En este estudio se demuestra un protocolo de video paso a paso de la resección apical. La resección apical es un abordaje quirúrgico recientemente destacado en la investigación de la regeneración cardíaca en mamíferos. Este estudio puede promover la aplicación de la resección apical como metodología estándar en la investigación del mecanismo subyacente a la regeneración del corazón.
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Artículo de método
Modelo apical Resección ratón para el Estudio de la regeneración del corazón de mamíferos Temprana
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Resumen
Resumen
La enfermedad cardiovascular afecta a todo el mundo debido a los cambios de estilo de vida intensivos. La regeneración del corazón representa una gran promesa para la reparación y la restauración de los cardiomiocitos perdidos debido a lesiones y enfermedades. En contraste con la regeneración cardiaca robusta de ciertos vertebrados inferiores, corazones de mamíferos adultos típicamente muestran una capacidad mínima para la regeneración del corazón y reparación. Sin embargo, estudios recientes han suscitado considerable interés científico con el hallazgo de que, entre el día postnatal 1 al 7 (P1 a P7), el corazón neonatal de ratón retiene potencial regenerativo significativa después de la resección apical (es decir, la amputación quirúrgica y la exposición del ápice del ventrículo izquierdo). Una gran controversia sobre este hallazgo podría ser debido a los diversos procedimientos relacionados con la cirugía utilizados en los esfuerzos para replicar o ampliar sobre este importante hallazgo. Estas instrucciones presentan dinámicamente los materiales y la metodología para la resección apical en un modelo de ratón. Las medidas más destacadas de este Surviva roedoresl cirugía involucra anestesia hipotermia, toracotomía, la amputación quirúrgica del ápex del ventrículo del corazón, y la sutura y la recuperación de los ratones. El método descrito también podría ampliar la aplicación del modelo de ratón de la resección apical para la investigación cardiovascular.
Introducción
La prolongación de la vida humana conduce a diversas enfermedades relacionadas con el envejecimiento y el estilo de vida, incluida la insuficiencia cardíaca, una de las principales causas de mortalidad. Sin embargo, sin el reemplazo de las células del músculo cardíaco perdidas o disfuncionales, las terapias actuales solo pueden mejorar transitoriamente la función cardíaca1, 2. Por lo tanto, es necesario descubrir y desarrollar estrategias innovadoras para la regeneración y reparación cardíaca. El corazón de los mamíferos adultos tiene un potencial regenerativo limitado. Los estudios de vertebrados inferiores, como los anfibios urodelos y los peces teleósteos, han proporcionado información sin precedentes sobre los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la regeneración del corazón3, 4. Recientemente, ha surgido un modelo de ratón neonatal de regeneración cardíaca que podría permitir la identificación y caracterización de eventos fisiopatológicos más conservados evolutivamente necesarios para la regeneración del corazón humano5.
La resección apical se refiere a la extirpación quirúrgica del ápex ventricular izquierdo. Este procedimiento está restringido a ratones de 1 a 7 días de edad (P1 a P7) debido a su alta letalidad en ratones mayores6. Se espera que el proceso de regeneración cardíaca en ratones neonatos después de la resección apical sea el siguiente: (I) formación rápida y efectiva de un hematoma para sellar el ápex y evitar la exanguinación; (II) regeneración de cardiomiocitos y restauración de la función sistólica5, 7. Trabajos recientes han estimulado el debate sobre la importancia y la eficiencia de este modelo8-11. Por lo tanto, es importante presentar la resección apical de manera clara y detallada. Con este fin, este protocolo describe de manera vívida y específica un video de cómo hice una resección apical basada en un protocolo anterior6.
La comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración cardíaca es importante para el tratamiento de la enfermedad cardíaca caracterizada por pérdida y/o lesión de cardiomiocitos, como la insuficiencia cardíaca1, 2. Dado el progreso actual y prometedor de la resección apical en la investigación de la regeneración cardíaca, este estudio podría promover el uso de esta técnica y sus usos en la investigación de la regeneración cardíaca.
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Protocolo
Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Programa de Uso y Cuidado de Animales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), con número de protocolo H0083R3. El NHLBI IACUC aprobó el protocolo sin analgésicos.
1. La hipotermia Anestesia en ratones recién nacidos
- Esterilizar esponjas y equipo quirúrgico en un autoclave antes de la cirugía. Prepare todos los materiales quirúrgicos y cambiar en un esterilizador de cuentas en caliente 15-20 minutos de antelación para llegar a 240 ° C a 270 ° C.
