Introduction
Lig adskillelse af genomet under celledelingen kræver korrekte interaktioner mellem de replikerede DNA og spindel mikrotubuli. Mikrotubuli fysisk interagerer med kromosomer gennem et ensemble af proteiner, der samler på centromerer kendt som kinetochore 1. Korrekt fordeling af kromosomer kræver, at søster kinetochores er tovejsorienteret, hvor hver søster er forbundet med mikrotubuli oprindelse fra modstående spindel poler. Kinetochore mikrotubuli (kt-MT) vedhæftede filer, der ikke er i tovejsorienteret kropsbygning er hurtigt og effektivt destabiliseret at give mulighed for at etablere biorientation i en proces kendt som fejlretning. En fejlkorrektion assay, der tidligere blev etableret i pattedyrceller 5 kræver samling monopolære spindler ved hjælp af reversible inhibitorer med små molekyler mod EG5 (kinesin-5). Det stof behandling genererer et væld af fejlagtige syntelic vedhæftede filer, hvor both søster kinetochores tillægger den samme spindel pol. En efterfølgende udvaskning af lægemidlet muliggør visualisering af fejlkorrektion proces. Fejlkorrektion assay kan udføres i nærvær af inhibitorer med lille molekyle eller knockdowns at studere bidraget af kandidat-proteiner at rette fejlagtige kt-MT vedhæftede filer.
Evnen til at visualisere fejlkorrektion i levende celler er et kraftfuldt værktøj til yderligere at forstå den molekylære mekanisme er involveret i denne komplekse proces. Men det store antal kromosomer er til stede i de fleste cellelinjer udgør en udfordring i at observere individuelle kt-MT vedhæftede filer. Drosophila S2-celler ville være ideel til anvendelse fejlkorrektion assay, da de indeholder så få som 4 kromosomer 6, men med små molekyler inhibitorer af kinesin 5 såsom S-trityl-L-cystein (STLC) og monastrol 7-9 berører ikke spindel samling eller kinesin-5 motorisk funktion i Drosophila-celler. Vi har derfor slægterTed en Drosophila S2-cellelinie, der udtrykker human kinesin-5 under en inducerbar promotor, der er følsom over for kinesin-5-hæmmere. Denne protokol beskriver, hvordan man Knockdown det endogene Drosophila kinesin-5 homolog, Klp61F, og bruge denne cellelinie i det cellebaserede fejlkorrektion assay.
Protocol
1. transfektion S2-celler
- Fra en tidligere dyrket 25 cm2 kolbe, der tilsættes GFP-a-tubulin-udtrykkende S2-celler 10 til et slutvolumen på 2 ml ved 100% konfluens, og tillade dem at semi-klæbe til bunden af en 35 mm vævskulturskål for ca. 1 time.
- Fjern mediet fra fadet. Transfektion 2 ug af EG5-mCherry konstruere 11 med 1 ml Schneiders medier suppleret med 10% FBS (i det følgende benævnt Schneiders medier) og transfektion reagens, efter fabrikantens protokol. Forsegl skål med Parafilm og inkuber cellerne ved 25 ° C i 16-18 timer.
- Tilsæt 1 ml Schneiders medier. Retur celler til 25 ° C inkubator.
- På dag 3 efter transfektion overføre 500 pi transficerede celler ind i en ny 35 mm vævskulturskål indeholdende 1,5 ml Schneiders medier til en test induktion. Inducere ekspressionen af EG5-mCherry ved tilsætning af CuSO4
- For at gøre Concanavalin A-coatede dækglas, pipette nok volumen af concanavalin En opløsning (0,5 mg / ml opløst i H2O) til pels en syre vaskes dækglas, fjerne den overskydende, og lad dækglasset lufttørre.
- Placer en 22 mm x 22 mm concanavalin A-coatede dækglas i en ren 35 mm vævskulturskål, derefter frø 500 pi 100% konfluens på de inducerede celler på dækglasset og tillade cellerne at adhærere i 1 time ved stuetemperatur.
