Introduction
Igual a segregação do genoma durante a divisão celular requer interacções entre as correctas microtúbulos fusiformes ADN e replicados. Os microtúbulos interagir fisicamente com os cromossomas por meio de um conjunto de proteínas que se monta em centrómeros conhecidos como o cinetocoro 1. Distribuição correta dos cromossomos exige que cinetócoros irmãos são biorientado, em que cada irmã está associada a microtúbulos provenientes de pólos opostos do fuso. Kinetochore microtúbulos (KT-MT) anexos que não estão na conformação biorientado são rápida e eficientemente desestabilizada para proporcionar a oportunidade para estabelecer biorientation num processo conhecido como correcção de erros. Um ensaio de correcção de erros que foi previamente estabelecida em células de mamíferos requer montagem 5 fusos monopolares utilizando inibidores de moléculas pequenas reversíveis contra Eg5 (cinesina-5). O tratamento da droga gera uma infinidade de acessórios syntelic errôneas em que botcinetócoros h irmãos anexar ao mesmo pólo do fuso. Uma lavagem subsequente do fármaco, permite a visualização do processo de correcção de erro. O ensaio de correcção de erros pode ser realizada na presença de inibidores de moléculas pequenas ou knockdowns para estudar a contribuição de proteínas candidatas para corrigir erróneos anexos KT-MT.
A habilidade de visualizar a correcção de erros em células vivas é uma ferramenta poderosa para melhor compreender o mecanismo molecular envolvido neste processo complexo. No entanto, o grande número de cromossomas presentes na maioria das linhas celulares coloca um desafio na observação anexos KT-MT individuais. As células S2 de Drosophila seria ideal para a aplicação do ensaio de correcção de erro à medida que conter tão poucos como 4 cromossomas 6, mas os inibidores de moléculas pequenas de cinesina 5 tal como S-tritil-L-cisteína (STLC) e monastrol 7-9 não afecta a formação do fuso ou cinesina-5 função motora em células de Drosophila. Nós, portanto, gênerosTed uma linha de células S2 de Drosophila expressando cinesina-5 humana sob um promotor indutível que é sensível aos inibidores da cinesina-5. Este protocolo descreve como o knockdown endógena Drosophila cinesina-5 homólogo, Klp61F, e usar esta linha de células no ensaio de correcção de erros com base em células.
Protocol
1. transfecção de células S2
- A partir de um frasco previamente cultivadas 25cm 2, adicionar-GFP ct-expressando-tubulina células S2 10 para um volume final de 2 ml a 100% de confluência, e permitir-lhes semi-aderir ao fundo de uma cultura de 35 mm de tecido do prato para cerca de 1 h.
- Remova a mídia do prato. Transfectar 2 ug da Eg5-mCherry construção 11 com 1 ml de meio de Schneider suplementado com FBS a 10% (a seguir referido como meio de Schneider) e Reagente de Transfecção, seguindo o protocolo do fabricante. Fecha-se o prato com Parafilm e incubar as células a 25 ° C durante 16-18 horas.
- Adicionar 1 ml de meio de Schneider. Retorno células a 25 ° C incubadora.
- No dia 3 após a transfecção, transferir 500 ul de células transfectadas para uma nova placa de cultura de 35 mm de tecido contendo 1,5 ml de meio de Schneider durante um teste de indução. Induzem a expressão de Eg5-mCherry por adição de CuSO4
- Para fazer lamelas revestidas com concanavalina A pipeta, um volume suficiente de solução de concanavalina A (0,5 mg / mL dissolvido em H 2 O) para revestir uma lamela de ácido lavou-se, remover o excesso, e permitir que as lamelas secar ao ar.
- Coloque um 22 mm x 22 mm concanavalina revestidos por uma lamela limpa numa cultura de 35 mm de tecido do prato, em seguida, 500 ul de sementes a 100% de confluência das células induzidas para a lamela e permitir que as células aderir durante 1 hora à TA.
