Se eligió el cultivo tridimensional en perlas de alginato, debido a su simplicidad y reproducibilidad, para mantener las células de adenoma hipofisario. Los procedimientos incluyeron una digestión enzimática inicial y disociación mecánica del tejido tumoral, y la posterior suspensión celular se encapsuló en perlas de alginato.
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Artículo de método
Tridimensional de alginato-grano Cultura de células humanas del adenoma pituitario
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Resumen
Resumen
Se describe un método de cultivo en tres dimensiones en el que las células de adenoma de la pituitaria primaria se cultivan en perlas de alginato. El alginato es un polímero derivado de algas pardas marinas. Brevemente, el tejido tumoral se corta en trozos pequeños y se sometió a una digestión enzimática con colagenasa y tripsina. A continuación, se obtiene una suspensión de células. La suspensión de células tumorales se mezcla con alginato de sodio 1,2% y se dejó caer en una solución de CaCl 2, y la suspensión de alginato / célula se gelifica al contacto con el CaCl 2 para formar perlas esféricas. Las células incrustadas en las perlas de alginato se suministran con nutrientes proporcionados por los medios de cultivo enriquecidos con 20% de FBS. cultivo tridimensional en perlas de alginato mantiene la viabilidad de las células de adenoma durante largos períodos de tiempo, hasta cuatro meses. Por otra parte, las células pueden ser liberados del alginato por lavado de las perlas con citrato de sodio y se sembraron en cubreobjetos de vidrio para análisis adicionales inmunocitoquímicos. El uso de un celmodelo l de cultivo permite la fijación y la visualización del citoesqueleto de actina con la desorganización mínima. En resumen, perlas de alginato proporcionan un sistema de cultivo fiable para el mantenimiento de las células adenoma hipofisario.
Introducción
Andamios tridimensionales se han utilizado ampliamente en el cultivo de células, ya que proporcionan un soporte estructural tridimensional para células cultivadas y el mantenimiento de la comunicación de célula a célula 1. materiales de polímero de origen natural se han utilizado para hacer los andamios tridimensionales incluyendo colágeno de tipo I, quitosano y alginato. El alginato es un polímero natural derivado de la Macrocystispyrifera algas de mar marrón (Kelp). Este polímero se compone de unidades repetidas de ácido β-D-manurónico (M) y α-L-gulurónico ácido (G) 2 y forma geles estables en presencia de ciertos cationes divalentes, tales como calcio y bario. Cloruro de calcio (CaCl 2) soluciones se utilizan comúnmente como el reactivo de reticulación para formar perlas de alginato. Soluciones de alginato se dejó caer en CaCl2 formar geles inmediatamente esféricas tridimensionales. Cuando la solución de alginato se mezcla con las células, las células se encapsulan en el alginato bEADS 3.
El alginato tiene propiedades que le han permitido para ser utilizado como una matriz para la encapsulación de una variedad de células, incluyendo condrocitos 4, mioblastos esqueléticos 5 y las células madre neurales 6. Es un material inerte y permite la difusión de nutrientes, oxígeno y productos metabólicos que mantienen la supervivencia y función de las células; por otra parte, a diferencia de otros sistemas de cultivo basados en gel, las células cultivadas en perlas de alginato también pueden ser liberados del andamio usando quelantes de calcio, tales como citrato de sodio, y las células entonces pueden ser cosechadas para investigaciones posteriores 7.
Los adenomas hipofisarios son tumores benignos generalmente con bajas tasas de proliferación. Líneas celulares de adenoma hipofisario rata han sido cultivadas con éxito en un sistema de dos dimensiones 8. Sin embargo, esta cultura de los tumores de células secretoras pituitaria humana no es un desarrollo eficiente; células de la pituitaria tumores crecen muy poco dispersasen cultivo, las células exhiben unión limitada y difusión, y las células normalmente forman agregados flotantes en la placa de cultivo 9,10.
Se han hecho varios intentos para obtener una suspensión de células de pituitaria tumor, incluyendo un enfoque enzimática y dispersión mecánica 11, un enfoque de dispersión exclusivamente mecánico 12 y el cultivo de explantes tumorales 10. Con estos enfoques, diferentes autores han obtenido cultivos adherentes viables para diferentes períodos de tiempo. Las capacidades de las células secretoras tumor para sobrevivir en estos sistemas bidimensionales dependerá del tipo de tumor y sus tasas de proliferación 9. Sin embargo, en cultivos a largo plazo, las células con fenotipos de fibroblastos predominan 11,13. Este documento describe un método para obtener un cultivo primario de células de adenoma de la pituitaria encapsuladas en perlas de alginato que los libera más lejos de la andamio alginato que permite el análisis detallado deaspectos de su biología celular, por ejemplo, sus arreglos del citoesqueleto.