- At kontrollere, om EG5-mCherry udtryk, samle dækglasset i en rose kammer (eller passende imaging fartøj) med medier til billeddannelse ved RT på en fluorescens mikroskop. Brug egnede lyskilder og filtersæt at visualisere cellerne. For eksempel mikroskopet anvendes i denne undersøgelse har en LED hvid lyskilde og EGFP (FITC / Cy2) og dsRed (TRITC / Cy3) filter terninger. EG5-mCherry lokaliseres til mikrotubuli og er beriget near spindel poler.
- Efter at have sikret, at cellerne udtrykker både EG5-mCherry og GFP-α-tubulin, overføre den resterende del af de transficerede celler, inducerede en 25 cm2 vævskultur-kolbe indeholdende 4 ml Schneiders medier.
- Tilføj Blasticidin S HCI ved en slutkoncentration på 25 ug / ml til kolben af transficerede celler og fortsætte opdeling i nærvær af 25 pg / ml Blasticidin S HCI indtil celledød ophører at være sikker på at kontrollere, om ekspression af EG5-mCherry periodisk. Inkuber cellelinier i 25 ° C inkubator.
BEMÆRK: Procentdelen af celler, der udtrykker EG5-mCherry stiger over tid. - Når celler transficeres stabilt, fortsat delt i fravær af lægemiddel og fryse 12-celler til fremtidig brug.
2. RNA-interferens
- PCR amplificere et ~ 500 bp region Klp61F fra cDNA (LD15641) under anvendelse af primer tilsat T7-promotorsekvensen (sekvens tilvejebragt i Materials List) at væreanvendes som en skabelon for dsRNA syntese.
- Oprettet fire PCR-reaktioner, 50 pi hver indeholdende 100 ng template-DNA, 25 pM af hver primer, passende buffer og polymerase. Indstil PCR-protokol på thermocycler ifølge polymerasens producentens protokol.
- Pool og rene fire PCR-reaktioner under anvendelse af en PCR rense Kit ifølge producentens protokol. Opbevar rene skabelon ved -20 ° C.
- Forbered dobbeltstrenget RNA (dsRNA) fra skabelon ved hjælp af en T7-RNA-transkription kit, ifølge producentens anvisninger. Forvent ~ 5-15 mg / ml koncentration af dsRNA. Opbevar dsRNA ved -20 ° C.
- At Knockdown Klp61F med dsRNA, tillader S2-celler, der udtrykker EG5-mCherry ved 25% konfluens til semi-klæbe til bunden af en 35 mm vævskulturskål i 1 time.
- Fjern medier fra retterne og tilsæt 5 pg dsRNA mod Klp61F (Drosophila kinesin-5) fortyndet i 1 ml serum-frit Schneider 's medier.
- Inkuber ved stuetemperatur i 1 time, hvorefter der tilsættes 1 ml Schneiders medier med 10% FBS. Cellerne inkuberes ved 25 ° C.
- 24 timer efter dsRNA behandling, inducerer ekspression af EG5-mCherry ved tilsætning CuSO4 til en slutkoncentration på 500 uM. Cellerne inkuberes ved 25 ° C i yderligere 24 timer.
3. Levende Cell Imaging
- Placer en 22 mm x 22 mm concanavalin A coatede dækglas i en ren 35 mm vævskulturskål.
- Frø 500 pi de celler, der er blevet behandlet med dsRNA og inducerede O / N på concanavalin A coatet dækglas og tillader dem at holde sig i ca. 1 time.
- Saml dækglasset i en rose kammer (eller passende beholder) til billeddannelse.
- Find mitotiske celler, der udtrykker både EG5-mCherry og GFP-α-tubulin.
BEMÆRK: mitotiske celler udtrykker kun GFP-α-tubulin skal have monopolære spindler siden Klp61F, som er nødvendig for spindel bipolaritet er slået ned 10,13. - Saml time-lapse billeder af bipolære spindler (f.eks 1 frame pr minut) i celler, der udtrykker både EG5-mCherry og GFP-α-tubulin.
- Mens billedbehandling, fjerne mediet fra rosen kammeret, og erstatte det med Schneiders medier indeholdende 1 uM STLC over 3 på hinanden følgende medier udvekslinger (~ 5 ml i alt) ind i kammeret for at visualisere spindel kollaps.
