa. Si algunos grupos residuales todavía están unidos, agitar suavemente la placa para separar los grumos. Si los grupos permanecen unidos, volver a la incubadora durante otros 2-3 minutos. No incubar más de diez minutos o muerte celular significativa puede ocurrir.
    5. Una vez se separan todas las células, añadir 3 ml de solución de tripsina de neutralización. Mezclar suavemente la solución de neutralización con la solución de células con tripsina y traslado al tubo de centrífuga de 50 ml que contiene los medios de reagrupamiento y se lava una vez con PBS.
    6. Enjuague el plato entero con 5 ml de PBS y transferir al mismo tubo 50 ml que contiene las células.
    7. Sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    8. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de medio de NBS, a continuación, transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    9. Se precipitan a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante. Las células cardíacas (células CD90 + estroma y SIRPα + MYOCytes) ahora están listos para la construcción de tejido.
  3. (Opcional) recoger células Suplementarios de interés
    Nota: Además de los tejidos definidos que contienen sólo SIRPα + cardiomiocitos y células similares a fibroblastos CD90 +, es posible añadir las células de interés adicionales para interrogar a su efecto sobre la función del tejido. Por ejemplo MSC de rata se ha demostrado para mejorar la función de los tejidos cardiacos de rata ingeniería 1. El siguiente paso opcional describe la colección de células suplementarios para el sistema definido.
    1. Recoger el tipo de célula suplementaria de interés (por ejemplo, células madre mesenquimales) usando 0,25% de tripsina / 0,1% de EDTA.
    2. Sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y después volver a suspender en 5 ml de medio de cultivo celular adecuado para el tipo de célula de interés. Por ejemplo, para las MSC, utilice DMEM suplementado con suero bovino fetal 20%, 1% de penicilina-estreptomicina y 0,2% anfotericina-B a la cultura de la cells.
    3. Realizar un recuento de células usando un hemocitómetro, entonces sedimentar las células de nuevo a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    4. Eliminar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de medio de cultivo celular y transferir a un tubo de 1.5 ml.
    5. Sedimentar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    6. Eliminar el sobrenadante. Las células suplementarios ya están listos para la construcción de tejido.
      Nota: si se añaden las células suplementarios a una concentración de 10% del número total de células en el tejido, a continuación, para los tejidos definidos, esto requerirá 50.000 células suplementarios por el tejido, ya que cada tejido contiene 500.000 células cardíacas (tanto las células del estroma CD90 + y miocitos SIRPα +).
  4. Crear las Engineered cardíacos Tejidos Humanos
    Nota: Almacenar todas las soluciones en el hielo y las células a temperatura ambiente. Todos los volúmenes que aparecen abajo son por el tejido. Típicamente, aproximadamente seis tejidos pueden construirse a partir de dos de 6 pocillos plAtes de diferenciaciones cardíacas.
    1. Diluir 60,0 l de la 5 mg / ml de stock de colágeno a 3,125 mg / ml con 1,5 l de NaOH 1 M, 9,6 l de 10x PBS y 24,9 l de agua desionizada ultrapura estéril.
      paso crítico: evitar la introducción de burbujas de aire para cada solución durante la preparación como burbujas de aire interrumpir la formación de tejido adecuada.
    2. Añadir 12,0 l de 10x tanto MEM y 0,2 N HEPES pH 9 a la mezcla de colágeno diluido para crear la mezcla de colágeno. Añadir las dos soluciones por el lado del tubo de centrífuga de 15 ml con el fin de evitar la introducción de burbujas de aire en la mezcla de colágeno.
    3. Añadir la matriz de la membrana basal a una concentración final de 0,9 mg / ml a la mezcla de colágeno y almacenar en hielo para crear la mezcla final de tejido. La concentración final de colágeno debe ser de 2 mg / ml.
    4. Añadir 500.000 de las células reagregadas a la mezcla tejido (concentración de fibroblastos miocitos + es de 20 millones / ml) y rellenar hasta un volumen final de 25 l portejido, ya sea con medios NBS libres de células o 50.000 células del tipo de célula suplementaria de interés (por ejemplo, las hMSC) y mezclar bien para formar una suspensión celular uniforme.
