El objetivo de este protocolo es evaluar la especificidad de los medicamentos contra el cáncer in vitro utilizando cultivos mixtos que contienen células tumorales tanto y no tumorales.
Artículo de método
La especificidad de la evaluación de Medicamentos contra el cáncer
En este artículo
Resumen
Resumen
Un procedimiento para evaluar la especificidad de medicamentos contra el cáncer in vitro utilizando cultivos que contienen células tanto tumorales y no tumorales se demuestra. El elemento clave es la determinación cuantitativa de una alteración genética específica de tumor en relación con una secuencia universal, usando un ensayo de PCR digitales de doble sonda y el posterior cálculo de la proporción de células tumorales. El ensayo se lleva a cabo en un cultivo que contiene células tumorales de una línea establecida y enriquecida en células no tumorales. El cultivo mixto es tratado con un fármaco de ensayo a diversas concentraciones. Después del tratamiento, el ADN se prepara directamente a partir de las células adhesivas sobrevivido en pocillos de placas de 96 pocillos usando un método simple y de bajo costo, y se sometió a un ensayo de PCR digital dual de la sonda para la medición de una alteración genética específica de tumor y una secuencia de referencia Universal . En la presente demostración, una deleción heterocigota del gen NF1 se utiliza como la alteración genética específica del tumor yun gen RPP30 como el gen de referencia. Usando la relación NF1 / RPP30, se calculó la proporción de células tumorales. Puesto que el cambio dependiente de la dosis de la proporción de células tumorales proporciona una indicación in vitro de la especificidad del fármaco, este ensayo genético y basado en células in vitro es probable que tenga potencial de aplicación en el descubrimiento de fármacos. Además, para el cuidado personalizado del cáncer, esta herramienta genético-y basado en células puede contribuir a la optimización de la quimioterapia adyuvante por medio de probar la eficacia y la especificidad de los fármacos candidatos utilizando cultivos primarios de tumores individuales.
Introducción
Los efectos terapéuticos de los medicamentos contra el cáncer en las células tumorales se asocian con varios efectos tóxicos no deseados en las células no tumorales. Los efectos tóxicos son difíciles de evaluar en el laboratorio, en gran parte debido a la falta de herramientas adecuadas1. Los cultivos celulares que contienen células tumorales y no tumorales proporcionarían un recurso potencial in vitro para evaluar la especificidad o selectividad de un fármaco, lo que puede arrojar luz sobre la toxicidad clínica. Sin embargo, los ensayos in vitro convencionales, como los ensayos de proliferación o viabilidad, miden el efecto de un fármaco en las células totales, pero no pueden dividir el efecto en una parte sobre las células tumorales y una parte sobre las células no tumorales. Por ejemplo, una reducción del 50% del número total de células en un cultivo compuesto por un 50% de células tumorales y un 50% de células no tumorales puede implicar la muerte de todas las células tumorales, la muerte de todas las células no tumorales o, más probablemente, la muerte de partes de ambas en diversas proporciones.
También debido a este problema técnico, los cultivos primarios que contienen células estromales tumorales y no tumorales son frecuentemente inadecuados para probar fármacos. Por otro lado, debido a esta heterogeneidad celular, los cultivos primarios se parecen mucho mejor a sus tumores originales que las células clonalesen líneas celulares establecidas. Más importante aún, los cultivos primarios son específicos del paciente y pueden permitir la realizaciónindividualizada de pruebas de drogas 2-4.
Por lo tanto, una cuestión esencial es el desarrollo de un método para determinar la proporción de células tumorales en cultivos mixtos, incluidos los cultivos primarios. Frente a este reto, se concibió una solución genética que se basa en la determinación de la relación cuantitativa de una característica genética específica de un tumor con respecto a una secuencia de referencia universal. A partir de esta proporción, se puede calcular la proporción de células tumorales en un cultivo mixto.