- Overfor udvaskning af lægemidlet og vende spindlen sammenbrud, forsigtigt fjerne STLC-holdige medier fra rosen kammeret, og vask i Schneiders medier 4x (6-8 ml i alt), før opfyldning rosen kammeret en sidste gang med friske medier. Fortsæt billeddannelse.
4. Error Correction Assay
- Placer en 22 mm x 22 mm Concanavalin A coatede dækglas i rene 35 mm vævskulturskåle.
- Frø 500 pi celler, der er blevet behandlet med Klp61F dsRNA'et på concanavalin A coatede dækglas og give dem mulighed for at overholde.
- Efter cellerne er adhered, tilsættes 1,5 ml af Schneiders medier til hver skål at bringe det endelige volumen op til 2 ml.
- At standse celler i mitose, tilføje MG132 til en slutkoncentration på 10 uM til hver af retterne, og inkuberes i 1 time.
- Tilsæt 1 uM STLC og inkuberes i 1 time for at tillade monopoles at danne.
- Skyl den STLC ved at skylle dækglas 3x med 2 ml frisk Schneiders medier hver gang.
- Inkuber dækglas med Schneiders medier ud over eventuelle farmakologiske lægemidler (f.eks Aurora kinase hæmmere) eller DMSO som kontrol.
Bemærk: inhibitorkoncentrationer varierer og ordentlige endelige koncentrationer skal bestemmes af forsøgslederen. Stamopløsninger fremstilles typisk således, at inhibitoren fortyndes 1: 1000 i medierne. I dette tilfælde en 1: 1000 fortynding af DMSO (eller passende opløsningsmiddel) tjener som vehikelkontrollen. Vi bruger Aurora B-hæmmer Binucleine 2 i en slutkoncentration på 40 uM. - Fix celler på forskellige tidspunkter to observere udviklingen af bipolar spindel dannelse og vurdere kinetochore vedhæftede stater. At fikse:
- Skyl hurtigt dækglassene med 2 ml 1x BRB-80.
- Fix celler ved tilsætning af 2 ml 10% paraformaldehyd fortyndet i 1 x BRB-80 i 10 minutter. Pipet paraformaldehyd forsigtigt i en kemisk hætte.
- Permeabilisere celler med 2 ml 1x PBS + 1% Triton-X i 8 min.
- Wash slides 3x med 2 ml 1x PBS + 0,1% Triton-X.
- Overførsel dækglas celle-side opad på et stykke Parafilm (brug en markør til at mærke Parafilm passende at holde styr på de objektglas) i en 150 mm petriskål.
- Dæk dækglassene med 150 pi kogt æsel serum (BDS) og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time for at blokere ikke-specifik antistofbinding.
Bemærk: Her kan fiksering protokollen stoppes skal fortsættes på et senere tidspunkt. Dækglas kan opbevares i et fugtighedskammer ved 4 ° C i op til 24 timer. At gøre fugtighedskammer, linje kanten af en 150 mm skålmed en våd laboratorium tørre og dække med petriskålen låg. - Fjern blok, og inkuber dækglassene i 1 time ved stuetemperatur med 150 pi primære antistoffer fortyndet hensigtsmæssigt i BDS at farve for kinetochores og mikrotubuli til slutkoncentrationer på henholdsvis 2 ug / ml (eller i henhold til producentens anbefalinger) og 1 ug / ml .
Bemærk: Her kan fiksering protokollen stoppes skal fortsættes på et senere tidspunkt. Dækglas kan opbevares i et fugtighedskammer ved 4 ° C i op til 24 timer. - Vask Dækglas 3x med 500 pi 1x PBS + 0,1% Triton-X.
- Inkuber dækglas i 30-60 minutter ved stuetemperatur med de passende fluorofor-konjugerede sekundære antistoffer fortyndet i BDS.
- Vask Dækglas 3x med 500 pi 1x PBS + 0,1% Triton-X.
- Inkuber dækglas med 150 pi BDS indeholdende 1 ug / ml DAPI slutkoncentration i 5 minutter.
