Caracterización del tejido después de un nuevo método de desagregación para la piel micro-injertos Generación

Summary

El protocolo describe un nuevo método para desagregar los tejidos humanos y para crear autólogas micro-injertos que, combinado con esponjas de colágeno, dan lugar a complejos biológicos humanos listos para su uso en el tratamiento de lesiones de la piel. Además, este sistema preserva la viabilidad celular de micro-injertos en diferentes momentos después de la disgregación mecánica.

Abstract

Varios de los nuevos métodos han sido desarrollados en el campo de la biotecnología para obtener suspensiones celulares autólogas durante la cirugía, con el fin de proporcionar uno tratamientos paso para lesiones de la piel agudas y crónicas. Por otra parte, el tratamiento de las heridas agudas crónicas, sino también como resultado de un traumatismo, diabetes, infecciones y otras causas, sigue siendo un reto. En este estudio se describe un nuevo método para crear autólogas micro-injertos de tejido cutáneo de un solo paciente y su aplicación clínica. Por otra parte, también se llevó a cabo la caracterización biológica in vitro de tejido cutáneo derivadas de la piel, la dermis de-epidermized (DED) y la dermis de múltiples órganos y / o donantes de múltiples tejidos. Todos los tejidos se desagregan por este nuevo protocolo, que nos permite obtener micro-injertos viables. En particular, se informó de que este innovador protocolo es capaz de crear bio-complejos compuestos por autólogas micro-injertos y esponjas de colágeno lista para ser aplicada sobre lesiones en la piel. el CliniTambién se informó de aplicación cal de autólogas bio-complejos en una lesión de la pierna, mostrando una mejora tanto de proceso de re-epitalization y suavidad de la lesión. Además, nuestro modelo in vitro mostraron que la viabilidad celular después de la disgregación mecánica con este sistema se mantiene en el tiempo para un máximo de siete (7) días de cultivo. También se observó, por citometría de flujo análisis, que el grupo de células obtenidas de desagregación se compone de varios tipos de células, incluyendo células madre mesenquimales, que ejercen un papel clave en los procesos de regeneración y reparación de tejidos, por su alto potencial de regeneración. Por último, hemos demostrado in vitro que este procedimiento mantiene la esterilidad del micro-injertos cuando se cultiva en placas de agar. En resumen, se concluye que este nuevo enfoque regenerativo puede ser una herramienta prometedora para los médicos para obtener en un solo paso viable, estéril y listo para usar micro-injertos que se pueden aplicar solos o en combinación con más Scaffo biológica comúnLDS.

Introduction

En los últimos años, varios métodos nuevos han sido desarrollados en el campo de la biotecnología para obtener suspensiones celulares autólogas durante la cirugía con el fin de proporcionar tratamientos de un solo paso para lesiones de la piel agudas y crónicas. Por otra parte, el tratamiento de las heridas agudas pero sobre todo crónicas que resultan de un traumatismo, diabetes, infecciones y otras causas, sigue siendo un reto. Hay una creciente evidencia de que las heridas crónicas se han convertido en un grave problema de salud mundial, provocando una enorme carga financiera para los sistemas sanitarios en todo el mundo ^1.

Para aumentar la tasa de éxito en el tratamiento de lesiones de la piel, la ausencia de manipulación extensa (incluyendo la mejora celular) y el mantenimiento de condiciones estériles son esenciales, con el fin de crear una suspensión celular que se puede aplicar inmediatamente sobre el área dañada de la los pacientes, evitando de ese modo un procesamiento más largo en salas limpias, como fábricas celulares. StArting de pequeñas biopsias de piel, molienda, centrifugación y otros métodos de separación (por ejemplo, enzimática o mecánica), se utilizan con frecuencia para obtener una suspensión celular, que pueden ser cultivadas en un medio de crecimiento. Todos estos métodos generalmente requieren mucho tiempo de ejecución, haciendo hincapié en las estructuras de las células, y que conduce a una reducción de la viabilidad celular. Otro aspecto importante es el de obtener una suspensión celular autólogo listo para ser utilizado por los médicos, por ejemplo, para reparar las áreas dañadas. Por otra parte, es bien sabido que los injertos de tejidos autólogos sobreviven los procedimientos de transferencia de sobrevivir el tiempo en el sitio receptor por los principios de la inducción y conducción ^{2, 3.} El injerto de tejido ideal debe estar fácilmente disponible y tienen una baja antigenicidad y donantes morbilidad del sitio ^4.

