Abstract
Este protocolo descreve o procedimento cirúrgico para suínos instrumento cronicamente eo procedimento para exercer suína em uma escada rolante motorizado. disfunção cardiopulmonar precoce é difícil de diagnosticar, especialmente em modelos animais, como função cardiopulmonar é frequentemente medida invasiva, exigindo anestesia. Como muitos agentes anestésicos são cardiodepressive, mudanças sutis na função cardiovascular pode ser mascarada. Em contraste, a instrumentação permite que crónica para medição da função cardiopulmonar no estado de vigília, de modo que as medições possam ser obtidas sob condições de repouso tranquilas, sem os efeitos da anestesia e trauma cirúrgico aguda. Além disso, quando os animais são adequadamente treinados, as medições podem também ser obtidos durante graduada exercício em esteira.
sondas de fluxo são colocados ao redor da aorta ou artéria pulmonar, para a medição do débito cardíaco e ao redor da artéria descendente anterior coronária para a medição de coronfluxo sanguíneo ary. cateteres cheios de fluido são implantados na aorta, artéria pulmonar, átrio esquerdo, ventrículo esquerdo e do ventrículo direito para medição de pressão e recolha de amostras de sangue. Além disso, um cateter de 20 G está posicionado na veia interventricular anterior para permitir amostragem de sangue venoso coronário.
Após uma semana de recuperação, suína são colocados em uma escada rolante com motor, os cateteres são conectados aos medidores de pressão e fluxo, e os suínos são submetidos a um de cinco estágios protocolo de exercício progressivo, com cada estágio com duração de 3 min. sinais hemodinâmicos são continuamente gravadas e amostras de sangue são tomadas durante os últimos 30 segundos de cada estágio de exercício.
A principal vantagem de estudar animais cronicamente instrumentadas é que ele permite a avaliação de série da função cardiopulmonar, não só em repouso, mas também durante o esforço físico, tais como exercício. Além disso, a função cardiopulmonar pode ser avaliada repetidamente durante a doença o desenvolvimento de umaND durante o tratamento crónico, aumentando, assim, poder estatístico e, consequentemente, limitar o número de animais necessários para um estudo.
Introduction
Função cardiopulmonar adequada é essencial para abastecer o corpo com oxigênio e nutrientes, particularmente durante condições de aumento da demanda metabólica, como durante o exercício 1. A resposta cardiopulmonar para exercício é caracterizada por um número de adaptações em função cardíaca, por exemplo., Um aumento na taxa de coração, contractilidade e acidente vascular cerebral volume e função microvascular, ou seja, a vasodilatação nos leitos vasculares que fornecem músculos que exercem, assim como na pulmonar vasculatura, e vasoconstrição nos leitos vasculares que abastecem o sistema gastrointestinal, bem como músculos inactivos 1. Capacidade de exercício diminuída é uma característica precoce de disfunção cardiopulmonar e teste cardiopulmonar é usado como um método eficaz para delinear entre a disfunção cardíaca, disfunção vascular e / ou disfunção pulmonar em pacientes com capacidade de exercício diminuída 2. disfunção cardiopulmonar início é difficult para diagnosticar, particularmente em modelos animais, como função cardiopulmonar é frequentemente medido de forma invasiva, requerendo anestesia, com muitos agentes anestésicos possuindo propriedades cardiodepressive 3.
instrumentação crônica permite a medição da função cardiopulmonar no estado acordado, e quando os animais estão totalmente ajustados às medições condições de laboratório podem ser obtidos em condições de repouso tranqüilo, sem os efeitos da anestesia e trauma agudo cirúrgico. Além disso, quando os animais são adequadamente formados, as medições podem também ser obtidos durante a esteira graduada exercício 4,5. Mais especificamente, para a esquerda e função ventricular direita pode ser avaliada e relacionada com a perfusão miocárdica, enquanto a regulação do tônus vasomotor na microcirculação coronária, sistêmica e pulmonar pode ser determinada. A utilização de cateteres cheios de líquido permite a medição da pressão, bem como de amostras de sangue que se verifica sem a imposição de anúncioestresse adicional sobre o dos animais. Outra vantagem de se estudar animais cronicamente instrumentadas é que o teste cardiopulmonar pode ser repetido permitindo que a utilização de um animal como o seu próprio controlo, tanto durante o desenvolvimento da doença ou durante o tratamento crónico, aumentando, assim, poder estatístico e, consequentemente, limitar o número de animais necessários para um estudo .
Cardiopulmonar anatomia de suínos é bastante semelhante à dos seres humanos e é possível induzir vários tipos de doença cardiopulmonar, tais como diabetes 6, 7, enfarte do miocárdio, hipertensão pulmonar 8,9 e insuficiência cardíaca induzida por estimulação 10,11. Além disso, o tamanho de instrumentação permite suína crónica, e a amostragem de sangue repetidas de quantidade suficiente para analisar não apenas gases de sangue, mas também para realizar medições de neuro-humorais e / ou para pesquisar biomarcadores da doença.
Este protocolo descreve a cirurgia usadas para crónicaly suína instrumento, bem como o protocolo para o exercício do suína em uma escada rolante motorizado.
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Protocol
Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pela Comissão de Cuidados com Animais em Erasmus Medical Center Rotterdam (NL). Suínos com pesos entre 6 e 80 kg foram instrumentados com sucesso usando esse protocolo.
1. adaptação dos animais ao manuseio humano
- Após a chegada na instalação, abrigar os animais solitariamente, mas permitir que interajam uns com os outros.
- Accustomize suína à manipulação humana e transporte do biotério para o laboratório experimental, pela manipulação do animal, pelo menos uma vez por dia durante uma semana.
- Treinar os animais de forma adequada para experiências de exercício em uma esteira motorizada de exercitando-os na esteira por um mínimo de três vezes antes da cirurgia.
- Os animais devem estar em jejum O / N antes da cirurgia para prevenir náuseas, vómitos e assim o potencial de aspiração de fluidos estomacais.
2. preparação para a cirurgia
- sedação
- Prepare medicamento para sedação em uma seringa de 10 ml. A pré-medicação consiste de tiletamina / zolazepam (5 mg / kg), xilazina (2,25 mg / kg) e atropina (1 mg).