- Transferir todas C57BL / 6 cachorros (edad P1) de su madre que amamanta a una jaula del ratón limpia con ropa de cama fresca y materiales de anidación. Una vez que los cachorros se toman en una sala de cirugía, realizar la cirugía apical rápidamente para reducir al mínimo el tiempo que pasan separados de la madre y para reducir el riesgo de canibalización materna.
- Ponga las esponjas en una cama de hielo y luego se coloca una cría en la esponja para ~ 3 min para lograr la anestesia hipotermia. Confirmar la anestesia mediante la observación de apnea y acinesia y pellizcando un pie trasero. Compruebe el estado de los neonatos con frecuencia porque muy poco tiempo no hará que el akinetic crías y apnea, y una duración excesiva de la anestesia puede disminuir la tasa de supervivencia 12.
2. La toracotomía
- Traslado al cachorro del lecho de hielo en un área de mesa quirúrgica y utilizar la cinta para inmovilizar su brazos, las piernas y la cola en posición supina.
- Desinfectar el pecho usando betadine y suavemente limpie con una almohadilla con alcohol al 70%.
- Hacer una incisión en la piel transversal a lo largo de la zona sucesivamente intercostal de la cavidad torácica usando un Vannas resorte de tijera, y luego romos diseccionar los músculos intercostales adelante para facilitar el acceso al corazón.
NOTA: Las tasas de supervivencia mejoran cuando la pérdida de sangre se reduce al mínimo durante el proceso quirúrgico.
3. La amputación quirúrgica del ventrículo del corazón Apex
- A mano, aplicar una suave presión sobre el abdomen para exteriorizar elápice del corazón. Absorber la sangre alrededor de la zona quirúrgica con bastoncillos de algodón estériles para la visualización clara. Para los recién nacidos de control con operación simulada, vaya directamente al paso 4 (de sutura y la recuperación de los ratones).
- Bajo una lámpara de aumento y el uso de iridectomía tijeras, realice suavemente resección fragmentaria del ventrículo izquierdo (VI) hasta que la cámara LV está expuesto. Tenga cuidado para minimizar las porciones resecados del LV. Aproximadamente el 15% de la resección es necesaria para lograr una exposición óptima de la cámara LV.
- Asegúrese de que el corazón vuelve a la cavidad del pecho una vez que se expone la cámara de LV.
4. Sutura y Recuperación de ratones
- Suturar las costillas y músculos juntos para sellar la cavidad torácica mediante suturas Proline 6-0 estériles y cierre con cuidado el lugar de la incisión de la piel con pegamento de la piel.
- Calentar el recién nacido bajo una lámpara de calor para ~ 3 min de recuperación, y luego limpiar la sangre y los restos de pegamento utilizando una almohadilla con alcohol 70% antre reintroducir a sus compañeros de camada. Trata de completar todo el procedimiento quirúrgico dentro de los 10 minutos debido a que minimiza el tiempo separado de la madre mejora la supervivencia de las crías después de la resección apical.
- Después de cada cirugía, colocar las herramientas quirúrgicas en contacto con los talones del esterilizador de cuentas caliente durante aproximadamente 20 segundos para la esterilización completa. Permita que las herramientas quirúrgicas se enfríen a temperatura ambiente antes de cada cirugía.
- Después de completar cirugías para todos los cachorros en una camada, mezclar los cachorros con ropa de cama y de los excrementos de la madre antes de devolverlos al nido de la madre.
NOTA: Por lo general, ICR / CD-1 ratones son madres mejor acogida que C57BL / 6, pero incluso entre las madres lactantes de los mismos antecedentes genéticos, los instintos que fomentan varían. Si el cambio de una madre lactante es necesario reducir la mortalidad por canibalización materna, retire los cachorros P0 a una madre lactante y luego realizar la resección apical en P1. Sólo realizar ya sea la operación simulada o la r apicalesection en una camada de cachorros, porque farsa mezcla y cachorros quirúrgicos podrían disminuir las tasas de supervivencia del grupo quirúrgico de las crías 6.
Análisis 5. Post-Quirúrgica
- Un día después de la cirugía, el seguimiento a los cachorros, asegúrese de que no hay diferencia entre la farsa y grupos quirúrgicos, y contar el número de crías para medir la tasa de supervivencia. Si las cirugías se realizan correctamente, las tasas de supervivencia deben ser similares y mayor que 60% tanto en los grupos sham y quirúrgicos.