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Protocolo
Este estudio fue aprobado por el uso de material humano por los comités éticos locales de la institución médica y el Centro de Investigación y Estudios con antelación por el Instituto Politécnico Nacional.
1. Tumor Obtención de Muestras
- Obtener la biopsia de tejido del adenoma pituitario de un paciente a través de un procedimiento quirúrgico trans-esfenoidal 14.
- Recoger la muestra pituitaria adenoma y colocarlo en una botella de vidrio estéril que contiene 50 ml de fresco 199 medio de cultivo (M199) enriquecido con 10% de suero bovino fetal (FBS), 0,6 mg / bicarbonato de sodio ml, 2,4 mg / ml HEPES y 1% antibióticos (penicilina / estreptomicina) a pH 7,4. Mantener la muestra en un frasco de vidrio en el hielo.
Nota: El tejido tumoral se puede procesar varias horas después de la cirugía. - Transporte la muestra de tumor al laboratorio en la botella de vidrio en hielo.
2. Preparación de la disociación del tejido soluciones enzimáticas, elSolución inhibidor de tripsina y las soluciones de alginato
Nota: Antes del procedimiento de cultivo celular se preparan las siguientes soluciones. Filtrar todas las soluciones utilizando un filtro de 0,22 micras de membrana, antes de su uso.
- Preparar colagenasa solución al 1% por disolución de 5 mg de colagenasa (tipo I) en 5 ml de M199 libre de suero.
- Preparar tripsina solución 0,01% por disolución de 0,01 g de tripsina en 10 ml de PBS-EDTA 0,3%.
- Preparar la solución de inhibidor de tripsina de 0,1% mediante la disolución de 2 mg de inhibidor de tripsina de soja en 20 ml de M199 libre de suero.
- Preparar la solución de ADNasa mediante la disolución de 20 l de DNasa I 134 U / ml en 4 ml de la solución de inhibidor de tripsina.
- Preparar la solución EGTA (1,2 M) disolviendo 22,8 mg de EGTA en 40 ml de NaCl 155 mM. Ajustar el pH a 7,4. Continuar hasta un volumen final de 50 ml.
- Preparar la solución de HEPES (20 mM) mediante la disolución de 238 mg HEPES en 50 ml de NaCl 155 mM.
- Preparar la solución de alginato al 1,2% disolviendo 1,2g de alginato de sodio en 100 ml de la solución de HEPES. Esterilizar en autoclave la solución de alginato.
- Preparar la solución de calcio (102 mM) disolviendo 750 mg de CaCl 2 en 50 ml de solución de HEPES, ajustar el pH a 7,4
3. célula primaria cultura y alginato de encapsulación
- Dentro de una cabina de flujo laminar, colocar el tejido tumoral en un 35 mm placa de Petri que contiene aproximadamente 20 ml de PBS Ca2 + y Mg2 + libre, pH 7,4 (PBS *).
- Tome el tejido con una pinza quirúrgica y colocarlo en otra placa de Petri que contiene PBS fresca *, lavar suavemente el tejido. Repita este paso hasta que se eliminan las células rojas de la sangre y los residuos.
- Usando una pinza quirúrgica, mantener el tejido del adenoma pituitario, y con una pequeña tijera quirúrgica, se corta en trozos pequeños. Con una pipeta Pasteur con bordes redondeados, la transferencia de los fragmentos de tejido y el PBS * en un tubo de 15 ml, Centrifugar a 68 xg durante 10 min a TA.
Nota: para redondear los bordes de una Pasteurpipeta, llama poco la punta de la pipeta en un mechero Bunsen. - Retire el PBS * usando una pipeta Pasteur y añadir 3-5 ml de la solución de colagenasa (aproximadamente 5 ml de 65 mm 3 de tejido), se mezclan dos o tres veces por inversión. Incubar el tejido en la colagenasa durante 30 min a 37 ° C en rotación constante.
- Centrifugar el tubo a 68 xg durante 10 min a TA y retire la colagenasa con una pipeta Pasteur.
- Añadir 5 ml de DNAsa y mezclar dos a tres veces por inversión, a continuación, centrifugar el tubo a 68 xg durante 10 min a TA.