- Para verificar se há expressão Eg5-mCherry, montar a lamela em uma câmara de rosa (ou vaso de imagem apropriado) com a mídia para imagens em RT em um microscópio de fluorescência. Use fontes de luz adequadas e conjuntos de filtros para visualizar as células. Por exemplo, o microscópio usado no estudo tem uma fonte de luz LED branco e EGFP (ITCF / Cy2) e dsRed (TRITC / Cy3) filtro cubos. Eg5-mCherry localiza aos microtúbulos e é enriquecido near pólos do fuso.
- Depois de garantir que as células expressando tanto são Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina, transferir o restante das células transfectadas, não induzidas a 25 cm2 frasco de cultura de tecidos contendo 4 ml de meio de Schneider.
- Adicionar Blasticidina S HCl a uma concentração final de 25 ug / mL ao frasco de células transfectadas e continuar a divisão na presença de 25 ug / ml de Blasticidina S HCl até a morte celular cessa tendo a certeza de verificar a expressão da Eg5-mCherry periodicamente. Incubar as linhas celulares em 25 ° C incubadora.
NOTA: A percentagem de células que expressam Eg5-mCherry aumenta ao longo do tempo. - Uma vez que as células são transfectadas de forma estável, continuam a dividir na ausência de fármaco e congelar as células 12 para uso futuro.
2. RNA Interferência
- PCR amplificar uma região ~ 500 pb de Klp61F de cDNA (LD15641) utilizando o iniciador com adição de sequência de promotor de T7 (sequência previsto na lista de materiais) para serutilizado como um molde para a síntese de ARNcd.
- Defina-se quatro reacções de PCR, 50 pi cada uma, contendo 100 ng de ADN molde, 25 pM de cada iniciador, tampão adequado, e a polimerase. Ajuste o protocolo de PCR no termociclador de acordo com o protocolo do fabricante da polimerase.
- Piscina e quatro reacções de PCR limpas usando um PCR limpar kit de acordo com o protocolo do fabricante. Armazenar o molde limpo a -20 ° C.
- Prepare ARN de cadeia dupla (ARNcd) de molde usando um kit de transcrição de ARN de T7, seguindo as instruções do fabricante. Esperar ~ concentração de 5-15 mg / ml de ARNdc. ARNcd armazenar a -20 ° C.
- Para knockdown Klp61F com ARNcd, permitem que as células que expressam S2 Eg5-mCherry a 25% de confluência em semi-aderir ao fundo 35 de um prato de cultura de tecido mm durante 1 hora.
- Remova a mídia dos pratos e adicionar 5 ug de dsRNA contra Klp61F (Drosophila kinesin-5) diluído em 1 ml de Schneider isento de soro "s mídia.
- Incubar à temperatura ambiente durante 1 h, em seguida adicionar 1 ml de meio de Schneider com 10% de FBS. Incubar as células a 25 ° C.
- 24 horas após o tratamento ARNcd, induzir a expressão da Eg5-mCherry por adição de CuSO4 até uma concentração final de 500 uM. Incubar as células a 25 ° C durante mais 24 h.
3. Imagens de células vivas
- Coloque um 22 mm x 22 mm concanavalina A lamela revestida num limpo 35 mm de cultura de tecidos prato.
- Semente de 500 ul de células que foram tratados com ARNdc e induzidas O / N para a concanavalina A lamela revestida e lhes permitem aderir durante cerca de 1 hora.
- Montar a lamela em uma câmara de rosa (ou recipiente apropriado) para a imagem latente.
- Encontre células mitóticas expressam tanto Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina.
NOTA: As células mitóticas expressando apenas GFP-α-tubulina fusos monopolares deve ter desde Klp61F, que é necessário para bipolaridade fuso, é derrubado 10,13. - Coletar imagens de lapso de tempo de eixos bipolares (por exemplo, um quadro por minuto) em células que expressam tanto Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina.
- Enquanto imagem, remova a mídia da câmara de rosa, e substituí-la por meios de Schneider contendo 1 mM STLC mais de 3 trocas de mídia consecutivos (~ 5 ml total) para a câmara para visualizar colapso do fuso.
