Ortotópico de la extremidad posterior de trasplante en el ratón

Resumen

Este modelo novedoso para posterior trasplante ortotópico extremidad en el ratón, la aplicación de una técnica de manguito no de sutura para la anastomosis super-microvascular, proporciona una herramienta poderosa para la investigación inmunológica in vivo mecanicista relacionada con alotrasplante compuesto vascularizado (VCA).

Resumen

Los sistemas de modelos animales in vivo, y en particular los modelos de ratón, han evolucionado hasta convertirse en herramientas científicas potentes y versátiles indispensables para la investigación básica y traslacional en el campo de la medicina de trasplantes. Una amplia gama de reactivos está disponible exclusivamente en este entorno, incluidos los anticuerpos monoclonales y policlonales para aplicaciones diagnósticas e intervencionistas. Además, un gran número de cepas genotipadas, endogámicas, transgénicas y knock out permiten una investigación detallada de las contribuciones individuales de los componentes humorales y celulares a la compleja interacción de una respuesta inmunitaria y convierten al ratón en el estándar de oro para la investigación inmunológica.

El alotrasplante compuesto vascularizado (VCA) delinea un nuevo campo de trasplante utilizando aloinjertos para reemplazar "lo similar con lo similar" en pacientes que sufren pérdida de tejido traumática o congénita. Este protocolo metodológico quirúrgico muestra el uso de una técnica de manguito sin sutura para la anastomosis supermicrovascular en un modelo ortotópico de trasplante de extremidades traseras de ratón. El modelo permite específicamente la comparación entre los paradigmas establecidos en el trasplante de órganos sólidos con una nueva forma de trasplante que consiste en varios componentes tisulares diferentes. De manera única, este modelo permite el trasplante de un compartimento y nicho de médula ósea vascularizada viable que tiene el potencial de ejercer un efecto beneficioso sobre el equilibrio de la aceptación y el rechazo inmunológico. Esta técnica proporciona una herramienta para investigar el reconocimiento de aloantígenos y el rechazo y la aceptación del aloinjerto, así como permite la realización de estudios de regeneración funcional del nervio para avanzar aún más en este nuevo campo del trasplante.

Introducción

A finales de los noventa se anunciaron los días pioneros del trasplante reconstructivo con el primer trasplante de mano exitoso realizado en Francia en 1998. Desde entonces, el uso de VCA para la reconstrucción de defectos tisulares devastadores se ha empleado con éxito en un amplio espectro de pacientes. Hasta la fecha, el mundo cuenta con 76 receptores de 112 extremidades superiores, así como 31 rostros ^1-3. Además, se han realizado varios otros tipos de VCA como la pared abdominal ⁴, la laringe ⁵, la tráquea ⁶, las articulaciones vascularizadas ⁷ e incluso el pene ⁸. Además, recientemente se ha reportado el nacimiento vivo de un bebé después de un trasplante de útero ⁹. Esta creciente experiencia mundial es indicativa de cómo el trasplante reconstructivo se ha convertido en una opción terapéutica válida para los pacientes que sufren defectos tisulares funcionales significativos que no pueden ser modificados por la cirugía y el tratamiento reconstructivo y restaurador convencional.

Si bien la idea de reemplazar "igual por igual" despertó entusiasmo clínico, el escepticismo inicial aún prevalece con respecto a los efectos secundarios de la inmunosupresión convencional de dosis alta necesaria para mantener los aloinjertos y su función ^10,11. Sin embargo, como se muestra en el trabajo seminal de Lee et al., estos injertos compuestos tienen menos probabilidades de rechazarse que sus componentes individuales y, además, algunos de los componentes del tejido, como el compartimento óseo vascularizado, han alimentado el optimismo, ya que podrían ejercer efectos inmunológicos únicos en el equilibrio de la aceptación y el rechazo inmunológico ¹².