Nota: Si el tejido no está completamente disociado, realizar una segunda digestión enzimática con tripsina durante 3 min a 37 ° C. Detener la digestión mediante la adición de 2 volúmenes de solución de inhibidor de tripsina. - Aspirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur y desechar. Vuelva a suspender el sedimento en 1 volumen de solución EGTA y mezclar con 2 volúmenes de solución de alginato.
- Mezclar suavemente la suspensión celular y alginatopipeteando con una pipeta Pasteur. Tome una jeringa estéril con una aguja de 21 G, retire el émbolo; utilizar una pipeta para cargar la jeringa con la disolución de alginato y la célula.
- insertar suavemente el émbolo en la jeringa y dispensar cuidadosamente la solución de células de alginato gota a gota en un vaso de precipitados de vidrio que contiene aproximadamente 30 ml de la solución rica en calcio.
- Coloque la aguja de la jeringa aproximadamente 5 cm hasta la solución de CaCl2. Los geles de suspensión de células de alginato en contacto con el CaCl 2 para formar perlas esféricas. Mantener las perlas de alginato de calcio en la solución durante 5 min.
Nota: Agitar el vaso de vidrio en el que se dejan caer las perlas. Mueva lentamente con la mano en movimientos circulares, para evitar que se peguen entre sí. - Retire cuidadosamente la solución de calcio con una pipeta Pasteur, y lavar las perlas dos veces con 3-5 ml de M199 enriquecido con 20% de FBS.
- La transferencia de las perlas de alginato en un cultivo de tejido T25 regularesmatraz de usar una espátula estéril, añadir 4-5 ml de M199 enriquecido con 20% de FBS y se incubaron a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2. Cambiar el medio de cultivo cada tres días.
4. Las células de Liberar el alginato
Nota: Antes de la liberación de las células de las perlas de alginato, capa 13 cubreobjetos mm de diámetro con poli-D-lisina.
PRECAUCIÓN: SULFÚRICO ácido es un ácido altamente corrosivos, y APTS PUEDE CAUSAR EL OJO Y LA PIEL. USO guantes de látex para manejar estos reactivos.
- En una campana de humos, con una pinza punto de sumergir los cubreobjetos en una placa de Petri de vidrio que contiene ácido sulfúrico acuoso al 20% durante 1 hora a RT.
- Decantar el ácido sulfúrico, y lavar los cubreobjetos cinco veces con agua destilada durante 5 minutos cada uno. El uso de un lugar punto pinzas los cubreobjetos limpios en una placa de Petri que contiene NaOH 0,1 M durante 5 min a RT 15.
- Decantar el NaOH y se lava una vez con distilLED de agua, aspirar el agua y secar los cubreobjetos.
- Utilice una micropipeta para recubrir los cubreobjetos con APTS (aminopropil-trietoxisilano) durante 4 min (use 500 l para 6 cubreobjetos) inundar la placa de Petri con agua destilada. aspirar rápidamente el agua y seguir lavando con agua destilada, moviendo los cubreobjetos con unas pinzas de punto para permitir que el agua penetre por debajo.
- Aspirar el agua y secar los cubreobjetos, utilizando un lugar punto pinzas los cubreobjetos en una placa Petri limpia y esterilizarlos en el microondas durante 3 veces, 45 segundos cada uno. Añadir 1.000 l de agua estéril a 100 g de poli-D-lisina (0,1 mg / ml).
- Incubar los cubreobjetos con aproximadamente 50 l de poli-D-lisina durante 5 min a RT. Aspirar el poli-D-lisina por completo.
Nota: Esto es importante porque soluble poli-D-lisina en el medio de cultivo puede inhibir la proliferación celular. - Lavar los cubreobjetos cinco veces con agua estéril durante 5 minutos cada uno. Aspirar el stagua y dejar que se seque erile cubreobjetos dentro de una cabina de flujo laminar.
- Para analizar el citoesqueleto de actina, liberar las células de la pituitaria de la alginato. Tomar algunas de las perlas de alginato del matraz de cultivo usando una punta de pipeta de 1 ml y colocarlos en un tubo de 15 ml.
- Añadir 5 ml de citrato de sodio 55 mM (se disuelven 323,6 mg de Na 3 C 6 H 5 O 7, 2 H 2 O en 20 ml de solución de HEPES) y se centrifuga a 68 x g durante 10 min a TA. Aspirar el sobrenadante y desechar.
- Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de M199 caliente enriquecido con un 20% de FSB; mezclar suavemente la suspensión de células con una pipeta Pasteur.