- À lavagem da droga e reverter o colapso do eixo, retire cuidadosamente a mídia contendo STLC da câmara de rosa, e lavar em meio de Schneider 4x (6-8 ml total) antes de reencher a câmara se levantou pela última vez com meio fresco. Continuar imagiologia.
4. Correção de Erros Assay
- Coloque um 22 mm x 22 mm concanavalina A lamelas revestidas em placas de cultura de 35 mm de tecido limpo.
- Semente 500 ul de células que foram tratados com ARNdc sobre o Klp61F concanavalina A lamela revestida e lhes permitem aderir.
- Depois as células são adherEd, adicionar 1,5 ml de meio de Schneider a cada placa para levar o volume final até 2 ml.
- Para reter as células em mitose, MG132 adicionar a uma concentração final de 10 uM a cada um dos pratos, e incubar durante 1 h.
- Adicionar 1 uM STLC e incubar durante 1 h para permitir que monopoles para formar.
- Lavar a STLC por lavagem 3x lamelas com 2 ml de meio de Schneider frescos cada vez.
- Incubar lamelas com meio de Schneider, além de quaisquer drogas farmacológicas (por exemplo, inibidores de quinase Aurora) ou DMSO, como um controlo.
Nota: as concentrações do inibidor variam e concentrações finais adequada deve ser determinada pelo experimentador. As soluções de reserva são normalmente feitas de tal modo que o inibidor é diluída 1: 1.000 em mídia. Neste caso, uma diluição de 1: DMSO (ou num solvente apropriado) 1000 serve como controlo do veículo. Usamos o inibidor de Aurora B Binucleine 2 a uma concentração final de 40 uM. - Fix células em diferentes pontos no tempo tO observar a progressão da formação do fuso bipolar e para avaliar os estados de ligação cinetócoro. Consertar:
- Enxaguar rapidamente as lamelas com 2 ml de 1x BRB-80.
- Fixar as células por adição de 2 ml de 10% de paraformaldeído em diluídos 1x BRB-80 durante 10 min. Pipet paraformaldeído cuidadosamente em uma capa química.
- Permeabilizar as células com 2 ml de 1x PBS + 1% de Triton-X durante 8 min.
- Lavagem das lâminas 3x com 2 ml de PBS 1x + 0,1% de Triton-X.
- Transferência lamelas do lado célula viradas para cima para uma folha de Parafilm (use um marcador para rotular Parafilm adequadamente para manter o controle das lâminas) em uma placa de Petri de 150 milímetros.
- Cobrir as lamelas com 150 ul de soro de burro fervida (BDS) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h para bloquear o anticorpo não específico de ligação.
Nota: Aqui, o protocolo de fixação pode ser parado para ser mantida a um ponto mais tarde. As lamelas podem ser armazenados numa câmara de humidade a 4 ° C durante até 24 h. Para fazer com que a câmara de humidade, a linha do aro de um prato de 150 mmcom um laboratório wipe molhado e cubra com a tampa placa de Petri. - Remover bloco, e incuba-se as lamelas durante 1 hora à temperatura ambiente com 150 ul de anticorpos primários diluídos apropriadamente em BDS para corar para cinetocoros e microtúbulos até às concentrações finais de 2 ug / ml (ou de acordo com as recomendações do fabricante) e 1 ug / ml, respectivamente .
Nota: Aqui, o protocolo de fixação pode ser parado para ser mantida a um ponto mais tarde. As lamelas podem ser armazenados numa câmara de humidade a 4 ° C durante até 24 h. - Lavar 3x lamelas com 500 ul de 1x PBS + 0,1% de Triton-X.
- Incubar lamelas durante 30-60 min à temperatura ambiente com os anticorpos secundários conjugados com fluoróforos adequados diluídos em BDS.
- Lavar 3x lamelas com 500 ul de 1x PBS + 0,1% de Triton-X.
- Incubar lamelas com 150 ul de BDS contendo 1 ug / ml de concentração final de DAPI, durante 5 min.
