Disolución dinámica de polarización nuclear Instrumentación para el tiempo real enzimática reacción de la tasa mediciones realizadas por RMN

Resumen

La mejora de la sensibilidad proporcionada por la polarización nuclear dinámica de disolución (DNP) permite seguir los procesos metabólicos en tiempo real mediante RMN y RMN. Se discuten las características y rendimientos de una configuración DNP de disolución dedicada diseñada para el estudio de reacciones enzimáticas.

Resumen

La principal limitación de las investigaciones basados ​​en RMN es baja sensibilidad. Esto incita para largos tiempos de adquisición, evitando así que las mediciones de RMN en tiempo real de las transformaciones metabólicas. Hiperpolarización mediante la disolución DNP elude parte de la sensibilidad emite gracias a la gran magnetización nuclear fuera de equilibrio resultante de la transferencia de espín polarización de electrones al núcleo. La señal de RMN de alta obtenida puede ser utilizada para controlar las reacciones químicas en tiempo real. La desventaja de hiperpolarizado NMR reside en la ventana de tiempo limitado disponible para la adquisición de señales, que es generalmente del orden de la constante de tiempo de relajación longitudinal de espín nuclear, T _1, o, en casos favorables, en el orden de la constante de tiempo de relajación asociado con el singlete de estado de los núcleos acoplados, T _LLS. La captación celular de moléculas endógenas y las tasas metabólicas puede proporcionar información esencial sobre el desarrollo tumoral y la respuesta al fármaco. Nurosos estudios de RMN hiperpolarizados anteriores han demostrado la relevancia de piruvato como sustrato metabólico para monitorizar la actividad enzimática in vivo. Este trabajo proporciona una descripción detallada de la configuración experimental y métodos necesarios para el estudio de las reacciones enzimáticas, en particular, la tasa de conversión de piruvato a lactato en presencia de lactato deshidrogenasa (LDH), por RMN hiperpolarizado.

Introducción

La polarización nuclear dinámica ^(DNP), 1,2 una técnica diseñada para mejorar la polarización de espín nuclear, es decir, el desequilibrio entre "arriba" y las poblaciones de espín "abajo" (P = [N _↑ - N _↓] / [N + N _{↑ ↓]),} fue presentado por primera vez en la década de 1950. Espines nucleares tales como ¹³ C pueden ser polarizados hasta P = 10 ^-1 en condiciones favorables, típicamente a una temperatura del orden de 1 K y en un campo magnético de 3,357 T. ^3,4 Un gran avance para aplicaciones biológicas se produjo en el p....

Protocolo

NOTA: Todos los análisis de los datos se realizó utilizando el software comercial.

1. Preparar la solución polarizante

1. Preparar 2 ml de una piruvato de sodio 1,12 M ¹³ C marcado con (Na ⁺ [CH ₃ -CO- ¹³ COO] ^-, sustrato) solución dopa con 33 mM de radical TEMPOL (4-hidroxi-2,2,6,6 tetrametil-1-oxilo, agente polarizador) ^{4 en} 2: 1 D _{2 O} / d ₆ etanol ^durante 13 observaciones C. PRECAUCIÓN: Precauciones de manipulación deben ser tomadas debido a la naturaleza inflamable de _d6 etanol.
2. Compruebe que la concentración de radicales es ópti....

Resultados

ganancias de señal de RMN utilizando DNP disolución
El efecto DNP consiste en la transferencia de la alta polarización de espines de los electrones no apareados, típicamente de moléculas de radicales estables, a los núcleos de RMN-activos, bajo irradiación con microondas de la muestra. Los radicales libres más usadas son de TAM (OXO63) y TEMPOL. ⁴ procedimientos de polarización utilizando TEMPOL pueden ser optimizados por "polarización cruzada '. ²⁵

Discusión

Los puntos críticos de la disolución experimento DNP RMN son: (i) el nivel de polarización conseguido por el sustrato, que determina la concentración de producto más baja necesaria para los experimentos, así como el número de adquisiciones de señal que se pueden realizar y (ii) los tiempos de vida de magnetización, en comparación con la duración de la transferencia entre la polarización y los sitios de detección y de la tasa de transformación de sustrato. El sistema de inyección de la configuración de DNP disolución des.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Polarizador DNP	Vanderklink s.a.r.l (Suiza)		Criostato y equipos electrónicos para la polarización de muestras
Componentes del sistema de vacío	Edwards vacuum (Francia)	Varios	- configuración de bombeo turbomolecular - configuración de bombeo de membrana - sistema de bombeo de raíces de alta capacidad - accesorios y componentes de vacío
DNP 3.35T Magnet	Bruker (Francia)
Espectrómetro de RMN de 500 MHz	Bruker (Francia)
Origin 8.0	OriginLab (US)		Software de análisis
de datosChemicals
SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C	Sigma Aldrich (Francia)	490709
ETANOL-D6, ANHIDRO, 99.5 ATOM % D	Sigma Aldrich (Francia)	186414
4-Hydroxy-TEMPO 97%	Sigma Aldrich (Francia)	176141
Óxido de deuterio	Sigma Aldrich (Francia)	151882
nicotinamida reducida dinucleótido de adenina (NADH)	Sigma Aldrich (Francia)
ácido etileno-diaminotetraacético (EDTA)	Sigma Aldrich (Francia)
ditiotreitol (DTT)	Sigma Aldrich (Francia)
tampón de fosfato, pH =  7.0	Sigma Aldrich (Francia)
Enzima LDH en	Sigma Aldrich (Francia)	L-2500
albúmina sérica bovina, BSA	Sigma Aldrich (Francia)