PRECAUCIÓN: faloidina Y DAPI son tóxicos. Utilice guantes para manejar estos reactivos. - Para contar las células, la transferencia de 125 l de solución de azul de tripano al 0,4% a un tubo de 1,5 ml. Añadir 75 l de M199 y 50 l de la suspensión celular obtenida en el último paso (factor de dilución = 5). Mezclar bien.
- Utilice una punta de micropipeta de place aproximadamente 10 l de la suspensión de células azul de tripano en la cámara de hemocitómetro.
- Contar las células en el contador hemocitómetro usando un microscopio invertido con contraste de fase de iluminación. Contar todas las celdas de la plaza del centro de 1 mm y cuatro cuadrados de las esquinas 1 mm. Obtener la densidad de células por mililitro de multiplicar el recuento medio por metro cuadrado por el factor de dilución. - 10 4 Por ejemplo, si los recuentos promedio por metro cuadrado es de 45 células x 5 x 104 = 2,25 x 106 células / ml.
Nota: Contar las células en diez plazas de la cámara de hemocitómetro. No contar las células que tocan la línea media en la parte inferior ya la derecha. - Seed 35.000 células en cubreobjetos de vidrio de diámetro 13 mm cubiertos con poli-D-lisina.
5. Disposición citoesqueleto de actina
- Después de 48 horas en cultivo, se elimina el medio de cultivo con una pipeta Pasteur y rápidamente añadir 500 l por cubreobjetos de PBS, inmediatamente retirar el PBS.
- Fijar y permeabilizar tél células con 500 l por cubreobjetos de tampón de fijación (0,1 M TUBOS, pH 6,75, 4% de PEG-6000, EGTA 1 mM, 1 mM MgSO 4, 0,5% de Triton X-100 y 2% de formaldehído) durante 10 min a 37 ° do
- Eliminar el tampón de fijación y añadir 500 l por cubreobjetos de 3,5% de paraformaldehído en PBS durante 30 min a TA. Eliminar la solución de paraformaldehído.
- Lavar los cubreobjetos tres veces mediante la adición de 500 l por cubreobjetos de PBS durante 5 min cada uno. Lavar los cubreobjetos a temperatura ambiente, en agitación constante.
- Se incuban las células con cloruro de amonio 50 mM durante 10 min, aspirar la solución de cloruro de amonio y repita el paso 5.4.
- Se incuban las células con 1% de BSA (IgG-libre, proteasas libres) en PBS durante 30 minutos, se retira la solución de BSA y repita el paso 5.4.
- Se incuban las células con 50 M de faloidina conjugada con rodamina durante 7 minutos a temperatura ambiente, repita el paso 5.4.
- Se incuban las células con 255 mM de DAPI diluido en PBS durante 5 min a TA, repita el paso 5.4. Finalmente montar tque cubreobjetos con un medio de montaje y sellarlos con esmalte de uñas.
- Adquirir imágenes de las disposiciones de la actina del citoesqueleto utilizando un microscopio de barrido láser confocal con un objetivo de 63X, en la longitud de onda de excitación de 541 nm.
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Resultados
Este protocolo se ha aplicado con éxito en el cultivo y mantenimiento de las células del adenoma pituitario en perlas de alginato para diferentes períodos de tiempo La figura 1 muestra células embebidas en perlas de alginato al cabo de tres meses.; estas células presentan formas redondeadas bi-refracción bajo un microscopio de luz invertida (Figura 1). Figura 2 muestra la localización de N-cadherina en células de adenoma de pituitaria de...