- Lavar as lamelas com PBS 1x 2x + 0,1% de Triton-X, C e montaroverslips lado célula para baixo em um slide 3x1 "com 8 mL de meio de montagem. Pinte os cantos com unha polonês para imobilizar as lamelas em lâminas.
- Células de imagem com eixos bipolares que estão expressando Eg5-mCherry. Tirar uma série Z constituído por 30 aviões em 0.2 mm intervalos em todos os canais usando um objetivo 100X. Analisar cuidadosamente as cinetócoros e microtúbulos para determinar os estados de fixação (biorientados ou anexos syntelic).
Representative Results
Klp61F é necessário para formar fusos bipolares. O cinesina-5 humana, Eg5, pode resgatar a função de Klp61F em células S2 de Drosophila (Figura 1A e D). Após a adição da cinesina-5 inibidor (STLC), níveis associadas a microtúbulos da gota do motor (Figura 1B e E), e os colapsos do fuso, o que resulta em um monopolo (Figura 1C e F) em células sem Klp61F endógenos sobre o ARNi sucesso (filme Suplementar 1). É digno de nota que fusos bipolares em colapso após a adição de STLC nas células S2 porque cinesina humanizados-5 actividade não é necessária para manter bipolaridade fuso em células humanas. Esta discrepância interessante pode ser um resultado de diferenças na sobreposição de microtúbulos interpolar e / ou estabilidade nos dois sistemas modelo 14. Cinesina-5 de inibição (Figura 2 A e E) pode ser reve rsed por lavagem do fármaco e a recuperação de um fuso bipolar pode ser seguido ao longo do tempo. Após a remoção do inibidor (Figura 2B e F), Eg5-mCherry re-associados com os microtúbulos como um bipolares monta fuso (Figura 2C e G), e as células podem progredir para um anafase bipolar (Figura 2D e H, filme suplementar 2 ).
Figura 1. A adição de 1 mM STLC leva a fusos monopolares em células S2 de Drosophila. Imagens representativas de time-lapse imagem de uma célula de Drosophila S2 expressar Eg5-mCherry (AC) e GFP-α-tubulina (DF) durante a adição de 1 mM STLC. O inibidor de Eg5 foi adicionado em 3 minutos. Barra de escala = 5 uM. Timestamp = min: seg. "target =" _ blank w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A reforma do fuso bipolar após a remoção de STLC. Imagens representativas de time-lapse imagem de uma célula de Drosophila expressando 2 Eg5-mCherry (AD) e GFP-α-tubulina (EH) durante um experimento STLC washout. STLC foi lavado para fora em 5 min. A reforma do fuso bipolar dentro de 1 hora de remover o STLC. Barra de escala = 5 uM. Timestamp: min: seg. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
"target =" _ blank ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "> Filme Suplementar 1. (Clique direito a download). Widefield imagens de fluorescência de um exemplo representativo de uma célula de Drosophila S2 expressar Eg5-mCherry ( esquerda) e GFP-α-tubulina (à direita). 1 uM STLC foi adicionado aos 2 min, e as formas do fuso um monopolo dentro de 10 min após a adição do inibidor. As imagens foram adquiridas a cada 1 minuto e tocada a uma velocidade de 10 quadros por segundo. Barra de escala = 5 mm.
Filme Suplementar 2. (Clique direito a download). Widefield imagens de fluorescência de um exemplo representativo de uma célula de Drosophila S2 expressar Eg5-mCherry (esquerda) e GFP-α-tubulina (à direita). Meios contendo 1 uM foi removido e STLClavado a 5 min. A reforma do fuso bipolar dentro de 1 hora de remover o inibidor. As imagens foram adquiridas a cada 1 min e jogado a uma taxa de 10 quadros por segundo. Barra de escala = 5 uM.
