Asistida por láser microdisección (LAM) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células

Ana Marcela Florez Rueda; Ueli Grossniklaus; Anja Schmidt

doi:10.3791/53916

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Artículo de método

Asistida por láser microdisección (LAM) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células

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DOI:

10.3791/53916

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10 de mayo de 2016

Ana Marcela Florez Rueda¹ , Ueli Grossniklaus¹ , Anja Schmidt¹

¹University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para la microdisección asistida por láser de tipos específicos de células vegetales para el perfil transcripcional. Si bien el protocolo es adecuado para diferentes especies y tipos de células, la atención se centra en células altamente inaccesibles de la línea germinal femenina importantes para la reproducción sexual y apomíctica en el género de crucíferas Boechera.

Resumen

La comprensión de los procesos de desarrollo a nivel molecular requiere conocimientos sobre la regulación transcripcional y, por lo tanto, el transcriptoma, a nivel de los tipos de células individuales. Si bien los métodos descritos aquí son generalmente aplicables a una amplia gama de especies y tipos de células, nuestra investigación se centra en la reproducción de plantas. El cultivo de plantas y la producción de semillas son de crucial importancia para la nutrición humana y animal. Una comprensión detallada de las redes reguladoras que gobiernan la formación del linaje reproductivo (línea germinal) y, en última instancia, de las semillas es una condición previa para la manipulación dirigida de la reproducción de las plantas. En particular, la ingeniería de la apomixis (reproducción asexual a través de semillas) en plantas de cultivo promete grandes mejoras, ya que conduce a la formación de semillas clonales que son genéticamente idénticas a la planta madre. En consecuencia, los tipos de células de la línea germinal femenina son de gran importancia para la comprensión y la ingeniería de la apomixis. Sin embargo, como las células correspondientes están profundamente incrustadas dentro de los tejidos florales, es muy difícil acceder a ellas para los análisis experimentales, incluida la transcriptómica específica del tipo de célula. Para superar esta limitación, se pueden aislar secciones de células individuales mediante microdisección asistida por láser (LAM). Si bien la LAM en combinación con el perfil transcripcional permite la identificación de genes y vías activas en cualquier tipo de célula con alta especificidad, establecer un protocolo adecuado puede ser un desafío. Específicamente, la calidad del ARN obtenido después de LAM puede verse comprometida, especialmente cuando se dirigen a células pequeñas y únicas. Para eludir este problema, hemos establecido un flujo de trabajo para LAM que da como resultado de manera reproducible una alta calidad de ARN que es muy adecuada para la transcriptómica, como se ejemplifica aquí con el aislamiento de células de la línea germinal femenina en Boechera apomíctica. En este protocolo, se describen los procedimientos para la preparación de tejidos y LAM, también en lo que respecta a la extracción de ARN y el control de calidad.

Introducción

En transcripcional estudios realizados a nivel tisular, la transcriptomes de tipos de células altamente especializadas, pero raras son a menudo enmascarados por las células circundantes más abundantes. Un ejemplo de tales tipos de células altamente especializadas son las células del linaje reproductivo femenino (línea germinal) en las plantas. La línea germinal femenina se especifica dentro de óvulos en desarrollo, los precursores de las semillas en el interior del gineceo del ^1,2 flor. La célula madre megaspora (MMC) es la primera célula de la línea germinal femenina. Se somete a la meiosis para formar una tétrada de megaesporas reducidos. Típicamente, só....