Sobre la base de estas evidencias, el primer objetivo de este estudio fue la creación de bio-complejos autólogos adecuados paraaplicación clínica en la reparación de tejidos. Para este fin, se describe un nuevo método para obtener autólogas micro-injertos a partir de los tejidos cutáneos que fueron desglosados ​​por este protocolo. Presentación de un caso en el presente documento también se describe como una aplicación clínica de micro-injertos autólogos obtenidos mediante este protocolo en combinación con esponjas de colágeno. Este enfoque ya se ha informado que ser eficiente en la disgregación mecánica de los tejidos humanos ⁵ y se ha utilizado clínicamente para injertos y regeneración de los tejidos dérmicos ^6,7, así como para terapias regenerativas de los tejidos conectivos en la cirugía oral y maxilofacial ^8-10 .

Además, el segundo objetivo de este estudio fue la caracterización biológica de los tejidos cutáneos después de su desagregación por este protocolo. Para este fin, las diferentes muestras de tejido cutáneo homólogas derivan de la zona del tronco de diferentes multiorgánicay / o donantes múltiples tejidos fueron procesadas siguiendo las normas nacionales sobre la recolección, procesamiento y distribución de tejidos para trasplante (CNT 2013) en la piel de Emilia Romagna regional del Banco.

PRESENTACIÓN DEL CASO:

Una paciente de 35 años de edad, que muestra un trauma complejo debido a accidente de coche fue ingresado en la Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital Ancona. El paciente presentó una infección en la pierna debido a una herida abierta y una fractura estabilizada con fijación externa. Dos desbridamiento radical y se llevaron a cabo cuando la herida se limpia después de la terapia de presión negativa (VAC) y el periostio parecían sanos, se les aplicó el protocolo después de dos meses de recuperación. Después de la disgregación con este sistema, se utilizaron los micro-injertos obtenidos para crear bio-complejos con una esponja de colágeno que se implanta posteriormente con el fin de investigar su eficacia en la reparación de la lesión.

Protocol

Declaración de la ética: desde la aplicación clínica del protocolo requiere el uso de tejido autólogo cutánea del paciente, su caracterización in vitro se realizó antes de su uso clínico en el tejido cutáneo homóloga en el Bank Emilia Romagna Regional de la piel siguiendo las directrices de las normas nacionales sobre la recolección, procesamiento y distribución de tejidos para trasplante (CNT 2013).

1. Edificio Bio-complejo para la aplicación clínica

NOTA: Este protocolo se basa en el uso clínico de Rigeneracons (disruptores tejido) y la máquina Rigenera (sistema disruptor de tejidos) (Figura 1A). El disruptor de tejidos es un disruptor médica biológica de los tejidos humanos capaces de interrumpir pequeños trozos de tejidos usando una rejilla proporcionada por cuchillas hexagonales y células de filtrado y componentes de matriz extracelular con un punto de corte de alrededor de 50 micras.