Nuestro grupo fue pionero en varios modelos animales microquirúrgicos para el trasplante de órganos sólidos, así como para el alotrasplante compuesto vascularizado ^13-19. En este trabajo describimos un procedimiento quirúrgico novedoso que utiliza una técnica de manguito sin sutura para realizar una anastomosis supermicrovascular en un modelo ortotópico de trasplante de extremidades traseras de ratón. Este modelo de trasplante proporciona una herramienta útil para investigar los mecanismos de aceptación y rechazo inmunitarios, así como el papel de los componentes individuales del tejido, como el compartimento de la médula ósea vascularizada, hacia la inducción de la tolerancia en el entorno inmunológicamente versátil de la especie de ratón. Además, la colocación ortotópica de la extremidad abre las posibilidades para la regeneración nerviosa y los estudios de resultados funcionales, que son de vital importancia para el establecimiento de la VCA.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité de la Universidad Johns Hopkins y Uso Animal Care (JHUACUC). Los procedimientos específicos se realizaron bajo el protocolo ACUC MO13M108 aprobado.

1. Operación del Donante

1. Administrar analgesia en el punto de tiempo apropiado para cada formulación farmacológica antes de la cirugía. De acuerdo con el cuidado de los animales y el uso del protocolo aprobado el uso de 0,1 mg / kg de peso corporal por vía subcutánea de buprenorfina 1 hora antes de la incisión de la piel.
2. Sedar al donante con isoflurano aplica a través de una cámara unida a un vaporizador de isoflurano al 4%; mantener sedación y anestesia en 2% a través de un cono de nariz. Realizar toe retirada pizca reflexión para controlar la profundidad de la anestesia antes de la iniciación del procedimiento.
3. Use mascarillas, batas y guantes desechables de aislamiento.
4. Afeitar el ar quirúrgicaea, en particular, la extremidad posterior y la ingle, y de preparación con 10% de povidona - yodo.
5. Utilice un paño campo estéril, instrumentos esterilizados en autoclave y un microscopio de gran aumento (40X).
6. Hacer incisión en la piel de la ingle con tijeras proximalmente a la zona de la mitad del muslo y conectar circunferencialmente la incisión para demarcar la extremidad posterior del resto del cuerpo del ratón.
7. Identificar y disecar la arteria femoral, la vena y el nervio. Separar las tres estructuras utilizando fórceps y micro-tijeras.
8. Una vez se diseca el pedículo vascular dividir los vasos a nivel del ligamento inguinal usando micro tijeras.
9. A continuación, continuar dividiéndose los individuales ventral (gracilis y los músculos del muslo medial) y grupos de músculos dorsales ²⁰ proximal a la altura de la mitad del muslo para separar el injerto del animal donante con unas tijeras.
10. Seccionar el fémur y cortar a la mitad de la diáfisis femoral con unas tijeras.
11. La eutanasia a los animales por sobredosis de isoflurano folguido por dislocación cervical. Confirmar el cese de los latidos del corazón y la respiración.
12. Enjuague el miembro con 2 ml heparinizada (30 IE) frío (4 ° C) de solución salina mediante el uso de un 33 G de lavado de la aguja montada en una jeringa (ver Materiales Tabla).
13. Coloque un manguito de poliamida en la vena femoral y la arteria, respectivamente.
14. Envolver injerto en gasa de algodón húmeda, lugar en placa de Petri y se almacena a 4 ° C hasta su inserción.