- Injectar a intramuscular medicação no músculo trapézio com um 19 G 1.5 '' agulha para sedar o porco.
- Esperar por cerca de 10 minutos e verifique se o relaxamento muscular e perda de consciência para confirmar nível adequado e estável de sedação.
- Coloque um cateter de segurança periférica 20 G numa veia da orelha para administração intravenosa subsequente de anestesia e / ou fluidos.
- Intubação e ventilação
- Colocar o animal em uma mesa e / ou de bonde em posição supina.
- Abra a boca do animal com um propagador oral.
- No caso de relaxamento insuficiente das mandíbulas ou presença de reflexos de engolir, que dificultam a intubação, administrar tiopental (10 mg / kg) por via intravenosa através do cateter da veia da orelha. Alternativamente, o porco pode ser mascaradocom isoflurano para induzir sedação.
- Use um laringoscópio convencional com um uma lâmina Miller luz e para permitir que o laryngoscopist para visualizar diretamente a laringe. Se houver laringoespasmo, aplicar lidocaína a 2% para os fios e laringe para reduzir o espasmo e permitir a intubação.
- Inserir um estilete intubating para dentro do tubo endotraqueal para fazer o tubo conformar-se melhor à anatomia das vias aéreas superiores e passar o tubo através da boca e entre as cordas vocais na traqueia.
- Inflar o manguito balão com uma seringa de 10 ml para ajudar a fixá-lo no lugar, para evitar fugas de gases respiratórios, e para proteger as vias respiratórias de uma possível aspiração de líquido do estômago.
- Ligue o tubo a um (permutador de calor e humidade) filtro de respiração e ao ventilador mecânico.
- Colocar o animal em seu lado direito na mesa cirúrgica.
- Para alcançar níveis de pO2 de 100-120 mmHg, ventilar o animal com uma mistura de oxigênio e nitrogênio (1: 2 v / v), using as seguintes configurações do ventilador: modo de controle de pressão: pressão expiratória final positiva (PEEP) de 4 cm H 2 O; pressão inspiratória pico de 16-18 cmH 2 O; frequência, dependendo do tamanho do animal a respirar (para um animal de 20 kg, diminuir a frequência com o aumento do peso corporal), este deve resultar em um volume corrente de ~ 10 mL / kg, monitorizar a ventilação com capnografia.
- Monitorar a temperatura usando um termômetro retal e manter a temperatura entre 37-39 ºC utilizando uma lâmpada de calor ou calor mat. Além disso, monitorar a freqüência cardíaca com eletrocardiografia.
- Anestesia
- Induzir e manter anestesia de preferência por adição de 2,0% de isoflurano (v / v) para o gás mistura-ventilação ou, alternativamente por administração intravenosa de fentanilo (10 ug / kg / h) através do catéter da veia da orelha.
- Verifique a profundidade adequada da anestesia, testando os reflexos da dor com uma pitada perna dedo do pé traseiro antes de iniciar a cirurgia. Quando necessário, adicioneanestesia adicional ou esperar por alguns minutos. Verifique reflexos dor regularmente durante toda a cirurgia.
- Líquidos e Antibióticos
- Administrar a primeira dose de amoxicilina (25 mg / kg) por via intravenosa através do cateter da veia da orelha.
- Conectar um sistema de transfusão para o cateter da veia da orelha para permitir a infusão lenta de glicose a 10% (500 ml) durante a cirurgia.
- Esterilização de Sítio Cirúrgico
- Raspar e limpar a pele do animal por uma área de aproximadamente 25 cm de largura a partir da coluna vertebral até à axila esquerda.
- Esfregar a pele hidratada com esfrega iodopovidona (75 mg / ml) durante aproximadamente 5 min.
- Remover o sabão povidona-iodo a partir da pele com gazes esterilizadas molhadas, antes da esterilização a pele com loção povidona-iodo (100 mg / ml).
- Cobrir o animal com campos cirúrgicos estéreis para reduzir a transferência de bactérias e subsequente contaminação do sítio cirúrgico.
3. Cirurgia
- Abrindo a Thorax (toracotomia)
- Realizar uma incisão na pele, a partir de 1 centímetro caudal em relação ao ângulo inferior esquerdo da escápula para baixo para a axila esquerda (Figura 1). Use diatermia para cauterizar os vasos sanguíneos na pele para prevenir o sangramento excessivo.
- Cortar o músculo serrátil e músculo peitoral maior, utilizando a modalidade de corte da diatermia. Também usar diatermia para cauterizar os vasos sanguíneos na camada muscular para evitar o sangramento excessivo.
- Use dissecção romba para dividir cuidadosamente o músculo intercostal do quarto espaço intercostal esquerdo com uma braçadeira de mosquito. Agora, a superfície costal do pulmão esquerdo coberto com a pleura visceral e parietal deve ser exposto.
- Para entrar na cavidade pleural, perfurar cuidadosamente ambas as camadas da pleura e rasgá-los abertos.
- Usar um afastador torácica para separar as bordas da ferida e as costelas e para conduzir vigorosamente tecidospara além de se obter uma boa exposição da cavidade pleural.
- Afastar o pulmão esquerdo na direção caudal e mantê-lo no lugar com uma gaze molhada. Agora o coração e grandes vasos devem ser claramente expostos.
- Colocação de cateteres e fluxo de sondas (Figura 1)
- Use dissecção romba para remover ~ 2 cm2 do tecido conjuntivo em torno da aorta torácica descendente.
- Executar uma sutura em bolsa, que consiste em três pontos, na parede da aorta com um USP3-0 sutura trançada de seda não absorvível (Ø0.2 mm).
- Penetrar a parede do vaso da aorta com o aço de 16 agulha G inoxidável no meio da sutura em bolsa.
- Insira a ponta do cateter cheio de líquido (até que o anel) para a aorta, puxar a sutura em bolsa com firmeza e amarre as duas cadeias da sutura.
- Para manter o cateter no lugar, enrole o fio de sutura 3 vezes ao redor do cateter acima do anel e novamente tou seja, as duas cadeias da sutura. Além disso proteger o cateter com um novo ponto de aproximadamente 1 cm cranial do local de inserção.