- Vask dækglas 2x med 1x PBS + 0,1% Triton-X, og montere coverslips celle nedad på en 3x1 "slide med 8 pi montering medier. Mal hjørnerne med neglelak for at immobilisere dækglas på dias.
- Billede celler med bipolar spindler, der udtrykker EG5-mCherry. Tag en Z-serien, der består af 30 fly ved 0,2 um intervaller i alle kanaler ved hjælp af en 100X mål. Analysere omhyggeligt kinetochores og mikrotubuli at bestemme vedhæftede stater (tovejsorienteret eller syntelic vedhæftede filer).
Representative Results
Klp61F er forpligtet til at danne bipolære spindler. Det humane kinesin-5, EG5, kan redde funktionen af Klp61F i Drosophila S2-celler (figur 1A og D). Ved tilsætning af kinesin-5 hæmmer (STLC), mikrotubulus-associerede niveauer af motorens slip (figur 1B og E), og spindlen kollapser, hvilket resulterer i en monopol (figur 1C og F) i celler, der mangler endogen Klp61F efter en vellykket RNAi (Supplerende film 1). Det er bemærkelsesværdigt, at bipolære spindler kollapse ved tilsætning af STLC i de humaniserede S2-celler, fordi kinesin-5 aktivitet ikke er nødvendig for at opretholde spindel bipolarity i humane celler. Denne interessante uoverensstemmelse kan være et resultat af forskelle i interpolar mikrotubuli overlapning og / eller stabilitet i de to modelsystemer 14. Kinesin-5-inhibering (figur 2A og E) kan reve rsed ved udvaskning af lægemidlet og genvinding af en bipolar spindel kan følges over tid. Efter fjernelse af inhibitoren (Figur 2B og F), EG5-mCherry re-associerede med mikrotubuli Som bipolære spindel samler (figur 2C og G), og cellerne kan udvikle sig til en bipolar anafasen (figur 2D og H, supplerende filmen 2 ).
Figur 1. Tilsætning af 1 uM STLC fører til monopolære spindler i Drosophila S2-celler. Repræsentative billeder fra time-lapse billeddannelse af en Drosophila S2 celle, der udtrykker EG5-mCherry (AC) og GFP-α-tubulin (DF) under tilsætning af 1 uM STLC. Den EG5 inhibitor blev tilsat ved 3 min. Scale bar = 5 um. Timestamp = min: sek. w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. en bipolar spindel reformer ved fjernelse af STLC. Repræsentative billeder fra time-lapse billeddannelse af en Drosophila 2 celle, der udtrykker EG5-mCherry (AD) og GFP-α-tubulin (EH) under et STLC udvaskning eksperiment. STLC blev vasket ud ved 5 min. En bipolar reformer spindel inden 1 time til at fjerne STLC. Scale bar = 5 um. Tidsstempel: min:. Sec Klik her for at se en større version af dette tal.
ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "target =" _ blank "> Supplerende Movie 1. (Højreklik for at downloade). Widefield fluorescens billeddannelse af et repræsentativt eksempel på en Drosophila S2-celle udtrykker EG5-mCherry ( venstre) og GFP-α-tubulin (højre). 1 uM STLC blev tilsat ved 2 min, og spindlen danner en monopol inden for 10 min efter tilsætning af inhibitoren. Billederne blev optaget hver 1 min og spillede med en hastighed på 10 rammer per sekund. Scale bar = 5 um.
Supplerende Movie 2. (Højreklik for at downloade). Widefield fluorescens billeddannelse af et repræsentativt eksempel på en Drosophila S2-celle udtrykker EG5-mCherry (til venstre) og GFP-α-tubulin (til højre). Medier indeholdende 1 uM STLC blev fjernet, ogskyllet ved 5 min. En bipolar reformer spindel inden 1 time at fjerne inhibitoren. Billeder blev erhvervet hver 1 min og spillede med en hastighed på 10 billeder per sekund. Scale bar = 5 um.