Este estudio ilustra el procedimiento de la herramienta genética y celular para evaluar la especificidad de los medicamentos contra el cáncer, incluyendo (1) la preparación de un cultivo mixto a partir de células tumorales de una línea establecida y fibroblastos no tumorales, (2) el tratamiento del cultivo mixto con un fármaco de prueba, (3) la preparación del ADN para la PCR digital, (4) la determinación de la proporción de una deleción heterocigota específica del tumor con una secuencia de referencia utilizando un ensayo de PCR digital de gotas de doble sonda, (5) calcular las proporciones de células tumorales en cada concentración de fármaco y (6) elaborar el cambio de proporción de células tumorales dependiente de la dosis.
Protocolo
1. Preparación de la mezcla de cultivo que contiene las células tumorales y células no tumorales
- Utilizar las células tumorales de una línea celular establecida TMVNP S462 5. Usa los fibroblastos como las células no tumorales 6,7
- Cultura tanto células tumorales y fibroblastos en medio estándar DMEM con 10% de suero fetal bovino (BSA), glutamina 3 mM, 0,1 mM 2-mercaptoetanol, 500 U / ml de penicilina, 500 g / ml de estreptomicina y piruvato de sodio 1 mM a 37 ° C y 5% de CO 2 5-7. En sub-confluencia, cosechar las células con tripsina al 0,05% y contarlos utilizando un hemocitómetro.
- Mezclar 400 células tumorales y 1.600 células no tumorales juntos en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos en 0,2 ml de medio. Teniendo en cuenta el crecimiento más rápido de las células tumorales durante el periodo de tratamiento de 5 días, la proporción inicial de las células tumorales se fijó en 25%. Configurar 4 repeticiones para cada concentración de fármaco. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 O / N.
2. Drug Tratamiento
- Utilice nilotinib como el fármaco de prueba. Preparar soluciones madre de nilotinib 0, 2, 4 y 20 mM en DMSO. Diluir cada uno de ellos por 200 veces en 5 ml de medio DMEM, dando 2-plegado de drogas soluciones concentradas de 0, 10, 20 y 100 mM 6,7.
- Retirar 0,1 ml de medio de cada pocillo y añadir 0,1 ml de medio que contiene fármaco. Las concentraciones finales son 0, 5, 10 y 50 mM. Continuar la incubación de las células en medio que contenía fármaco durante 5 días.
- Al final del tratamiento, inspeccionar las células unidas utilizando un microscopio de contraste de fase y tomar fotos. Aspirar el medio de distancia, se lavan las células adhesivas sobrevivido una vez con 0,2 ml de PBS.
3. Preparación de ADN para PCR Digital
- Lisar las células utilizando HotShot 8.
- Añadir 50 l solución de lisis alcalina (NaOH 25 mM, EDTA 0,2 mM) a cada pocillo. Sellar los pozos con papel de aluminio. Incubar la placa a 95 ° C en un horno o en una placa de calentamiento durante 30 min. Compruebe debajo de un microscope para asegurarse de que no hay más células intactas permanecieron en la superficie de los pozos. En caso de que las células no se lisan por completo, aumentan el tiempo de calentamiento o añadir detergente. Congelarlos una vez a -20 ° C aumenta también romper las células.
- Añadir 50 l de solución (40 mM Tris-HC, pH 4,0) a cada neutralizantes también. Transferir todos los lisados en forma de U pocillos de una placa de PCR y se seca en un ciclador de PCR a 95 ° C durante 10 a 30 min. Reconstituir los lisados con 20 l de agua destilada.
- Desalar mediante diálisis Drop-9
- utilizar filtros de membrana con tamaño de poro promedio 0.025 micras.
- Flotar el filtro en agua destilada con la parte brillante hacia arriba en pocillos de una placa de 12 pocillos. Mojar el filtro durante 5 minutos. Prestar atención para evitar burbujas de aire entre el filtro y el agua.
- Pipetear los lisados reconstituidas de cada muestra de la etapa 3.1.4 cuidadosamente sobre cada una de las 4 zonas de filtro. Cubrir la placa y se dializa durante 30 a 60 min.
- Succionar el agua debajo del filtro, sin voltear sobre el filtro ni perturbar las gotas.
- Transferir el lisado gotas en los pocillos de una nueva placa de PCR-. Secar las ADN-gotas por calentamiento a 95 ° C durante 10 a 30 min en un ciclador PCR. Reconstituir los lisados en 10 l de agua.