- Aislamiento del corazón y la fijación.
- La eutanasia a los cachorros en los días 1 y 2 después de la cirugía a través de la decapitación y el día 21 después de la cirugía por el CO2 con la garantía de fallecimiento por dislocación cervical, luego limpiar el pecho usando una preparación de alcohol al 70%.
- Incisión en la piel en la línea media y el músculo del pecho y luego abrir el pecho.
- Escindir la totalidad de los corazones de la cavidad torácica y fijar todo el corazón de cada muestra en 5 ml de 4% de paraformaldehído O / N a TA.
- En el día siguiente, transferir las muestras a 70% de etanol. Las muestras pueden conservarse hasta una semana antes de la inclusión en parafina.
- Slice secciones de parafina de 5 micras de espesor a través de todo el ventrículo y realizar hematoxilina estándar y eosina (H & E) y la tinción de tricrómico de Masson para examinar la respuesta regenerativa 5, 7. En concreto, H & E tinción se utiliza para examinar el reemplazo del músculo y se utiliza tricrómico de Masson para examinar las respuestas fibróticas 5.
- Seleccione el área de interés y establecer al menos tres focos por muestra manualmente utilizando un escáner de diapositivas. Image y analizar las diapositivas de tinción a 40 × magnificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante con los parámetros por defecto.
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Resultados
Crías de ratón fueron sacrificados 1, 2, y 21 días después de la resección apical, y sus corazones se recogieron para H & E y tricrómico de Masson. De color azul en tricrómico de Masson indica la deposición de matriz extracelular epicárdica 5. Con la resección apical éxito, un coágulo de sangre se forma de manera efectiva para sellar el LV One día post-resección apical, como se muestra en la Figura 1A. Se observa una resorción gradual del coágulo de sangre y principios de fibrosis cardiac...
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Discusión
La regeneración cardíaca muestra potencial para el tratamiento y la prevención de la insuficiencia cardíaca1, 2. Los modelos animales son indispensables y juegan un papel fundamental en la comprensión de cómo ocurre la regeneración cardíaca3-6. Muchos anfibios y peces regeneran el tejido cardíaco en respuesta a una lesión, lo que proporciona información sobre nuestra comprensión de la enfermedad cardiovascular humana13, 14. En términos de evolución, sin embargo, la fisiopatología debería ...
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Divulgaciones
Tasas de publicación para este artículo fueron patrocinados por un don de Ciencia Herramientas Bellas Dr. Jian Hou.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los Dres. James Hawkins, Zu-Xi Yu y Xuan Qu del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI) por su ayuda con la cirugía del ratón y la preparación y tinción de secciones de parafina. Los autores agradecen a la Junta Editorial del NIH becarios por su asistencia editorial.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Portaagujas Olsen-Hegar con tijeras, 1,5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Tijeras de resorte Vannas - 2 mm Cutting Edge Science | Tools | 15000-03 | Tijeras de iridectomía Esterilizador |
| perlas calientes Fine | Science Tools | 18000-45 | |
| Pinzas de iris, rectas, dentadas | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Pinzas de iris, curvado, dentado | Herramientas de ciencia fina | 11065-07 | |
| Tijeras de karité - Curvas/romas-romas/12cm | Herramientas de ciencia fina | 14105-12 | |
| pinzas de atado de sutura con mango redondo, rectas | Herramientas de ciencia fina | 18025-12 | |
| Tijeras de resorte Vannas con mango redondo Herramientas de | ciencia fina | 15400-12 | |
| Hemostático fino | Herramientas | de ciencia fina13007-12 | |
| Lámpara de aumento | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Lámpara calefactora | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Suturas Prolene | Ethicon | 8889H | |
| Pegamento para piel-Vetbond Adhesivo para tejidos | 3M | 1469 | |
| Aplicadores estériles con punta de algodón | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Almohadilla de preparación con alcohol | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/BOX, Saturada con 70% de alcohol isopropílico |
| Curity All Purpose Sponges | Covidien | 9024 | No tejida 4 CAPAS, 4"x4" (10.2cm× 10,2 cm) |
| Hoja protectora de sobremesa | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18" x 19,5" (45,72 cm x 49,53 cm) x 50 |
| Cloruro de sodio al 0,9%, 250 ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Hisopos de solución Betadine Productos | Purdue L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoclave | TOMY Digital Biology | SX-700 | ESTERILIZADOR DE VAPOR DE ALTA PRESIÓN |
| Escáner de portaobjetos | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