      Nota: El número de células suplementadas variará de para diferentes aplicaciones. Aquí se utiliza la administración de suplementos 10%.
    5. Con cuidado, pipeta de 25 l de la suspensión celular en cada uno de los seis pozos de la placa de base biorreactor, sin introducir burbujas de aire en el pozo.
    6. Empuje dos filas de los sensores de fuerza PDMS en cada lado del bastidor de polisulfona, formando 6 pares de postes opuestos, a continuación, invertir el marco en la parte superior de la placa de base de modo que un par de postes entra en cada pocillo que contiene la suspensión celular.
      Nota: El marco de polisulfona incluye pestañas para ayudar en la alineación de los PDMS.
    7. Con cuidado, coloque el biorreactor, placa de base hacia abajo, en una placa de 60 mm, a continuación la cápsula sin su cubierta interior de una placa de 10 cm, coloque la cubierta de 10 cm en la parte superior, y mover todo el conjunto en biorreactora la incubadora de cultivo de tejidos, a la espera de dos horas para el tejido de gel.
    8. Después de 2 horas, retire el biorreactor de la incubadora y añadir 14 ml de medio de NBS a todo el conjunto, lo suficiente para cubrir la placa de base. Volver a la incubadora, y cambiar la mitad de los medios de comunicación todos los días.
    9. Cuarenta y ocho horas más tarde, retire con cuidado la base moviendo suavemente cada lado de la placa base fuera del marco de unos pocos milímetros a la vez, cambiar los medios de comunicación, a continuación, devolver el biorreactor, tejidos hacia abajo, a los medios de comunicación.
    10. Continuar el cambio medio de los medios de cultivo de NBS cada día.
      Nota: Las contracciones espontáneas de los tejidos pueden ser observados a los 3 días después de la construcción del tejido, generando fuerzas de contracción medibles ya en el día 5 a 7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para obtener los miocitos cardíacos, una versión ligeramente modificada de los métodos de diferenciación Boheler y Lian se utiliza 30,31. Es imperativo que la diferenciación se inicia durante el registro de la fase de crecimiento celular, sino también que la población inicial es suficientemente confluente para obtener un número utilizable de las células después de la clasificación (aproximadamente 75% es óptimo). Típicamente, para H7 hESCs, placas a una densidad de 140.000 hESCs por pocillo de una placa de 6 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Construcción de tejidos humanos definidos por ingeniería cardíacas (hect) puede proporcionar un modelo más consistente y fiable de la función de los cardiomiocitos humanos. Fundamentalmente, todos los componentes celulares y extracelulares en el sistema son conocidos y se pueden manipular como se desee, eliminando así la influencia de confusión de otros tipos de células desconocidos que resultan del proceso de diferenciación. Para equilibrar el crecimiento celular rápido y de alto rendimiento, es preferible que la difer...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por el NIH (1F30HL118923-01A1) a la Joint Commission, NIH / NHLBI PEN contrato HHSN268201000045C al KDC, el consejo beca de investigación de Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), el NIH (R01 HL113499) para BDG, la American Heart Association (12PRE12060254) a RJ, y del Consejo de Investigación de subvención de la RAE (TBR, T13-706 / 11) en RL financiación adicional fue proporcionada por el NIH para TJC DRB 5T32GM008553-18 y como un periodo de prácticas de Formación NIDCR-Interdisciplinario en Sistemas y Desarrollo biología y defectos congénitos T32HD075735. Los autores también desean expresar su agradecimiento por Arthur Autz en el Centro de Zahn El City College de Nueva York para obtener ayuda con el mecanizado del biorreactor y Mamdouh Eldaly para la asistencia técnica. También agradecemos al Dr. Kenneth Boheler para el asesoramiento sobre la diferenciación cardiaca, y el Dr. Joshua Hare generosamente para proporcionar células madre mesenquimales humanas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell CultureCompanyNúmero de catálogoComments
Amphotericin BSigma-AldrichA2411Prepare un stock de 2,5 mg/ml en DMSO y filtre-esterilice
B27 con InsulinaLife Technologies17505055
B27 sin insulinaLife TechnologiesA1895601
CHIR99021Stemgent04-0004Create 6 μ M stock, luego alícuota y almacenamiento a -20  °C.