- Ligue o cateter cheio de fluido para o transdutor de pressão calibrada, que está ligado ao computador, para monitorizar a pressão arterial média durante a cirurgia. Obter um gás de sangue arterial para verificar ou ajustar para as configurações de ventilação corretos.
- Abra o pericárdio com um corte cruzado. Esteja ciente para manter o nervo frênico que corre ao longo do pericárdio intacto.
- Identificar a artéria pulmonar e puxe-o ligeiramente no sentido caudal com uma válvula Farabeuf. Agora, a aorta ascendente e arco aórtico deve ser exposto. Monitorizar a pressão arterial média enquanto que a retracção da artéria pulmonar.
- Fazer um pequeno corte (~ 1 cm) no tecido conjuntivo entre a aorta ascendente e da artéria pulmonar com uma tesoura Metzenbaum, para ser capaz de dissecar quer a aorta ascendente ou da artéria pulmonar com uma grande curvaBraçadeira de mosquitos para colocar a sonda de fluxo.
- Coloque a banda de borracha da sonda de fluxo em torno do vaso. Para tornar mais fácil este, colocar um fio de sutura através de uma extremidade da banda de borracha, colocar este fio de sutura em torno do vaso e puxá-lo até que a banda de borracha rodeia o navio.
- Fixe o dispositivo de medição de sonda de fluxo na faixa de borracha. Ligue a sonda de fluxo para o computador e verificar o sinal de débito cardíaco no computador para confirmar a colocação correta da sonda de fluxo.
- Coloque cateteres cheios de fluido na artéria pulmonar, do ventrículo direito, ventrículo esquerdo e do átrio esquerdo da mesma maneira como descrito para o cateter cheio de fluido aórtica (3.2.2 - 3.2.5). Note-se que não é necessário para remover o tecido conjuntivo antes de executar uma sutura em bolsa nestas estruturas.
- Exponha dissecar e a parte proximal da artéria coronária descendente anterior da artéria coronária, levantando primeiro o tecido com uma pinça e fazendo um pequeno (2-3 mm) cortado com tesoura Metzenbaum, Seguido por provocações cuidadosamente o tecido afastado da artéria com um cotonete. Certifique-se de dissecção completa da artéria coronária por meio de um pequeno grampo de mosquito em ângulo reto baixo.
- Fazer um ponto paralelo à veia coronária interventricular anterior com um fio de sutura, o qual está ligado ao cateter venoso coronário.
- Punção da veia coronária com a agulha de 20 G do cateter venoso coronário e inserir a cânula do cateter por via intravenosa.
- Remova a agulha e prenda o cateter com o ponto já realizado (3.2.14). Além disso fixar o cateter com um novo ponto de aproximadamente 1 cm a partir do local de punção inicial.
- Coloque a sonda de fluxo coronário em torno da anterior esquerda previamente dissecada artéria coronária descendente. Quando a artéria é constrito e é dificilmente visível, usar lidocaína 10% de pulverização para relaxar o vaso para obter uma melhor exposição do navio. Verificar o sinal do fluxo coronário no computador para confIRM um posicionamento correcto da sonda de fluxo (Figura 2).
- tunneling
- Túnel as sondas de fluxo individualmente através do terceiro espaço intercostal esquerdo, abaixo do músculo e acima da nervura usando um grande braçadeira mosquito curvo.
- Túnel os cateteres cheios de fluido, quer através do terceiro ou do quinto espaço intercostal esquerdo, perfurando o músculo intercostal. Braçadeira fora dos cateteres cheios de líquido e remova a torneira de três vias para minimizar a área de piercing e evitar o vazamento dos cateteres cheios de líquido durante o tunelamento.
- Fixar as sondas de fluxo e os cateteres cheios de líquido com não-absorvível de seda trançada USP2-0 (Ø0.3 mm) por meio de uma sutura em bolsa no músculo intercostal. Esta sutura também serve para evitar fugas de ar após a re-estabelecendo a pressão negativa intratorácica.
- Adicione três incisões na pele aproximadamente 2 cm de sinistro e paralelas à coluna vertebral, aproximadamente 3 cm decomprimento de 3 cm de distância um do outro.
- Perfurar um trocarte sob o latissimus dorsi músculo esquerdo do local da incisão rostral para as incisões nas costas. Túnel as sondas de fluxo e cateteres fluido para a parte de trás dentro deste trocarte.
- Coloque as torneiras nos cateteres cheios de líquido e retirar a braçadeira. Retirar sangue para remover coágulos e bolhas de ar e encher os cateteres cheios de líquido com 1.000 UI / ml de heparina. cateteres venosos coronárias deve ser preenchido com 5.000 UI / ml de heparina.
- Fechando o Thorax
- Realizar uma incisão com um comprimento de aproximadamente 1,5 cm, 8 cm de caudal e paralela à primeira incisão.
- Levar a drenagem da cavidade pleural ao sexto músculos intercostais subcutaneamente a esta incisão com uma pinça mosquito grande curva. Ligue o dreno para o dispositivo de sucção para remover qualquer líquido restante e restabelecer a pressão negativa na cavidade pleural durante o fechamento do tórax.
- Aliviar e inflaro pulmão com uma espera ao final da inspiração. Certifique-se de preenchimento adequado do pulmão por um acompanhamento visual.
- Feche o tórax puxando as nervuras do quarto espaço intercostal em conjunto em dois locais separados, com não-absorvível USP6 poliéster entrançado (Ø0.8 mm).
- Feche o músculo serrátil e músculo peitoral maior com um ponto corrido e a pele com uma sutura subcuticular execução usando não absorvível USP2-0 trançado de seda (Ø0.3 mm)
- Suturar as incisões na face dorsal com os não-absorvível poliéster USP2-0 trançado (Ø0.3 mm) entre os cateteres. Primeiro um nó directamente sobre a pele para fechar a incisão, em seguida, fixar-se os cateteres para a sutura com um nó de 1 cm a partir da pele. Para as sondas de fluxo, usar um poliglactina absorvível USP2-0 entrançada (Ø0.3 mm) de sutura para prevenir o corte do fio de sutura no fio sonda de fluxo (Figura 1).