4. La PCR digital
- Descongele componentes tales como el ADN, tampón y la mezcla de ensayo a temperatura ambiente, dejen de girar durante 10 segundos a máxima fuerza centrífuga de cualquier disponible (por ejemplo, VWR minicentrifugadora) y luego mantenerlos en hielo.
- Preparar la mezcla madre que contiene todos los componentes excepto el ADN (Tabla 1). Considere volumen muerto y calcular mezcla maestra aproximadamente un 10% más de la cantidad requerida.
NOTA: Utilice los cebadores y sondas utilizadas en el kit comercial. - Vórtice la mezcla maestra, centrifugar durante 10 segundos a máxima fuerza centrífuga de cualquier disponible (por ejemplo, VWR minicentrifugadora) y prescindir de 15 l a cadapocillo de una placa de 96-PCR. Añadir todos lisado (que contiene ADN) de cada muestra a los pocillos que contienen la mezcla principal. Transferencia de 20 l de cada mezcla de reacción en un pozo en el lado de la muestra de un cartucho a TA.
- Prescindir de 70 l de aceite de generador de gotas en cada pocillo de aceite en el lado de un cartucho. Cierre el cartucho con la junta y colocar toda la configuración en un generador de gotas. Iniciar la generación de gotitas.
- Transferencia de 40 l de gota solución en pocillos de una placa de PCR de 96 pocillos. Sellar la placa con papel de aluminio y colocar la placa en un termociclador de PCR. Establecer la tapa-temperatura a 105 ° C y velocidad de rampa a 2 ° C / seg. Llevar a cabo la PCR utilizando los ajustes en la Tabla 2. Después de la PCR, la transferencia de la placa en un lector de gota y empieza a leer. Alternativamente, la placa de almacenar a 4 ° C durante un máximo de 24 horas.
5. El cálculo de la proporción de células tumorales
- Cargar los datos de PCR digital y realizar analys automáticoses.
- Control de los resultados de cada ensayo de forma manual mediante la inspección de la distribución unidimensional y 2-dimensional de las gotitas de positivos y negativos, y asegurarse de que están bien separados y las líneas de umbral estaban en las posiciones correctas. Excluir resultados no satisfacen los criterios, por ejemplo, hay una clara separación de las gotitas positivos y negativos, de los nuevos análisis. Copiar la relación NF1 / RPP30 resultante en una hoja de Excel.
- Calcular la proporción de células tumorales como: 2 x (1- NF1 / RPP30).
Cambio 6. dependiente de la dosis de la proporción de células tumorales
- Para cada fármaco-concentración, calcular la media y la desviación estándar de las 4 repeticiones. Trazar los medios y las desviaciones estándar contra el dopaje concentraciones.
Resultados
Calidad de ADN preparado mediante el HotShot combinado / Drop-La diálisis es suficiente para digital PCR satisfactoria (Figura 1B). Para 2.000 fibroblastos, se obtuvieron aproximadamente 3.000 ± 500 gotitas positivos, que corresponde a 75% de los esperados 4.000 copias (dos copias en una célula). En este estudio, las células tumorales fueron de una línea establecida MPNST S462 que se sabe que tienen una deleción heterocigota del gen NF1 5. Esta reducción de la dosis del gen 50% se detectó claramente por el ensayo de PCR digital de doble (Figura 1B). Por el contrario, se midieron dos copias de este gen en los fibroblastos. Esta diferencia genética entre las células tumorales y no tumorales permite el cálculo de la proporción de células tumorales en cultivos mixtos (Figura 2). Mediante la medición de la dosis génica relativa de NF1 a RPP30, la proporción de células tumorales en un cultivo mixto puede determinarseen cada fármaco-concentración (Figura 3).