Essential 8 MediaLife TechnologiesA1517001
H7 Células madre embrionarias humanasWiCellWA07
hESC Qualified Matrix, Corning MatrigelCorning 354277Descongelar en hielo a 4 & grados; C durante la noche luego alícuota 150 μ l en tubos separados y almacene a -20   °C.
IWR-1Sigma-AldrichI0161Crear stock de 10 mM y alícuota. Almacenar a -20 ° C
Suero de ternero neonatalLife Technologies16010159
Reactivo de disociación no enzimática: Reactivo de disociación celular suaveTecnologías de células madre7174
Penicilina-estreptomicinaCorning30-002-CI
RPMI 1640 LifeTechnologies11875-093Mantener refrigerado
Y-27632 (inhibidor de ROCK)Stemgent04-0012Volver a suspender a una concentración de stock de 10 mM, alícuota y almacenar a -20  °C. Evite los ciclos de congelación y descongelación.
Cell SortingCompanyNúmero de catálogoComments
4',6-Diamidino-2-Phenylindol, Dihidrochloride (DAPI)Life TechnologiesD1306
CD90-FITCBioLegend328107
Reactivo de disociación enzimática: Kit de separación de células I (0,04 % de tripsina/0,03 % de EDTA, solución de neutralización de tripsina y solución salina tamponada de Hanks) PromoCellC-41200
Suero Fetal BovinoAtlanta BiologicsS11250
SIRPα-PE/Cy7BioLegend323807
Tissue ConstructionCompanyNúmero de catálogoComments
0.25% Trypsin/0.1% EDTAFisher Scientific25-053-CIOpcional: Para la recolección de células suplementarias de interés
10x MEMSigma-AldrichM0275-100ML
10x Paquetes PBSSigma-AldrichP3813
Colágeno, Bovino Tipo ILife TechnologiesA10644-01Mantener en hielo
DMEM/F12Life Technologies11330057
Dulbecco' s Águilas modificadas Medio (DMEM), alta glucosaSigma-AldrichD5648
Polidimetilsiloxano (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Sodio HEPESSigma-AldrichH3784
Hidróxido de sodioSigma-Aldrich221465
MaterialesEmpresa>Número de catálogo>Comentarios
1,5 ml Tubos de microcentrífugaFisher ScientificNC0536757
15 ml Tubo de centrífuga de polipropilenoCorning352096
5 ml Tubo de fondo redondo de poliestirenoCorning352235Con 35 &mu integrados; M filtro de células
50 ml tubo de centrífuga de polipropilenoCorning352070
6 pocillos de fondo plano placa tratada para cultivo de tejidosCorning353046
raspador de células, desechableBiologix70-2180
PolisulfonaMcMaster-Carr
Politetrafluoroetileno (teflón)McMaster-Carr
EquipmentCompanyNúmero de catálogoComments
Dissecting Microscopio de disecciónOlympusSZ-61O similar, debe tener un soporte para que la cámara de alta velocidad se acople Sistema
estimulación eléctricaAstro-Med, IncGrass S88X Estimulador
de Alta Velocidad CámaraPixelinkPL-B741UO similar, pero debe ser capaz de 100 fotogramas por segundo para una adquisición de datos precisa
ControlSe utiliza para mantener la temperatura del medio durante la adquisición de datos.
Custom MaterialsCompany>Número de catálogo>Comments
LabView Programaposterior disponible a petición de los autores
de de temperatura de la placa de seguimiento

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397(2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147(2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010(2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293(2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742(2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Engineered Cardiac TissueLive Cell SortingSIRP Alpha MarkerCD90 Fibroblast MarkerCollagen Based MatrixBioreactor SystemMesenchymal Stem CellsContractile Force MeasurementTissue CompactionFACS Collection

Related Articles