- Remova cuidadosamente o dreno enquanto aplica pressão no lado craniala incisão para manter a pressão negativa na cavidade pleural. Fechar a incisão com uma sutura em bolsa usando não absorvível poliéster trançado USP2-0 (Ø0.3 mm) e selar a ferida com vaselina.
Figura 1. Visão geral do Serviço de Cirurgia do painel superior esquerdo:. A área estéril do animal, que deve ser raspada e situa-se entre as linhas bleu esterilizado. O local da incisão é representado como a linha a tracejado vermelho. Painel inferior esquerdo: Retrato de cateteres e sondas de fluxo: cheio de líquido cateter (A), sonda de fluxo pulmonar aorta / incluindo faixa de borracha (B), cateter venoso coronária incluindo agulha de 20 G (C) e a sonda de fluxo coronário (D). Painel superior direito: esquema do posicionamento dos cateteres e sondas de fluxo. MAP, pressão arterial média; Cor venoso, cateter venoso coronária; LAP, a pressão atrial esquerda; LVPpressão do ventrículo esquerdo; RVP, a pressão do ventrículo direito; PAP, pressão da artéria pulmonar; CO, débito cardíaco; CBF, o fluxo sanguíneo coronário. Painel inferior direito:. Tunneled cateteres que retiram a parte de trás fixada com um ponto e um nó em cerca de 1 cm de distância ao longo da sutura Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Rescisão de anestesia e recuperação da cirurgia
- Pare de anestesia quando todos os locais de incisão são fechados.
- Proporcionar analgesia por administração de buprenorfina (0,015 mg / kg) im no músculo gracile.
- Parar a ventilação quando o animal está respirando de forma independente e desconectar o tubo traqueal do ventilador. Verifique regularmente se o animal está respirando suficientemente.
- Coloque compressas de gaze entre os locais de exteriorização do cateter para absorver o líquido da ferida.
- Para proteger o externo SEgments dos cateteres, dar ao animal um colete elástico e embalar os cateteres entre dois pedaços de pele de carneiro artificial.
- Desinflar o balão do tubo traqueal e extubação quando o animal recupera o seu reflexo de deglutição.
- Proporcionar analgesia a longo prazo por meio de um adesivo de libertação lenta de fentanilo (12 ug / h durante um porco 20 kg; ajustar a força de acordo com o peso corporal). Coloque o adesivo sobre uma parte fina da pele (como a parte inferior do abdômen) para garantir a entrega adequada de analgesia.
- Casa do animal separadamente para todo o período pós-operatório. Fornecer uma lâmpada de aquecimento durante a primeira semana após a cirurgia para manter o animal aquecido.
- Fornecer o suficiente iv fluido se o animal não está bebendo de forma independente.
- Lave os cateteres cheios de líquido diariamente, em primeiro lugar retirando o sangue para remover coágulos, em seguida, reenchimento com solução salina e finalmente com solução salina heparinizada (1000 - 5000 UI / ml) para evitar a formação de coágulos de sangue. Tome cuidado para não infundir qualquer bubb arles ao liberar os cateteres.
- Administrar amoxicilina (25 mg / kg) IV diariamente durante 6 dias após a cirurgia para evitar infecções pós-cirúrgicas.
- Permitir que o animal possa recuperar durante uma semana antes de iniciar os experimentos de esteira.
4. Esteira Experiment (Figura 2)
- Lave os cateteres cheios de líquido, como descrito (3.5.10) e anexar os cateteres liberado para os transdutores de pressão. Medir a temperatura rectal de ser capaz de obter valores de temperatura dos gases sanguíneos corrigidos.
- Lave os transdutores de pressão com solução salina para evitar que o amortecimento dos sinais devido a bolhas de ar. Anexar os transdutores de pressão do colete elástica no lado dorsal.
- Ligar os transdutores de pressão e sondas de fluxo para o amplificador. Inicie a medição no programa de computador e calibrar os transdutores de pressão e sondas de fluxo com 0 mmHg estar aberto para o ar (e fechada para animais) e 100 mm Hg utilizando um manómetro.
- Se necessário, ligar uma linha de extensão de qualquer um dos cateteres de fluido para a amostragem de sangue arterial e venoso misto.
- Medir a hemodinâmica quando o animal está deitado, bem como em pé, parado na esteira. pressões médias de sangue são medidos durante um período de tempo de 10 seg.
- Obter arterial e amostras de sangue venoso misto, em primeiro lugar retirando 5 ml de sangue utilizando uma seringa de 10 ml para que 1 ml de sangue puro pode ser obtido utilizando uma seringa de 1 ml heparinizada. Para as amostras de sangue venoso coronário, uma seringa de 2 ml é utilizada em vez da seringa de 10 mL e retirada de 1 ml é suficiente para se obter sangue puro.
- Mantenha as selados seringas de 1 ml em gelo antes de processar as amostras de sangue com um analisador de gases de sangue para determinara condição metabólica e ventilatória do animal.
- Sujeitar os porcos a um protocolo de exercício de cinco estágios na esteira, 3 min por velocidade, 1-5 km / hr (~ 85% da frequência cardíaca máxima). Obter hemodinâmica e gases sanguíneos após 1,5-2 min por velocidade em cada velocidade que na posição de repouso.
- Após o protocolo de exercício fechar as torneiras e verificar se deriva ocorreu na calibração 0 mmHg, fazer uma nota desta calibração. Remover os transdutores de pressão dos cateteres cheios de fluido e desligue as sondas de fluxo.
- Lave os cateteres cheios de líquido com solução salina e heparina (1000 - 5000 UI / ml). Proteger os cateteres e sondas de fluxo, colocando-os sob o colete elástico entre dois pedaços de pele de carneiro artificial. O animal pode agora ser devolvido à sua gaiola.
