Aquí, presentamos el protocolo de neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser en ratones, un modelo experimental que recrea las características vasculares de la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) neovascular. Una vez dominado, puede inducir de forma fiable y eficaz la CNV como sistema modelo para probar diversas medidas experimentales.
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Artículo de método
Un modelo de ratón para inducida por láser neovascularización coroidea
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Resumen
Resumen
El modelo de neovascularización coroidea (CNV) inducida por láser en ratón ha sido un modelo crucial para la investigación de la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) neovascular. Al administrar una lesión selectiva con láser en el EPR y la membrana de Bruch, el procedimiento induce la angiogénesis, modelando la patología distintiva observada en la DMAE neovascular.
Desarrollado por primera vez en primates no humanos, el modelo CNV inducido por láser ha llegado a implementarse en muchas otras especies, la más reciente de las cuales es el ratón. Los experimentos con ratones son ventajosamente más rentables, los experimentos se pueden ejecutar en una línea de tiempo mucho más rápida y permiten el uso de varios modelos transgénicos. Sin embargo, el tamaño en miniatura del ojo del ratón plantea un desafío particular al realizar el procedimiento. La manipulación del ojo para visualizar la retina requiere la práctica de habilidades de destreza fina, así como la coordinación simultánea mano-ojo-pie para operar el láser. Sin embargo, una vez dominado, el modelo se puede aplicar para estudiar muchos aspectos de la DMAE neovascular, como los mecanismos moleculares, el efecto de las manipulaciones genéticas y los efectos del tratamiento farmacológico.
El modelo de CNV inducido por láser, aunque útil, no es un modelo perfecto de la enfermedad. Por lo demás, el ojo del ratón de tipo salvaje está sano, y el entorno corio-retiniano no imita los cambios patológicos en la DMAE humana. Además, la angiogénesis inducida por lesiones no refleja las mismas vías que la angiogénesis que ocurre en un estado de enfermedad crónica y relacionada con la edad como en la DMAE.
A pesar de sus deficiencias, el modelo de CNV inducido por láser es uno de los mejores métodos disponibles actualmente para estudiar la patología debilitante de la DMAE neovascular. Su implementación ha llevado a una comprensión más profunda de la patogénesis de la DMAE, además de contribuir al desarrollo de muchas de las terapias disponibles actualmente para la DMAE.
Introducción
Edad relacionados con la degeneración macular (AMD) es una de las principales causas de ceguera en personas mayores de 50 1.3. AMD se puede clasificar en dos formas: atrófica ("secar") y AMD neovascular ("húmeda") de AMD. El primero se caracteriza por la atrofia geográfica del epitelio pigmentario de la retina (RPE), coriocapilar, y los fotorreceptores, mientras que el último se caracteriza por la invasión de vasos anormales de la coroides en las capas externas de la retina causando fugas, hemorragia y fibrosis, y en última instancia que conduce a la ceguera 1,2. De las dos formas, AMD neovascular da cuenta de la mayoría de la pérdida de visión ....
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Protocolo
Todos los animales son tratados de acuerdo con la Guía del Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 2013 Edition, la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y aprobada por el Animal Institucional Cuidado y el empleo Comisión de la Universidad Northwestern.
Nota: El siguiente procedimiento se puede realizar en su totalidad con un operador; sin embargo, se llevó a cabo mucho más eficiente con dos operadores con las tareas se dividen en consecuencia.
1. Prepare la estación láser y Pre-láser
- Coloque el láser y l....
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Resultados
La cuantificación de las lesiones CNV se puede realizar mediante el análisis de coroides-plana montada utilizando la tinción de inmunofluorescencia para etiquetar los vasos de la CNV. Los dos métodos utilizados con mayor frecuencia de la preparación del tejido son etiquetado FITC-dextrano, hecho a través de la perfusión inmediatamente antes del sacrificio de los animales, o post-mortem inmuno-tinción con un marcador de células endoteliales. Ambos métodos se han descrito anteriormente en detalle 13,14,21;
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Discusión
Existen múltiples factores que pueden afectar la entrega de láser y la consiguiente desarrollo de la lesión NVC tras éxito láser inducción. Estos factores deben ser controlados por y estandarizados con el fin de tener los resultados más confiables. El más pertinente de estos factores son la selección del ratón (genotipo, edad y sexo), la selección de anestésico, y la configuración de láser.
El modelo específico de ratón utilizada puede tener un efecto significativo en el curso del desarrollo.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Jonathan Chou, MD por su ayuda en la preparación y edición del manuscrito final y a Wenzhong Liu por los datos de OCT. También nos gustaría agradecer el apoyo de la Beca de Investigación de la Sociedad de la Mácula (AAF), el apoyo de una subvención sin restricciones a la Universidad Northwestern de Investigación para Prevenir la Ceguera, Inc., Nueva York, NY, EE. UU., y el apoyo de NIH-EY019951.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Láser oftálmico de argón de 532 nm (verde) | IRIDEX | GLx | cualquier láser de argón oftálmico de 532 nm (verde) se puede utilizar |
| hendidura | Carl Zeiss | 30SL-M | cualquier lámpara de hendidura puede utilizarse siempre que sea compatible con el láser |
| tribromoetanol | Sigma | T48402-25G | utilizado para fabricar anestésico |
| alcohol terc-amílico | Sigma | 152463-1L | utilizado para hacer anestésico |
| viales de vidrio ámbar + septos | Wheaton | WH-223696 | almacenamiento de tribromoetanol |
| VWR | 82003-820 | varios | |
| 1% Tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | dilatación pupilar |
| 0,5% Clorhidrato de tetracaína | Alcon | 0065-0741-12 | anestesia tópica |
| lágrimas artificiales | Alcon | 58768-788-25 bomba de terapia de | hidratación |
| (para calentar animales) | Kent Scientific | HTP-1500 | utilizado para mantener la temperatura corporal de los animales |
| almohadilla de calentamiento | Kent Scientific | TPZ-0510EA mantiene la | temperatura corporal del animal |
| 30 G agujas de insulina | BD | 328418 | inyección de anestesia |
| Báscula de pesaje americana | AWS-1KG-BLK | Pesaje de ratón | |
| cubreobjetos (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 aplanar la córnea para visualizar la retina del ratón | |
| xilacina | obtenida de la institución | anestesia | la institución |
| ketamina | obtenida | de la | la anestesia |
| Volocity | PerkinElmer | utilizada para la reconstrucción volumétrica | |
| ImageJ | Institutos Nacionales de Salud | utilizados para el análisis de imágenes |
Referencias
- Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L. Age related macular degeneration. Surv Ophthalmol. 32, 375-413 (1988).
- Congdon, N., et al. Causes and Prevalence of Visual Impairment Among Adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122, 477-485 (2004).
- Ja....
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Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Modelo de ratón de DMAepitelio pigmentario retinallesión de la membrana de Bruchanálisis de microscopía confocaltomografía de coherencia ópticamarcaje con dextrano fluorescentetinción de marcadores de células endotelialescuantificación de la coroides en montaje planoprocedimiento de láser de lámpara de hendidura