Discussion
A visualização de correcção de erros é uma técnica valiosa para estudar as etapas envolvidas neste processo celular importante e complexo. Para fazê-lo, os anexos erradas são gerados usando inibidores reversíveis, e correcção de erros é observada mediante lavagem do fármaco. Este ensaio foi inicialmente desenvolvido utilizando células de cultura de tecidos de mamíferos, 5. No entanto, a presença de grande número de cinetocoros em muitos tipos de células de mamíferos modelo coloca um desafio na observação de eventos individuais de correcção de erros. As células S2 de Drosophila possuem tão poucos como 4 pares de cinetocoros, tornando-as numa linha celular mais preferível para a observação de correcção de erros. No entanto, uma grande desvantagem é que muitos inibidores são ineficazes em células S2 de Drosophila. Assim, a capacidade de gerar uma linha de células S2 de Drosophila expressando humana humanizado cinesina-5 fornece uma ferramenta valiosa para estudar a correcção de erros.
Embora as células S2 de Drosophila pode ser ummelhor linha celular para estudar a correção de erros, as várias etapas envolvidas na obtenção da linha celular e derrubando genes essenciais coloca alguns desafios para esta técnica. Por exemplo, a eficiência da transfecção pode ser muito baixo. Se menos de 20% das células expressam o Eg5-mCherry, a transfecção deve ser repetido o processo de selecção como irá demorar mais tempo. Além disso, a percentagem de células que expressam ambas as proteínas fluorescentes pode diminuir ao longo do tempo. Isto pode ser superado através da divisão de células na presença de Blasticidina S HCl e higromicina B para seleccionar as células que expressam Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina, respectivamente. É também importante notar que as células S2 de Drosophila têm ortólogos para muitas proteínas e humanos; Portanto, é essencial para optimizar as condições de knockdown para as proteínas endógenas. Condições óptimas de knockdown pode variar na quantidade de ARNdc e a duração do tratamento. Considerando-se o surgimento e rápida melhoria das CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, a geração de uma linha de células de Drosophila com o gene Klp61F substituído por Eg5 humano apresenta uma alternativa poderosa capaz de superar as limitações da transfecção e abordagem knockdown. Nosso trabalho demonstra que a mosca-a-homem substituição gene deve ser uma opção viável neste caso, embora os reagentes necessários para fazê-lo em células de Drosophila S2 estão sendo desenvolvidos atualmente.
Este processo não está limitado a Eg5, mas pode ser aplicado para estudar a função de outras proteínas de interesse. Se o uso de inibidores que tenham sido previamente estabelecidos para ser ineficaz em células de Drosophila S2, este protocolo pode ser modificado para se estudar o efeito direto de inibidores em células vivas, sem preocupações sobre os efeitos alvo fora. A linha celular produzida usando este protocolo pode também ser utilizada no rastreio de alto rendimento para identificar as análises potenciais drogas que visam proteínas envolvidas na correcção de erro.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Patricia Wadsworth para o dom do kinesin-5 construção. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH (5 R01 GM107026) para TJM e pela Research Grant No. 5-FY13-205 da March of Dimes Foundation para TJM, bem como o apoio da Charles H. capa Foundation, Inc., Boston, MA. para TJM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
| Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
| Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
| Copper(II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500 mM stock |
| S-trityl-L-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1 mM stock in DMSO |
| Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5 mg/ml stock in 1x PBS |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15 µg/µl |
| Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
| Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
| PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
| Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5 mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS. |
| Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4 °C. |
| Mounting Media | 20 mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4 °C. | ||
| 1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
| White Light Source | Lumencor Inc | ||
| ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
| DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
| anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
| DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
| anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |
References
- Cheeseman, I. M., Desai, A.
- Maresca, T. J., Salmon, E. D. Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal. J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146, 568-581 (2011).
- Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors. Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).
- Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division. Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Learman, S. S., et al. NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site. Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).
- Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms. J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).
- Maliga, Z., Mitchison, T. J. Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol. BMC Chem Biol. 6, 2 (2006).
- Goshima, G., Vale, R. D. The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line. J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).
- Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. Development of a Drosophila cell-based error correction assay. Front Oncol. 3, 187 (2013).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
- Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells. Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10, 957-963 (2013).