Figura 2. esteira Experiment painel esquerdo.ls: suínos instrumentada na esteira. cateteres cheios de fluido estão ligados aos transdutores de pressão, colocado na parte traseira do porco. painel superior direita: Visão Geral do total set-up experimental, incluindo esteira, amplificador e computador de gravação. Painel inferior direita: Exemplo típico dos dados hemodinâmicos registrados. De cima para baixo; pressão aórtica (AoP, azul) e pressão ventricular esquerda (LVP, vermelho); pressão do átrio esquerdo (LAP, azul) e pressão ventricular esquerda (vermelho); pressão arterial pulmonar (PAP, azul) e pressão do ventrículo direito (RVP, vermelho); fluxo aórtico / débito cardíaco (AoF, azul); o fluxo sanguíneo coronário (FSC, vermelho). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Exercício até 5 km / h resultou na duplicação do débito cardíaco a partir de 4,3 ± 0,3 para 8,5 ± 0,7 L / min que foi realizado principalmente por um aumento na frequência cardíaca a partir de 137 ± 7 256 ± 8 batidas por minuto, em combinação com um pequeno aumento no volume de curso de 32 ± 2 para 36 ± 3 ml (Figura 3). O aumento no volume da pulsação foi facilitado por um aumento da contractilidade do ventrículo esquerdo, como evidenciado por um aumento do máximo da primeira derivada da pressão ventricular esquerda dP / dtmax em conjunto com um aumento da taxa de relaxamento do ventrículo esquerdo e um aumento da esquerda pressão atrial, sendo a pressão de enchimento do ventrículo esquerdo (Figura 3). O aumento do débito cardíaco em conjunto com um aumento da concentração de hemoglobina (a partir de 8,5 ± 0,4-9,2 ± 0,4 g / dl) e um aumento na extracção de oxigénio do corpo 45 ± 1-71 ± 1% permitiu uma trexecução do IPL de consumo de oxigénio do corpo (Figura 3). Vasodilatação sistémica ocorreu como evidenciado por um aumento na condutância vascular sistémica e uma diminuição da resistência vascular sistémica, que acomodados o aumento do débito cardíaco quase completamente, de modo que a pressão aórtica média aumentou apenas ligeiramente (Figura 3). O exercício também resultou em vasodilatação modesta na circulação pulmonar, como evidenciado por um aumento de 33 ± 8% em condutância vascular pulmonar. No entanto, o aumento de 101 ± 8% do débito cardíaco, em conjunto com o aumento da pressão atrial esquerda (a partir de 3 ± 1 a 10 ± 1 mm Hg), resultou num aumento da pressão arterial pulmonar e, assim, num aumento da pós-carga do ventrículo direito ( A Figura 3).
O aumento da frequência cardíaca, em conjunto com o ligeiro aumento de pressão arterial resultou em um aumento no ventrículo esquerdo contras de oxigénio do miocárdioumption, que foi recebido principalmente por um aumento no fluxo de sangue coronário que, em combinação com o aumento da concentração de hemoglobina resultou num aumento da entrega de oxigénio do miocárdio (a partir de 310 ± 37-738 ± 68 pmol / min). O aumento da demanda de oxigênio do miocárdio foi proporcional ao aumento da oferta de oxigênio pelo miocárdio, como a extração de oxigênio do miocárdio (79,8 ± 1,9% em repouso 81,6 ± 1,9% durante o exercício máximo) foi essencialmente mantida constante, resultando em uma saturação de oxigênio inalterada coronária venosa e coronária tensão de oxigênio venoso (Figura 3).
Figura 3. resposta hemodinâmica típica para o exercício. Consumo de oxigênio corporal (BVO2) foi utilizada como um índice para a intensidade do exercício (X-eixos do painel AL). São mostradas as respostas de frequência cardíaca (FC, painel A), volume sistólico (SV, painel B), maximo e mínima da primeira derivada da pressão ventricular esquerda (dP / dtmax, painel C e dP / dtmin, painel D resp) como índices de contratilidade e da taxa de relaxamento, o débito cardíaco (CO, painel E), pressão arterial média (MAP , painel F), a condutância vascular sistêmica (SVC, painel G), resistência vascular sistémica (SVR, painel H), pressão arterial pulmonar (PAP, painel J), a pressão do átrio esquerdo (LAP, o painel I), condutância vascular pulmonar (PVC , painel K). Total de resistência pulmonar (índice de TPR para a pós-carga do ventrículo direito aumentaram durante o exercício, Painel L). O aumento da frequência cardíaca, em conjunto com o ligeiro aumento de pressão arterial resultou em um aumento no consumo de oxigénio do miocárdio do ventrículo esquerdo (X-eixos de painéis MP), que foi atingida principalmente por um aumento no fluxo sanguíneo coronário (FSC, painel H) , como a extração do miocárdio oxigênio (MEO2, painel N), saturação de oxigênio venoso coronário (CVSO2, painel O) e tensão de oxigênio venoso coronária (cvPO2, painel P) foram minimamente afetada.Todos os dados são apresentados como média com o erro padrão da média (SEM). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O presente estudo descreve a cirurgia para instrumentação crônica de suínos, bem como o protocolo para o exercício do suína instrumentada em uma escada rolante motorizado enquanto mede a hemodinâmica e tomando amostras de sangue para a medição do teor de oxigênio no sangue arterial, venoso misto e sangue venoso coronário.
Passos críticos dentro do Protocolo
Há vários passos críticos no âmbito do protocolo que já começam durante o procedimento de intubação. Tiopental (2.1.5) é um agente depressivo respiratória, necessitando de intubação rápida após a administração. Além disso, é importante monitorar cuidadosamente as configurações do ventilador durante o procedimento. Assim, quando a cavidade torácica é aberta (passo 3.1.4), isto resulta em uma perda da pressão negativa intratorácica. Para compensar esta perda e para evitar o colapso alveolar, ventilação requer pressão expiratória final positiva (PEEP). Além disso, as configurações do ventilador (prima de pico inspiratórioure) deve ser ajustada para manter um volume corrente de ~ 10 ml / kg. Note também que quando o pulmão esquerdo é empurrada para longe (3.1.6.) volume corrente é susceptível de ser diminuída, porque apenas uma parte do pulmão esquerdo é ventilado. Configurações do ventilador deve ser ajustada com base em gases sanguíneos.
Uma outra nota importante no que diz respeito às medições hemodinâmicas com cateteres cheios de fluido é que não há uma diferença de pressão hidrostática entre o transdutor de pressão e o local da inserção do cateter cheio de fluido para o sistema cardiovascular. A diferença de altura entre o nível da pressão do transdutor de pressão no colete elástico (4.2), e o ponto de inserção do cateter deve ser estimado durante a cirurgia e na altura do sacrifício do animal e corrigida por interpolação pré ou pós-tratamento de o dado.