Figura 1. PCR digital. (A) ilustración del principio. (B) un ensayo de doble sonda revela una cantidad reducida de un gen diana (NF1) en las células tumorales TMVNP S462 en relación con un gen de referencia (RPP30). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Proporción Calculado de células tumorales. Las células tumorales y no tumorales células se mezclaron en diversas proporciones y se sembraron en cada pocillo de una placa de 96. Después de la unión O / ingenio N, las células se lisaronh HotShot / Drop-diálisis y los lisados desaladas se sometieron a PCR digital que dio la relación de NF1 / RPP30. La base en esta relación, se calculó la proporción de células tumorales en cada pocillo. La media y la desviación estándar de la proporción de las células tumorales se calculó a partir de 4 réplicas en cada proporción configuración. Las proporciones calculadas de las células tumorales (eje Y) se representaron frente a las proporciones de puesta a punto (eje X). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. cambio de dosis-dependiente de la proporción de células tumorales. (A) dependiente de la dosis la reducción de las células vitales visibles. (B) la proporción de las células tumorales (media y desviación estándar de 4 réplicas) calculada a partir de la relación de NF1: RPP30, disminución en el rango de 0 - 10 mM. En la dosis más alta de 50 mM, se dejaron pocas células vitales, probablemente debido al efecto tóxico de todas las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 4. Separación de respuesta de las células tumorales de la de las células no tumorales (A) la viabilidad y / o proliferación de células totales se puede medir usando ensayos convencionales; Proporción de células tumorales se puede determinar usando el procedimiento demostrado en el presente estudio. (B) utilizando los dos parámetros, la respuesta del total de células en un cultivo mixto a un fármaco puede ser dividido en respuesta de las células tumorales y la respuesta de las células no tumorales..com / archivos / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 1 Reacción | ||
| 2 x ddPCR supermix | 12 | |
| mezcla de ensayo para NF1 | 1.2 | |
| mezcla de ensayo para RPP30 | 1.2 | |
| HaeIII | 0,6 | |
| Total parcial | 15 | mezcla maestra |
| ADN | 9 | |
| Total | 24 | Final de mezcla de PCR |
Tabla 1 Configuración Dual ddPCR Reacción
| Paso | Acción | Temperatura | Hora | ciclos |
| 1 | Polymborrar la activación | 95 ° C | 10 minutos | 1 |
| 2 | desnaturalización del ADN | 94 ° C | 30 segundos | 40 |
| 3 | El recocido / exetension | 60 ° C | 1 minuto | |
| 4 | desactivación de la polimerasa | 98 ° C | 10 minutos | 1 |
| 5 | Hold (opcional) | 4 ° C |
La Tabla 2 Configuración Cycler PCR
Discusión
El paso clave en esta herramienta genético-y basado en células para la evaluación de especificidad fármaco in vitro es la determinación de la proporción de las células tumorales utilizando una o más características genéticas específicas de tumor. En contraste con características fenotípicas convencionales 7, las características genéticas son específicos, estable y fácil de cuantificar. Por ejemplo, una variación mutación o el número de copias específico de tumor está presente exclusivamente en las células tumorales pero no en células no tumorales. un estigma genético de este tipo puede ser fiable y precisa cuantificada, por ejemplo, usando PCR digital como se demuestra en este estudio.
Para la PCR digital, de alta pureza de ADN no es esencial. Sin embargo, la desalinización y la eliminación de moléculas inhibidoras son necesarios que se puede lograr por una caída de la diálisis usando un filtro adecuado. La lisis y la caída de la diálisis combinado es simple y rápido, no requiere instrumentos especiales y por lo tanto puede llevarse a cabo en cualquier laboratorio estándar. Si las células no break bien, el tratamiento adicional puede ser considerada como la congelación de las células a -20 ° C, la adición de detergente o / y el uso de la proteasa.
En el presente estudio, se utilizó la deleción heterocigota del gen NF1 como la característica específica de tumor para la cuantificación. Del mismo modo, las deleciones de otros genes o loci también se pueden utilizar. Además, las mutaciones también se pueden utilizar para la cuantificación de células tumorales. En tal caso, los ensayos de PCR digitales para el mutante y los alelos normales necesitan ser ampliamente validado para asegurar su especificidad para cada uno de ellos.
proporción dependiente de la dosis de las células tumorales proporciona una indicación para el fármaco-especificidad o selectividad. Además, también permite la extracción de la respuesta de las células tumorales a partir de la respuesta del total de células de un cultivo mixto a un fármaco (figura 4). Esta estrategia de extracción proporciona una solución para el problema técnico en el uso de cultivos primarios (que contiene tanto tumor y nocélulas n-tumor) para pruebas de drogas.