1. Recoger skinsamples del paciente a través de un biopsy punzón (Figura 1B) y desagregar la adición de 1 ml de solución salina para cada pieza para obtener autólogas micro-injertos ^6,7,9 (o véase el paso 2.1).
2. Colocar 1 ml de micro-injertos en esponjas de colágeno (Figura 1C) toform bio-complejos a utilizar para la aplicación clínica.
3. Cultura otro 1 ml de micro-injertos en esponjas de colágeno en presencia de 6 ml de medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino a 37 ° C en una atmósfera de _CO2 al 5% humidificada.
4. Después de 3 días de cultivo, fijar los bio-complejos con 0,3% de paraformaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente. Verter la parafina con un dispensador específico directamente sobre la muestra. Obtener rodajas con un micrótomo con un espesor de 5 micras y poner directamente en un vaso-deslizante.
5. Sumergir las rebanadas de parafina de 5 micras en un vaso para análisis histológicos, que contiene 15 - 20 ml de xileno (disponible en el mercado - una mezcla de m-xileno (40 - 65%), p-xileno (20%), o-xileno (20% ) y ETHbenceno il (6-20%) y trazas de tolueno, benceno trimetil, fenol, tiofeno, piridina y sulfuro de hidrógeno) durante 3 min cada uno.
6. Sumergir las rebanadas en la disminución de los grados (100% a 70%) de etanol (100% de etanol durante 1 hora, 95% de etanol durante 1 hr, 80% de etanol durante 1 hora, 70% de etanol durante 1 hr) y agua entonces desionizada para de-paraffinizing y rehidratación de las secciones.
7. Manchar las secciones con 1 - 2 ml de 1 g / L Ematoxylin por 1 - 2 min y posteriormente enjuague con agua para eliminar cualquier excedente Ematoxylin.
8. Tinción de las secciones de 4-5 min con solución alcohólica de eosina Y al 1% de la concentración se mezcla con etanol 70% y se diluyeron en agua.
9. Utilice 1 - 2 ml de eosina Y para cada sección portaobjetos y enjuagar con agua corriente.
10. Sumergir las secciones en el aumento de los grados de etanol (véase el paso 1.6) y finalmente, después de un pasaje en xileno durante 1 hora, cubreobjetos con un montaje basado mediumand observar bajo un microscopio óptico a 100X aumentos (Figura 1D).