2. Receptor Operación

1. La eliminación de la extremidad posterior
   1. Administrar analgesia en el punto de tiempo apropiado para cada formulación farmacológica antes de la cirugía. De acuerdo con el cuidado de los animales y el uso del protocolo aprobado el uso de 0,1 mg / kg de peso corporal de buprenorfina SC 1 hora antes de la incisión de la piel.
   2. Sedar al donante con isoflurano aplica a través de una cámara unida a un vaporizador de isoflurano al 4%; mantener sedación y anestesia en 2% a través de un cono de nariz. Realizar la retirada del dedo del pie pizca de reflexión para supervisar el departamentoh de la anestesia antes de la iniciación del procedimiento.
   3. Utilice la pomada veterinaria en los ojos del ratón para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
   4. Afeitar el área quirúrgica, en particular, la extremidad posterior y la ingle y de preparación con 10% de povidona - yodo.
   5. Hacer incisión en la piel de la ingle con tijeras proximalmente a la zona de la mitad del muslo y conectar circunferencialmente la incisión para demarcar la extremidad posterior del resto del cuerpo del ratón.
   6. Identificar y disecar la arteria femoral, la vena y el nervio y separar las tres estructuras utilizando fórceps y micro-tijeras.
   7. Una vez se diseca el pedículo vascular, sujetar los vasos femorales en el nivel del ligamento inguinal.
   8. Cortar los vasos distal a nivel de la arteria epigástrica superficial.
   9. A continuación, continuar dividiéndose los individuales ventral (gracilis y los músculos del muslo medial) y grupos de músculos dorsales ²⁰ proximal a la altura de la mitad del muslo para separar el li trasera nativamb de los animales receptores con unas tijeras.
   10. Seccionar el fémur en el medio del eje femoral usando tijeras.
   11. Cauterizar los músculos del muslo previamente cortados transversalmente para prevenir el sangrado del sitio de la disección y por lo tanto la pérdida de sangre del receptor.
2. Implantación
   1. Minimizar la pérdida de fluido mediante la irrigación del campo operatorio con solución salina caliente (37 ° C) y la inyección de 0,3 ml de solución salina caliente antes y después de la operación.
   2. Coloque el injerto de una manera que refleja la posición anatómica precisa de la extremidad posterior nativa alineando el hueso del fémur del receptor y el injerto y la conexión mediante una aguja espinal 20 G como una varilla intramedular.
   3. Coaptar los grupos de músculos dorsales y ventrales utilizando material de sutura absorbible (6-0 Polysorb).
   4. Conectar los vasos femorales utilizando la técnica de manguito no de sutura; en detalle, tire de la parte receptora de la embarcación durante los puños montados previamente en el recipiente extremos de los Graft. Utilice una sutura de nylon 10-0 y realizar un empate circunferencial para fijar el buque receptor en el manguito.
   5. A continuación liberar las abrazaderas. En esta etapa verificar visualmente la rotación del manguito y un posicionamiento óptimo para evitar errores de rotación y el retorcimiento de los vasos.
   6. Realice una hemostasia meticulosa usando cauterio electro con un enfoque particular en la interfase con el donante receptor muscular y los extremos de los huesos.
   7. Cierre la piel con suturas de nylon no absorbibles (6-0 Ethilon).
   8. Establecer las condiciones normotérmicas permitiendo que el animal se recupere en su jaula bajo una lámpara de calentamiento. Continuar el seguimiento regular durante al menos 4 horas antes de devolverlo a la instalación de la vivienda.
   9. Proporcionar analgesia postoperatoria con buprenorfina a una dosis de 0,1 mg / kg SC cada 6-8 horas durante 3 días.

Resultados

Realización de alotrasplante compuesto vascularizado en un modelo de ratón usando una técnica no sutura del manguito permite lograr una excelente y de larga supervivencia del injerto plazo y animal como se muestra en la Figura 1. Además, se representa un método fiable de obtener resultados reproducibles de rechazo gradual aloinjerto en compuesto vascularizado alotrasplante como se documenta por las imágenes que se muestran en la Figura <...

Discusión

Vascularizado compuesto alotrasplante, tales como las extremidades superiores y el trasplante de cara para la reconstrucción de defectos de tejidos devastadores, se ha desarrollado como una opción válida de tratamiento para los pacientes que no modificables a procesos de reconstrucción convencionales. Los avances técnicos en el campo de la microcirugía reconstructiva, así como una vasta experiencia con potente inmunosupresor y terapias inmunomoduladoras en el trasplante de órganos sólidos, ahora permite la supervivencia...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sutura, 6-0 Nylon	MWI	31849
Sutura, 6-0 Polysorb	MWI	72667
Sutura, 10-0 Nylon	Aero Surgical	TK-107038
Tubo de poliimida, tamaño 25	Vention Medical	141-0023
Tubo de poliimida, tamaño 27	Vention Medical	141-0015
Pinzas microvasculares (individuales)	Synovis	00396
Pinzas Microvasculares (Dobles)	Synovis	00414
Microtijeras	Synovis	SAS-18
Micropinzas	Synovis	FRS-15 RM-8
Microdilatadores	Synovis	FRS-15 RM-8D.1
Micro-Needledriver	Synovis	C-14
Aplicador de micro-abrazadera	Synovis	CAF-4
Aguja de microlavado	Hamilton		10 mm, 30 grados, 33 g
Solución de timbres lactatos	Fisher Scientific	NC9968051
Buprenorfina			Número DEA requerido; Se obtiene de la farmacia hospitalaria.
Enrofloxacina; Baytril	Bayer Health Care	186599
Heparina			Obtenida de farmacia hospitalaria