El genético-y basados en células in vitro herramienta demostrado en el presente estudio, por tanto, pueden tener un potencial de aplicación (1) en el descubrimiento de medicamentos donde proporciona una plataforma para evaluar la especificidad o selectividad de drogas in vitro y (2) en la atención personalizada del cáncer donde permite a los fármacos de ensayo en cultivos primarios y por lo tanto pueden contribuir a la selección de drogas en la quimioterapia adyuvante 4. Por otra parte, el mecanismo farmacológico de un medicamento puede ser estudiada usando esta herramienta, ya que cierta alteración genética o alteraciones genéticas múltiples pueden ser seguidos durante el tratamiento con fármaco.
Una dificultad en el uso de cultivos primarios individualizadas es la falta una característica genético universal para la cuantificación de las células tumorales. Sin embargo, con el avance de hoy en la secuenciación de todo el genoma, los genes y las regiones más frecuentemente alterados son conocidos por tumores comunes. Por ejemplo, entre la cabeza y el cuellotumores, 71%, 23% y 22% tienen mutaciones en el gen TP53, FAT1 y genes CDKN2A, y el 60%, 34% y 26% tienen deleciones en las regiones de genes de CDKN2A, STK11 y PTEN, respectivamente 10. Screening 5 a 10 tales genes o / y regiones por medio de la secuenciación dirigida y / o PCR digital tanto, es probable identificar una o más alteraciones genéticas que se pueden usar para la cuantificación de células tumorales en el cultivo primario derivada. Otra limitación es la cantidad a menudo insuficiente de tumores resecados para el establecimiento de cultivos primarios.
A pesar de las características ventajosas y su potencial aplicación prometedora de la genético-herramienta y en vitro basados en células, sus limitaciones se deben tener en mente y su naturaleza in vitro deben ser resaltados. Por ejemplo, los efectos diferenciales o la citotoxicidad de un fármaco sobre las células tumorales puede más bien debido a la diferencia en los tipos de células (fibroblastos en comparación con las células de Schwann) o sudiferentes orígenes (de diferentes individuos). El efecto más fuerte de un fármaco sobre las células tumorales que en células no tumorales también puede explicarse por el hecho de que el primero crecen más rápido que el segundo. Lo más importante, las células en el comportamiento in vitro difieren de las células en el cuerpo humano y, en consecuencia, los resultados de la evaluación in vitro a menudo no o sólo parcialmente reflejan la situación clínica real. Por lo tanto, la eficacia, la citotoxicidad y especificidad de los medicamentos obtenidos para las células cultivadas son más bien de naturaleza biomarcador, pero no tienen la fiabilidad de la eficacia preclínica medido de antibióticos. Sin embargo, al pasar de líneas celulares a cultivos mixtos y / o cultivos primarios es un paso adelante en la evaluación de medicamentos de efecto y la especificidad / selectividad in vitro. Con grandes esfuerzos, en condiciones in vitro se puede encontrar que permite correlación razonable de los datos in vitro con las respuestas reales de los pacientes, al menos para algunos medicamentos.
Divulgaciones
El procedimiento está protegido por patente (10 2013 221 452, Alemania)
Agradecimientos
La señora Alster, el Sr. Honrath y el Dr. Jiang son apreciados por su excelente asistencia técnica. También aprecia es el Dr. Volz y el grupo de investigación del Dr. Dandri para proporcionar el acceso a su dispositivo digital PCR.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Filtro de membrana de 25 mm de diámetro | Merk-Millipore | VSWP 02500 | Para diálisis en gota |
| Ensayo ddPCR para NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | |
| Ensayo ddPCR marcado con FAM para RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | |
| HEX QX200 | BioRad | 186-4001 | En el estudio se utilizó la versión anterior QX, que ya no está disponible. El reemplazo es QX200 |
| Aceite de gotas | BioRad | 186-3005 | |
| Cartriges | Juntas BioRad | 186-3004 | |
| BioRad | 186-3009 | ||
| Soporte para cartiras | BioRad | 186-3051 | |
| Lámina perforable | BioRad | 181-4040 |
Referencias
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