Modelado Quimioterapia Leucemia resistente<em&gt; In Vitro</em

Resumen

El presente informe resume un protocolo que se puede utilizar para modelar la influencia del nicho del microambiente de la médula ósea en las células leucémicas, con énfasis en el enriquecimiento de la subpoblación más quimiorresistente.

Resumen

Está bien establecido que el microambiente de la médula ósea proporciona un sitio único de santuario para las enfermedades hematopoyéticas que inician y progresan en este sitio. El modelo presentado en el presente informe utiliza células estromales primarias de médula ósea humana y osteoblastos como dos tipos de células representativas del nicho de la médula ósea que influyen en el fenotipo de las células tumorales. Las condiciones de cocultivo in vitro descritas para células leucémicas humanas con estos componentes de nicho primario apoyan la generación de una subpoblación de células tumorales quimiorresistentes que pueden recuperarse eficientemente del cultivo para su análisis mediante diversas técnicas. Un programa de alimentación estricto para evitar los flujos de nutrientes seguidos de la recuperación de partículas de dextrano reticulado (G10) en gel tipo 10 de la población de células tumorales que han migrado por debajo de las células estromales de la médula ósea adherentes (BMSC) u osteoblastos (OB), generando una población de células tumorales de "fase dim" (PD), proporciona una fuente constante de células leucémicas purificadas y resistentes a la terapia. Esta población clínicamente relevante de células tumorales puede evaluarse mediante métodos estándar para investigar las vías apoptóticas, metabólicas y reguladoras del ciclo celular, así como para proporcionar un objetivo más riguroso en el que probar nuevas estrategias terapéuticas antes de las investigaciones preclínicas dirigidas a la enfermedad residual mínima.

Introducción

El objetivo general del método descrito es proporcionar un enfoque in vitro eficiente y rentable que apoye la investigación de los mecanismos que subyacen a la supervivencia de las células leucémicas apoyadas en la médula ósea durante la exposición a la quimioterapia. Está bien documentado que las células tumorales residuales que sobreviven después del tratamiento contribuyen a la recaída de la enfermedad que a menudo es más agresiva que la del diagnóstico y que a menudo se trata de manera menos efectiva^1-8. Los modelos que incluyen células leucémicas aisladas, como los limitados al cultivo de células en medios solos, para probar enfoques terapéuti....

Protocolo

1. Preparación Avanzada

1. Preparación de partículas de dextrano del G-10.
   1. Preparar suspensión del G-10 mediante la adición de 50 ml de PBS 1x a 10 g de partículas del G-10. Mezclar por inversión y permitir que se asiente G10 de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 ° CO / N.
   2. El día del G10 separación en columna, aspirado de PBS a partir de partículas del G-10 se establecieron y añadir 50 ml de PBS. Mezclar por inversión. Repetir dos veces, añadiendo 50 ml de PBS a las partículas del G-10 se establecieron y se almacena a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
2. El cultivo de BMSC y OB.
   1. Mantener tanto BM....

Resultados

La configuración correcta y la cultura de este modelo de co-cultivo se traducirá en el establecimiento de 3 subpoblaciones de células leucémicas en relación con el adherente BMSC o OB monocapa. La Figura 1 muestra cómo todas las células sembradas en una monocapa BMSC aparecen inicialmente como una única población de suspendido células leucémicas. En el transcurso de 4 días las células leucémicas interactúan con el BMSC para formar 3 subpoblaciones espacial de las células.......

Discusión

enfermedad mínima residual (MRD) que contribuye a la recaída de la enfermedad sigue siendo un importante reto clínico en el tratamiento de refractario agresivo ALL, así como, una serie de otras enfermedades malignas hematológicas. El microambiente de la médula ósea es el sitio más común de recidiva en TODA ^3,8. Como tal, los modelos que modelan el microambiente de la médula ósea son herramientas vitales para poner a prueba hipótesis relacionadas con la supervivencia de las células tumorales de leucemia y mant.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
G10 cuentas de sephadex	Sigma	G10120	Referido en el manuscrito como tipo de gel 10 partículas de dextrano reticulado
10 ml jeringa estéril	BD	309604
Lana de vidrio	Pyrex	3950
llaves de paso de 1 vía	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml Productos	médicos mundiales	41021039	Utilizados como tubos de
recolección Tubos de centrífuga cónicos de 15 ml	médicos mundiales	41021037	Utilizado para la recolección de células
Suero fetal bovino	Sigma	F6178
0.05% Tripsina	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm Placas de cultivo celular	Greiner Bio-One	664160
Medios de cultivoMedios de
cultivo de osteoblastos	PromoCell	C-27001	Para medios de osteoblastos humanos
RPMI 1640 medios	Mediatech, Inc.	15-040	Para la preparación de medios tumorales
adherentes <
fuertes>:
PromoCell	C-12720	osteoblastos	humanos se cultivaron según el proveedor. s recomendaciones.
		estromales	de leucemia humana y médula ósea (BMSC) fueron proporcionadas por el Centro de Procesamiento de Biomuestras del Centro Oncológico Mary Babb Randolph (MBRCC) y el Banco de Tejidos del Departamento de Patología de la Universidad de Virginia Occidental. Los cultivos de BMSC se establecieron como se describió anteriormente (*)
:
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	Las células REH se cultivaron según el proveedor. recomendaciones y medios recomendados.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 se cultivaron de acuerdo con el proveedor' recomendaciones y medios recomendados.
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Alteración de la función de las células estromales de la médula ósea por etopósido. Trasplante de médula sanguínea Biol J Am Soc Trasplante de médula sanguínea. Agosto de 1997; 3(3):122–32.

Productos Los Las células primarias