Artículo de método

La visualización de Contracciones Motilidad y caracterización del papel de la Pilg en Xylella fastidiosa

DOI:

10.3791/53816

⸱

8 de abril de 2016

 , 
1Department of Plant Science, University of California, Davis, 2Agricultural Research Service, San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, United States Department of Agriculture

En este artículo

Resumen

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En este estudio, se empleó una cámara de flujo nano-microfluidos de visualizar y caracterizar funcionalmente la motilidad espasmos de Xylella fastidiosa, una bacteria que causa la enfermedad de Pierce en la vid.

Resumen

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Xylella fastidiosa es una bacteria no flagelado Gram-negativa que provoca una serie de enfermedades económicamente importantes de plantas. La motilidad espasmos ofrece X. fastidiosa un medio para el movimiento de larga distancia dentro de la planta y la colonización, que contribuye a la patogenicidad en X. fastidiosa. La motilidad espasmos de X. fastidiosa es operado por pili de tipo IV. Pili de tipo IV de Xylella fastidiosa están regulados por Pilg, un regulador de la quimiotaxis de Pil-CHP proteínas operón codificación que están involucrados con las vías de transducción de señales. Para dilucidar el papel de los Pilg en la motilidad espasmos de X. fastidiosa, una Pere-deficiente mutante Xf ΔpilG y su cepa complementaria XfΔpilG- C que contiene nativa Pilg se desarrollaron. A las cámaras de microfluidos integrados con un sistema de grabación de la imagen de lapso de tiempo fue utilizado para observar la motilidad espasmos en XfΔpIlg, XfΔpilG- C y su cepa de tipo salvaje. El uso de este sistema de grabación, que permite observaciones espaciales y temporales a largo plazo de la agregación, la migración de las células y las poblaciones de bacterias a través de la motilidad espasmos individuales. X. de tipo salvaje y fastidiosa cepa complementaria XfΔpilG- C mostraron características típicas contracciones de la motilidad observados directamente en las cámaras de flujo de microfluidos, mientras que el mutante XfΔpliG exhibe el fenotipo deficiente espasmos. Este estudio demuestra que Pilg contribuye a la motilidad espasmos de X. fastidiosa. La cámara de flujo de microfluidos se utiliza como un medio para la observación de la motilidad espasmos.

Introducción

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Xylella fastidiosa es una bacteria Gram-negativa no flagelado, patógeno que causa una serie de enfermedades de los cultivos económicamente importantes, incluyendo la enfermedad de Pierce en la vid (Vitis vinifera L.) 1,2, 3. Esta bacteria se limita a la xilema conductor de agua vasos. La infección de la vid provoca la obstrucción de los vasos del xilema y resulta en estrés hídrico y las deficiencias nutricionales 3. La colonización exitosa depende de la capacidad de la bacteria para moverse desde el sitio inicial de la infección con el resto de la planta 3. Contracciones la motilidad es un medio de movimiento flagela....

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Protocolo

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1. El periférico de la franja de la colonia bacteriana

  1. Crecer X. fastidiosa (XF) Temecula tipo salvaje 22, Pilg supresión mutante Xf ΔpliG (usando la estrategia descrita previamente deleción 23), y su complementario XfΔpliG -C (utilizando anteriormente descrito estrategia de complementación genética basada en el cromosoma 24) en placas de agar medio PD2 25 a los 28 ° C durante 5-7 días.
  2. Celofán Autoclave (1 x 1 cm 2) en agua a 121 ° C (249 ° F) durante 15 min. Recoger una pieza de celofán, drenar el agua tocando una esquina de celofán en u....

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Resultados

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La presencia de una franja periférica colonia indicativo de tipo IV pilus mediada motilidad espasmos, se observó en las colonias de X. de tipo salvaje y fastidiosa cepa Xf ΔpliG -C complementaria (Figura 1). Mutant XfΔpliG, sin embargo, no presentó una franja alrededor de la periferia de las colonias (Figura 1). Time-lapse de las células bacterianas en cámaras de flujo nano-microfluidos reveló que crispar la m.......

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Discusión

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En este estudio, hemos caracterizado el comportamiento de movimiento de X. fastidiosa Pilg mutante Xf ΔpilG y sus complementarias cepas XfΔpilG- C de nuevo diseño en-nano-canales paralelos múltiples cámaras micro fl uidic. Las cámaras uidic de nuevo diseño micro FL puede tener hasta cuatro cámaras paralelas con 100 micras nano-canal de ancho en comparación con diseños anteriores con solo un 50 micras de ancho del canal 18. Cuanto más amplia sea la nano-canal mejora.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Este estudio fue apoyado por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos, Servicio de Investigación Agrícola. nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación se mencionan únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica ninguna recomendación o aprobación por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. USDA es un proveedor y empleador que ofrece igualdad de oportunidades.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Biology materials
X. fastidiosa (Xf) Temecula wild typeCosta, H. S., et al., 2004 22
pilG deleción mutante XfΔ pliGShi, X. Y., et al., 2007 26
pilG cepa complementaria XfΔ pliG-C Davis, M. J., et al. 1998 23
Materiales y equipos físicos
Asas de inoculación desechablesVWR international, Radnor, PA#22-363-607procedimientos cuantitativos como la recolección de bacterias
Polidimetilsiloxano (PDMS)Dow Corning Corporation#0002709226Sylgard 184 silicona Kits de elastoméricos
AmScope MD2000 cámara digitalAmScope, Irvine, CASE305R-AZ-EImagen, grabación y medición de vídeo 
Línea de tubosEdgewood, NYConectado a la jeringa y a la cámara microfluídica
Conectores luer de plásticoEdgewood, NYConectado a la jeringa y a la cámara microfluídica
Bombas de jeringaPico Plus, Harvard Apparatus, MA#702209El caudal se puede ajustar mientras la bomba está funcionando.
JeringasGastight, Hemilton Company, Reno, NV#1005Proporcionar el caldo
que fluye Microscopio Olympus IMT-2 invertidoOlympusIMT-2 FLuoro PHaseObservación y grabación
de imágenes Cámara digital SPOT-RTDiagnostic Instruments, Inc., MIRT230Grabación y medición de imágenes, vídeo
Microscopio ObturadorEl UNIBLITZ, US#LS2T2Cámara de control' s tiempo de exposición
Microscopio Sistema de control del obturadorEl UNIBLITZ, USVCM-D1VCM-D1 Un solo canal Aprobado por CE/UL/CSA Controlador de obturador
MetaMorph Software de imagenImaging Corp., PAProcesamiento de imágenes de superresolución en tiempo real 
#T4300 Universal

Referencias

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  1. Purcell, A. H., Hopkins, D. L. Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).
  2. Purcell, A. H. Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat. J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).
  3. Hopkins, D. L.

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Etiquetas

Twitching MotilityXylella fastidiosaPilG GeneMicrofluidic Flow ChamberTime Lapse ImagingType IV PiliBacterial MotilityGene DeletionComplementary StrainPathogenicity Analysis

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