2. Recolección, el desglose y análisis in vitro de los tejidos

1. El uso de un dermatoma, tomar tejido independiente de la piel, dermis papilar de-epidermized (DED) o dermis reticular (dermis), respectivamente, de 0,6 mm, 1 mm o 2 mm de espesor de la zona del tronco de 4 diferente de múltiples órganos y / o multi- donantes de tejidos en un intervalo de 40 a 55 años, siguiendo las normas nacionales sobre la recolección, procesamiento y distribución de tejidos para trasplante (CNT de 2013).
   1. Enjuague suavemente todas las muestras en solución de NaCl al 0,9% ponerlos en un plato en un agitador orbital durante 5 min.
   2. Utilizando el punzón de biopsia de 5 mm, crear muestras que son uniformes en diámetro desde el tejido de la piel, Ded y dermis y pesan todas las muestras de tejido antes de la disgregación.
   3. Inserte ocho, tres o cuatro muestras uniformes de tejido de la piel, Ded o Dermis respectivamente, en el disruptor de tejidos, la adición de 1,5 ml de solución salina para la desagregación.
   4. realizar diferentestiempos de disgregación para todas las muestras de tejido como se indica en la Tabla 1.
   5. Utilice un número correspondiente de biopsias obtenidas a partir de muestras de tejido intacto como controles.
   6. Después de desagregación mecánica, aspirar la solución salina que contiene micro-injertos y lugar por separado cada muestra en un solo pocillo de una placa de 12 pocillos. Realice el mismo protocolo para biopsias por punción de control intacto.
   7. Añadir 1 ml de RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y antibióticos para cada muestra.
   8. Evaluar la viabilidad de las células inmediatamente. A cada pocillo que contiene un micro-injerto (obtenido por la desagregación simultánea de ocho, tres o cuatro muestras uniformes de tejido de la piel, Ded o Dermis respectivamente) añadir 1 ml de medio que contenía 0,5 mg / ml de MTT (3- [4,5- dimetiltiazol-2-il] bromuro) solución 2,5 difeniltetrazolio y se incuba durante 3 horas a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO ₂ / aire. Realizar el mismo protocolo para el control intactobiopsias por punción.
   9. Después de la incubación, retirar todo medio que contenía MTT y añadir a cada muestra 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) durante 10 min.
   10. Transferir cada muestra y DMSO en una cubeta y se leyó a densidad óptica (DO) a 570 nm usando un espectrofotómetro. Calcular la viabilidad celular como la relación de la absorbancia a 570 nm y el peso en gramos (gr) de tejido utilizados antes de desagregación. Realice el mismo protocolo para biopsias por punción de control intacto.
2. Después de desagregación mecánica, aspirar la solución salina que contiene micro-injerto procedentes de tejidos de la piel, las muestras Ded y la dermis de un solo donante.
   1. Colocar cada muestra por separado en un solo pocillo de una placa de 12 pocillos o en un frasco de cultivo para el ensayo de viabilidad celular y análisis morfológico respectivamente.
   2. Cultura micro-injertos adición de 1 ml (placa de 12 pocillos) o 5 ml (frasco de cultivo) de RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB y antibióticos a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO ₂ / air durante 24 horas o 7 días.
   3. Evaluar la viabilidad de las células después de 24 horas o 7 días (repita los pasos 2.1.8-2.1.10).
   4. Realizar análisis morfológico evaluar la presencia de suspensión celular por microscopía de luz después de 24 horas y 7 días de cultivo en matraz.
   5. Analizar las muestras de la dermis para la positividad a la mesenquimales y marcadores de células hematopoyéticas, incluyendo antígenos CD146, CD34 y CD45 por FACS análisis ^6.
   6. Bajo semilla campana de flujo laminar cada micro-injerto (obtenido por la desagregación simultánea de ocho, tres o cuatro muestras uniformes de tejido de la piel, Ded o Dermis respectivamente) y un corresponsal pequeño fragmento de cada muestra de tejido no totalmente desagregado (> 50 micras de tamaño después del proceso de desagregación) en la placa de agar Columbia que contiene 5% de sangre de oveja caldo de 100 l.
   7. Incubar la placa a 37 ° C durante tres días y realizar análisis microbiológico en Columbia placa de agar con el fin de evaluar la esterilidad ¹¹.

Results

En este estudio preliminar, el primer objetivo fue investigar la capacidad de las micro-injertos autólogos humanos combinados con un soporte biológico, como el colágeno, para producir bio-complejos listos para usar. Estos bio-complejos fueron implantados en un paciente con una lesión de la pierna causada por un accidente de coche (Figura 2A) y una reepitelización completa asociada con la reparación de tejidos después de 30 días

Discussion

Este estudio preliminar demostró que micro-injertos obtenidos por este protocolo se pueden combinar con esponjas de colágeno, como ya se ha informado en otras aplicaciones clínicas, para optimizar la eficacia de los implantes de micro-injertos ^{9, 10.} En particular, este estudio informó de la capacidad de bio -complexes, constituido por micro-injertos y esponjas de colágeno, el tratamiento adyuvante de la cicatrización de la herida de una lesión de la pierna después de 30 días a partir de la aplicación clínica...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Máquina Rigenera	Onda Cerebral Humana	79210R
Rigeneracons	Onda Cerebral Humana	79450S
MTT	Roche Diagnostic GmbH	11465007001
Medio RPMI	PBI International	733-2292
DMEM medio	PBI International	F 0415
Antibióticos	Biológicos Industrias PBI	03-038-1
Anticuerpos para el análisis de FACS código	eBiosciences	para CD146-P; código 17-0349  para CD34-APC
Columbia agar	BioMerieux Company	43041
Condress®	Abiogen Pharma		utilizada para biocomplejos
DMSO	Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
Solución de NaCl	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Alemania
Xileno	Carlo Erba