Outro ponto importante a considerar quando se utiliza esta técnica é que a perda de sangue, seja durante a cirurgia ou durante repetidoamostragem de sangue deve ser minimizada, apesar do facto de suínos são relativamente grandes e, por conseguinte, ter um grande volume de sangue (65 mL / kg). Durante a cirurgia, a perda de sangue durante a inserção dos catéteres pode ser minimizado pela simples aplicação de compressão sobre as perfurações. De acordo com as orientações experimentação animal, até 10% do volume de sangue circulante pode ser tomada em uma única ocasião de, animais saudáveis normais com mínimos efeitos adversos, mas vai demorar um animal cerca de 14 dias para repor essa quantidade de sangue 15. Isto significa que a recuperação da cirurgia é prolongada quando uma quantidade significativa de sangue perdido é.
Durante a amostragem de sangue repetidas durante as experiências de exercício, um máximo de 1,0% do volume de sangue circulante de um animal, ou 0,6 ml / kg pode ser removido a cada 24 h 15. Isto também significa que a quantidade de sangue que é amostrado durante exercício em esteira, deve ser bem planejado e que, após a remoção do inicoágulos ciais que são invariavelmente presente no lúmen do cateter perto da ponta, na interface com o sangue, o sangue restante retirado para limpar as linhas devem ser devolvidos para os animais.
Modificações e resolução de problemas
cateteres cheios de líquido implantados devem ser lavados diariamente para evitar mau funcionamento por causa da formação de coágulos sanguíneos. Dependendo da quantidade de coágulos sanguíneos nos cateteres cheios de fluido, a quantidade de heparina em cada linha pode ser variado de 1000 UI / ml a 5,000 UI / ml. A quantidade de heparina devem ser mantidos a um mínimo na primeira semana depois da cirurgia para prevenir hemorragias das feridas de incisão cirúrgica, devido à presença da heparina anti-coagulante.
No entanto, mesmo quando toda velocidade diariamente, alguns cateteres cheios de líquido vai ficar entupidos. Quando isso acontecer, tente retirar sangue com uma pequena seringa de 2 ml por aplicação de sucção mínima e / ou pulsátil. Pode demorar vários minutos antes de o cateter será unobstruído. Quando isso não funciona, lave cuidadosamente uma pequena quantidade de solução salina no catéter e imediatamente tentar retirar sangue. Estar ciente de que a infusão pode resultar numa libertação de trombo na circulação e embolia dos órgãos distais, dependendo do local do cateter. Quando o cuidado de lavagem não funcionar, conecte a linha obstruído a uma pressão transdutor para verificar se ainda há um sinal de hemodinâmica. Se não houver nenhum sinal, a linha de fluido deverá ser cheio selado por vários nós e cortada.
Interpretação e Limitações
Quando todos os pontos como mencionado acima são levados em conta, a combinação de medidas hemodinâmicas e amostras de sangue permite a interpretação da resposta ao exercício em termos de corpo inteiro e consumo de oxigênio pelo miocárdio, que são melhores medidas para a intensidade do exercício que sozinho velocidade da esteira 7,12 -14.
A fim de atender às crescentes exigências metabólicas do corpo, exerCISE requer alterações na função cardíaca, bem como alterações na perfusão local. A perfusão tecidual é regulada por alterações no diâmetro das pequenas artérias e arteríolas do leito vascular fornecimento do tecido. Fatores vasoativos Myriad, derivadas de sistemas neuro-humorais, o endotélio e metabólitos locais interagem para determinar o tônus vascular e assegurar a adequada perfusão tecidual 1,5,12,16. Mudanças na resistência vascular sistêmica e pulmonar ou o inverso, a condutância vascular, pode ser calculada a partir da pressão arterial e sinais de fluxo e interpretada em termos de mudanças no tom vasomotor na vasculatura pulmonar e sistêmica. Intuitivamente, a resistência vascular é muitas vezes utilizado para avaliar alterações no tônus vascular. No entanto, em nosso grupo de pesquisa, defendemos o uso de condutância embora condutância e resistência são matematicamente relacionadas, com condutância sendo fluxo normalizado para a pressão e resistência à pressão igualando dividido pelo fluxo. Embora a condutância e resistance são intercambiáveis se investiga o efeito de apenas um único estímulo (isto é, o exercício) 7,17, a interpretação dos dois parâmetros podem ser diferentes quando se combina exercício com intervenções farmacológicas, para investigar as contribuições de vários sistemas vasoativas para regulação do tônus vascular 4 , 5,7,14,18.
Durante o exercício, a circulação sistémica transforma a partir de um sistema em repouso que se caracteriza por um fluxo baixo e uma elevada resistência (isto é, baixa condutância) em um sistema com fluxo elevado e baixa resistência, (alta condutância). Como tal, a vasodilatação farmacológica tem consequências diferentes para a condutância e resistência durante o repouso contra o exercício. A diminuição da resistência que é produzida por um vasodilatador farmacológico em repouso é grande, enquanto o aumento na condutância é apenas uma pequena. Em contraste, durante o exercício ao mesmo grau de vasodilatação traduz-se em um grande aumento na condutância, mas óomente uma pequena diminuição na resistência. Assim, quando a condutância é utilizado, uma maior vasodilatação parece ocorrer durante o exercício, enquanto que, quando olhando para a vasodilatação resistência parece ser maior em repouso. A interpretação dos dados difere, assim, quando se utiliza a resistência ou condutância. Embora a escolha entre a resistência e condutância pode parecer um tanto arbitrária, na física a variável que sofre a mudança principal é designado como o numerador do índice para uma resposta 7,17,18. Uma vez que durante exercer pressão sanguínea aórtica permanece relativamente constante, enquanto que o débito cardíaco aumenta acentuadamente, o parâmetro mais adequado para descrever a resposta vascular sistêmica ao exercício parece ser condutância vascular (pressão débito cardíaco / aórtica sangue) sistêmica, ao invés de resistência. Além disso, a circulação sistémica é composto por uma multiplicidade de leitos vasculares a partir de uma variedade de órgãos que são principalmente perfundidos de um modo paralelo. Desde resistores em paralelo somam reciprocamente, enquanto condutores paralelos adicionar-se de uma forma linear, qualquer alteração na condutância de um leito vascular particular regional traduz-se em um (absoluta) alteração da condutância vascular sistémica total idêntica. Esta consideração dá mais suporte ao uso de condutância vascular para descrever as respostas vasculares sistêmicas ao exercício e intervenções farmacológicas.