Discussion
Visualisere fejlkorrektion er en værdifuld teknik til at undersøge de trin, der er involveret i denne vigtige og komplekse cellulære proces. For at gøre dette, er fejlagtige vedhæftede filer genereres ved hjælp af reversible inhibitorer, og fejlkorrektion er observeret ved udvaskning af lægemidlet. Dette assay blev oprindeligt udviklet under anvendelse af pattedyr vævskulturceller 5. Men tilstedeværelsen af store antal kinetochores i mange model pattedyrcelletyper en udfordring i at observere enkelte arrangementer fejlkorrektion. Drosophila S2 celler besidder så få som 4 par kinetochores, hvilket gør dem en mere foretrække cellelinie til at observere fejlkorrektion. En stor ulempe er, at mange inhibitorer er ineffektive i Drosophila S2-celler. Evnen til at generere et humaniseret Drosophila S2-cellelinien udtrykker human kinesin-5 giver et værdifuldt værktøj til at studere fejlkorrektion.
Selv Drosophila S2-celler kan være enbedre cellelinje at studere fejlkorrektion, de mange trin involveret i at opnå cellelinje og vælte væsentlige gener stiller nogle udfordringer til denne teknik. For eksempel kan transfektionseffektivitet være ganske lav. Hvis mindre end 20% af cellerne udtrykker EG5-mCherry bør transfektionen gentages så udvælgelsesprocessen vil tage længere tid. Ligeledes kan procentdelen af celler, der udtrykker begge fluorescerende proteiner falde over tid. Dette kan overvindes ved at opdele cellerne i nærvær af Blasticidin S HCI og hygromycin B til selektion for celler, der udtrykker EG5-mCherry og GFP-α-tubulin hhv. Det er også vigtigt at bemærke, at Drosophila S2-celler har orthologer til mange humane proteiner og; derfor er det vigtigt at optimere knockdown betingelser for de endogene proteiner. Optimale Knockdown betingelser kan variere i mængden af dsRNA og længden af behandlingen. I betragtning af fremkomsten og hurtig forbedring af CRISPR-Cas9 teknologiske stadees 15-17, generering af en Drosophila-cellelinie med Klp61F genet erstattet med human EG5 præsenterer en stærkt alternativ, som ville overvinde begrænsningerne af transfektion og knockdown tilgang. Vores arbejde viser, at flyve til menneske generstatning bør være en farbar vej i dette tilfælde selv de nødvendige reagenser til at gøre det i Drosophila S2-celler er under udvikling.
Denne procedure er ikke begrænset til EG5, men kan anvendes til at studere funktionen af andre proteiner af interesse. Hvis du bruger inhibitorer, der tidligere har været oprettet for at være ineffektiv i Drosophila S2-celler, kan denne protokol ændres til at studere den direkte virkning af inhibitorer i levende celler uden bekymringer om forbi mål effekter. Cellelinjen fremstilles ved hjælp af denne protokol kan også anvendes i high-throughput screening analyser for at identificere potentielle lægemidler rettet mod proteiner involveret i fejlkorrektion.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Patricia Wadsworth for gaven af kinesin-5 konstruktion. Dette arbejde blev støttet af en NIH tilskud (5 R01 GM107026) til TJM og af Research Grant No. 5-FY13-205 fra March of Dimes Foundation til TJM, samt støtte fra Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. til TJM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
| Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
| Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
| Copper(II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500 mM stock |
| S-trityl-L-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1 mM stock in DMSO |
| Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5 mg/ml stock in 1x PBS |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15 µg/µl |
| Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
| Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
| PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
| Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5 mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS. |
| Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4 °C. |
| Mounting Media | 20 mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4 °C. | ||
| 1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
| White Light Source | Lumencor Inc | ||
| ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
| DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
| anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
| DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
| anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |
References
- Cheeseman, I. M., Desai, A.
- Maresca, T. J., Salmon, E. D. Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal. J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146, 568-581 (2011).
- Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors. Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).
- Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division. Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Learman, S. S., et al. NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site. Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).
- Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms. J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).
- Maliga, Z., Mitchison, T. J. Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol. BMC Chem Biol. 6, 2 (2006).
- Goshima, G., Vale, R. D. The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line. J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).
- Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. Development of a Drosophila cell-based error correction assay. Front Oncol. 3, 187 (2013).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
- Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells. Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10, 957-963 (2013).