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Discusión
Este protocolo tiene varios pasos críticos. La primera es la homogeneidad del tamaño del grano, que se requiere para mantener las mismas condiciones de difusión de los nutrientes y gases en todo el cultivo de células. En nuestra experiencia, el uso de una aguja de 21 G para hacer las perlas de alginato permite la adquisición de una cultura eficiente de tamaño uniforme de talón. El segundo factor importante es la distancia desde la aguja; esta distancia debe ser no más de 5 cm de la solución de calcio para evitar perlas ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Sr. O. Ríos por su asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 199 medio de cultivo | Invitrogen | 31100-027 | Para la cultura, cálido en un 37 ° C baño de agua antes de usar |
| Suero fetal bovino | PAA | A15-751 | |
| Bicarbonato de sodio (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-hidroxietil) piperazina-N&agudo;-ácido -2etanosulfónico (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicilina/Estreptomicina | PAA | P11-010 | |
| PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Colagenasa tipo I | Worthington | 4176 | |
| Tripsina | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Research Organics | 3002E Inhibidor | |
| tripsina de sorbea | Invitrogen | 17075-029 | |
| ADNasa | Worthington | 2139 | |
| Ácido algínico, de Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Cloruro de calcio (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Citrato de sodio (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazina-N,N′-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polietilenglicol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Etileno ácido tetraacético glicol (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Sulfato de magnesio (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehído | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehído | Sigma | P6148 | |
| Cloruro de amonio (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Albúmina sérica bovina libre de IgG | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Faloidina – Tetrametilrodamina B isotiocianato | Sigma | P1951 | tóxico. Use guantes para manipular este reactivo |
| 4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidrocloruro (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Tóxico. Use guantes para manipular este reactivo |
| Ácido sulfúrico (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Altamente corrosivo. Use guantes para manipular este reactivo |
| Hidróxido de sodio (NAOH) | Merck | 1.06498 | Puede causar irritación de los ojos y la piel. Use guantes para manipular este reactivo |
| (3-aminopropil)trietoxisilano (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Hidrobromuro de poli-D-lisina | Sigma | P7280 | |
| Solución de azul de tripán | Sigma | T8154 | |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Equipment | Tóxico: Puede causar cáncer. Use guantes para manipular este reactivo | ||
| Rotador | Centrífuga Boekel Scientific | Modelo 230300 | |
| DuPont | Corporation | Modelo sorvall TC6 | |
| agitador | Instrumentos de línea de laboratorio | modelo 314-820 |
Referencias
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- Andersen, T., Strand, B., Formo, K., Alsberg, E., Christensen, B. Alginates as biomaterials in tissue engineering. Carbohydrate chemistry. Rauter, A. P., Lindhorst, T. K. Vol. 37, Royal Society of Chemistry. 227-258 (2012).
- Jonitz, A., et al. Differentiation capacity of human chondrocytes embedded in alginate matrix. Connect. Tissue. Res. 52 (6), 503-551 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. J. Designing scaffolds to enhance transplanted myoblast survival and migration. Tissue. Eng. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Purcell, E. K., Singh, A., Kipke, D. R. Alginate composition effects on a neural stem cell-seeded scaffold. Tissue. Eng. Part. C. Methods. 15 (4), 541-550 (2009).
- Wee, S., Gombotz, W. R. Protein release from alginate matrices. Adv. Drug. Deliv. Rev. 31 (4), 267-285 (1998).
- Tashjian, A. H. Jr Clonal strains of hormone-producing pituitary cells. Methods. Enzymol. 58, 527-535 (1979).
- Fasekas, I., et al. Characterization of human pituitary adenomas in cell cultures by light and electron microscopic morphology and immunolabeling. Folia. Histochem. Cytobiol. 43 (2), 81-90 (2005).
- Kohler, P. O., Bridson, W. E., Rayford, P. L., Kohler, S. E. Hormone Production by Human Pituitary Adenomas in Culture. Metabolism. 18 (9), 782-788 (1969).
- Kletzkky, O. A., Marrs, R. P., Rundall, T. T., Weiss, M. H., Beierle, J. W. Monolayer and suspension culture of human prolactin-secreting pituitary adenoma. Am. J. Obstet. Gynecol. 138 (6), 660-664 (1980).
- Melmed, S., Odenheimer, D., Carlson, H. E., Hershman, J. M. Establishment of functional human pituitary tumor cell cultures. In Vitro. 18 (1), 35-42 (1982).
- Thompson, K. W., Vincent, M. M., Jensen, F. C., Price, R. T., Schapiro, E. Production of hormones by human anterior pituitary cells in serial culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102 (2), 403-408 (1959).
- Cappabianca, P., Cavallo, L. M., Solari, D., Stagno, V., Esposito, F., de Angelis, M. Endoscopic endonasal surgery for pituitary adenomas. World neurosurg. 82 (6 Suppl), S3-S11 (2014).
- Aplin, J. Model Matrices for Studing Cell Adhesion. Measuring cell adhesion. Curtis, A. S. G., Lackie, J. M. , John Wiley & Sons. 110-111 (1991).
- Guiraud, J. M., et al. Human prolactin-producing pituitary adenomas in three-dimensional culture. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 27 (3), 188-190 (1991).
- Ma, H. L., Hung, S. C., Lin, S. Y., Chen, Y. L., Lo, W. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J. Biomed. Mater. Res. A. 64 (2), 273-281 (2003).
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Reimpresiones y permisos