A escolha de qualquer resistência ou condutância para descrever as respostas vasculares a exercer no leito pulmonar parece ser menos óbvia, porque o exercício produziram aumentos no débito cardíaco, bem como a pressão da artéria pulmonar 7,17. Uma escolha para qualquer resistência ou condutância também é menos crítica, tendo em conta as relativamente pequenas alterações induzidas pelo exercício na RVP e PVC, em comparação com o grau de vasodilatação produzido por, por exemplo, o bloqueio do receptor de ET-7. Como resultado, a utilização quer de resistência ou condutância para caracterizar os efeitos vasculares Sfa vasodilatador farmacológico na circulação pulmonar irá produzir conclusões semelhantes.
Na circulação coronária, a interpretação dos dados é ainda mais complexo como a administração sistémica de antagonistas farmacológicas de substâncias vasoativas endógenos resultados não só em alterações no tônus dos vasos de resistência coronária, mas muitas vezes também produzem alterações acentuadas nas variáveis hemodinâmicas sistêmicas 7,14,17, 19. Estes hemodinâmica alterados influenciar o trabalho cardíaco, e, assim, provocar alterações no fluxo sanguíneo coronário resultantes de alterações nas exigências metabólicas do coração ou de auto-regulação, e não como um efeito direto da intervenção sobre o tônus vascular coronária. Por exemplo, o bloqueio de um sistema vasoconstritor endógeno diminui a pressão aórtica média, como consequência da vasodilatação sistêmica e provoca ajustes auto-reguladores em tom microvascular coronária. Além disso, a ativação dos barorreceptores reflexo age para aumentar a taxa de coração de umcontratilidade miocárdica nd. Tais alterações na frequência cardíaca e / ou pressão arterial, posteriormente, irá resultar em alterações no metabolismo do miocárdio, o que requer um ajuste na oferta de oxigênio do miocárdio e, consequentemente, do fluxo sanguíneo coronário.
Para levar em conta os efeitos de tais alterações induzidas pela droga no consumo de oxigênio do miocárdio, os investigadores examinar a relação entre os níveis de oxigênio venoso coronárias e consumo de oxigênio do miocárdio (MVO 2) 4,5, como esta abordagem permite a avaliação da regulação do tônus dos vasos de resistência coronária independentemente das mudanças na demanda de oxigênio do miocárdio. A administração de um vasodilatador vai aumentar a oferta de oxigênio do miocárdio em um determinado nível de MVO 2. Como esse aumento da oferta de oxigênio ocorre sem uma mudança no consumo de oxigênio, a extração de oxigênio do miocárdio diminui, levando a aumentos no teor de oxigênio venoso coronário e, portanto, em um deslocamento para cima da relação entre MVO 2 4,5.
Não obstante a sua elegância e utilidade, alguns pesquisadores têm apontado as limitações dessa abordagem 20. Assim, traçando MVO 2 versus PO venoso coronário 2 ou venosa coronária SO 2 pode ser considerado inadequado porque essas variáveis são realmente parte da equação para calcular MVO 2. Consequentemente, MVO 2 não é uma variável que é independente de PO venoso coronário 2 ou SO 2. Alternativamente, os investigadores devem considerar o uso de outro índice do trabalho do miocárdio, o produto da pressão taxa (RPP), que é o produto da freqüência cardíaca e pressão sistólica do ventrículo esquerdo. No entanto, como RPP e MVO 2 são quase linearmente relacionados, substituting RPP para MVO 2 produz resultados praticamente idênticos 14, ea relação entre MVO 2 e níveis de oxigênio venoso coronárias é considerada uma forma sensível de estudar alterações no tom vasomotor coronária.
Significativas relativamente a métodos existentes
Outro método comumente usado para avaliar as mudanças na regulação do tônus vascular é o uso de isolados pequenas artérias ou arteríolas coronárias e pulmonares em uma pressão ou fio myograph 6,14,21. A vantagem de estudos myograph é que os navios podem ser estudadas independente do tecido circundante e sem potencialmente confundindo efeitos a partir de fatores circulantes. Estas técnicas in vitro são, por conseguinte, para complementar as medições in vivo. No entanto, in vivo e in vitro, por vezes, as técnicas dar resultados opostos. Por exemplo, a resposta à endotelina vasoconstritor potente foi reduzida em circulatio coronária intacta n após infarto do miocárdio, mas foi aumentada em isoladas pequenas artérias coronárias de suínos com infarto do miocárdio, em comparação com suínos controle saudável. 21 Esta diferença entre o in vivo e dados in vitro foi devido a um aumento da supressão da influência vasoconstritora da endotelina por prostanóides 21 in vivo.
Aplicações futuras
Dado o papel proposto para alterações na função coronária microvascular em disfunção ventricular esquerda e à direita, a avaliação destas mudanças em modelos relevantes de doença cardiovascular é necessária. A utilização de animais cronicamente instrumentadas permite correlações da gravidade da doença com função microvascular (dis). Além disso, tanto a função microvascular coronária e pulmonar pode parecer normal sob condições de repouso basal, enquanto que a disfunção microvascular pode ser revelado sob stress cardiovascular, tais como durante o exercício.
Em conclusão, o uso de anima cronicamente instrumentadosLS permite a avaliação de série da função cardiopulmonar durante o desenvolvimento da doença ou a avaliação do tratamento, aumentando, assim, poder estatístico e limitar o número de animais necessários para um estudo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Holanda Coração subsídio da Fundação 2000T038 (para DJ Duncker) concessão 2000T042 (a D. Merkus), europeu FP7-Health-2010 A Comissão concessão MEDIA-261409 (para DJ Duncker e D. Merkus), Iniciativa de Pesquisa Cardiovascular Países Baixos: a Fundação do coração holandês, a Federação holandesa de centros médicos universitários, a Organização holandesa para Pesquisa em Saúde e Desenvolvimento e da Academia Real holandesa de Ciências CVON- ARENA CVON 2011-11 (para DJ Duncker), CVON-PHAEDRA CVON2012-08 (a D. Merkus) e CVON-RECONNECT CVON 2014-11 (para DJ Duncker e D. Merkus), Fundação Sophia (a D. de Wijs-Meijler, D. Merkus e IKM Reiss).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-way stopcocks | B. Braun | 16496 | |
| Perfusor lines PVC (DEHP-free) 150 cm/2.6 ml | B. Braun | 8722960 | Used for fluid filled catheters |
| “python “ silicontubing | Rubber BV | 1757 ID 1 mm, OD 2 mm | Used for fluid filled catheters |
| Sodium Chloride 0.9% | Baxter | TKF7124 | |
| Glucose 10% | Baxter | WE0163 | |
| Suction device | |||
| Slim-Line electrosurgical pencil with 2 buttons | ERBE ELEKTROMEDIZIN GMBH | 20190-066 | |
| Servo Ventilator SV900C | Siemens-Elema AB | ||
| Laryngoscoop | Vererinary Technics Int. | 11.02.47 | |
| Sterile surgical gloves | |||
| tie-on surgical mask | 3M | 1818FS | |
| surgical hat | Klinidrape | 621301 | |
| Procedure pack | Molnlycke Health Care | 97027809 | Surgical drape, gauze pads, syringes, beaker etc |
| Droptears | Alcon | 288-28282-01 | |
| Betadine scrub 75 mg/ml Povidone-iodine | Meda Pharma BV | RVG08939 | |
| Betadine solution 100 mg/ml Povidone-iodine | Meda Pharma BV | RVG01331 | |
| Cuffed Endotracheal tube | Emdamed | size depends on animal size | |
| Breathing filter Hyrdo therm 3HME | Intersurgical | 1560000 | |
| Laryngoscope Handle+ Miller blade size 4 | Kawe Germany | ||
| Manual resuscitator- Combibag | Weinmann | 6515-12-313-5596 | |
| Perivascular flow probe 3PS | Transonic | For coronary artery; Size 2.5 - 4 mm depending on animal size | |
| Confidence flow probe | Transonic | For aorta/pulmonary artery, 16 - 20 mm; size depends on animal size | |
| Venflon-Venisystem 20 G x 32 mm | BD | 393224 | For coronary venous catheter |
| Blunt Needle 18 G | For coronary venous catheter | ||
| Tygon Tubing | Rubber BV | 2802 ID 0.8 mm (1/32’’), OD 2.4 mm (3/32’’) | For coronary venous catheter |
| Suction Handle 17 cm 6 6/8 " Coupland 18/8 martinit with tube connector | KLS Martin Group | 18-575-24 | |
| Scalple blade | |||
| Scalpel Handle 13.5 cm 5 3/8 " Stainless Steel solid | KLS Martin Group | 10-100-04 | |
| Vascular Forceps 20.2 cm 8 " De Bakey Stainless Stee | KLS Martin Group | 24-388-20 | ± 14 cm |
| Dressing Forceps 17 cm 6 6/8 " Cushing Stainless Steel | KLS Martin Group | 12-189-17 | ± 18 cm |
| halsted-musquito straight 12.5 cm - 5" | Rudolf Medical | RU-3100-13 | ± 12 cm |
| halsted-musquito curved 12.5 cm - 5" | Rudolf Medical | RU-3101-12 | ± 12 cm |
| Dissecting and Ligature Forceps 13 cm 5 1/8 " Gemini Stainless Steel | KLS Martin Group | 13-451-13 | ± 12 cm |
| Dissecting and Ligature Forceps 18.5 cm 7 2/8 " Schnidt Stainless Steel | KLS Martin Group | 13-363-18 | |
| Rib Retractor Finochietto, Baby Aluminium - | KLS Martin Group | 24-162-01 | |
| suture forceps Mayo-Hegar 3 mm 18 cm - 7" | Rudolf Medical | RU-6050-18 | |
| Metchenbaum blunt curved 14.5 cm - 5(3/4)" | Rudolf Medical | RU-1311-14M | |
| Retrector farabeuf 12 cm - 4 (3/4)" | Rudolf Medical | RU-4497-12 | |
| Towel forceps schrädel curved 9cm - 3,5" | Rudolf Medical | RU-3550-09 | |
| surgical scissors blunt 13 cm - 5" | Rudolf Medical | RU-1001-13 | |
| Gauzes Cutisoft 10 x 10 cm 4-ply | BSN Medical | 45846-00 | |
| Gauzes Cutisoft 5 x 5 cm 4-ply | BSN Medical | 45844-00 | |
| Flowmeter -CM2 / SF2 - 2gas (O2 and Air) | UNO BV | 180000008 | |
| Tec 7 Vaporizer | Datex-Ohmeda | ||
| Acederm wound spay | Ecuphar NV | ||
| Vaseline Album | Bufa | 165313 | |
| silkam 3-0 Natural silk, non-absorbable | B. Braun | F 1134043 | sutures for placement of catheters |
| silkam 2-0 Natural silk, non-absorbable | B. Braun | F 1134051 | sutures for muscular approximation |
| dagrofil 3-0 Polyester, non-absorbable | B. Braun | C 0842478 | sutures for fluid fille catheters after tunneling |
| Vicryl rapide 3-0, 1 x 45 cm FS2, V2930G | Daxtrio medische producten | 15560 | sutures for electrical catheters after tunneling |
| Vitafil 6 USP | SMI | 6080 | Ties |
| Syringes | 10 ml and 2.5 ml | ||
| Heparin LEO (heparin sodium) | LEO Pharma A/S | ||
| Zoletil | Virbac | tiletamine / zolazepam | |
| Sedazine | AST farma | 108855 | xylazine |
| Temgesic | RB Pharmaceuticals | 5429 | buprenorphine |
| Tensogrip | BSN Medical | 71522-00 | elastic vest |
References
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