El tejido de la esclerótica humana es principalmente colágeno; por lo tanto, no es fácilmente utilizable para la inmunohistoquímica. Para lograr el objetivo de realizar inmunohistoquímica para la microscopía confocal de tejido escleral, se utilizó una técnica de laminación.
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Artículo de método
Usando una técnica de laminación para realizar la microscopía confocal de la esclerótica humana
En este artículo
Resumen
Resumen
La esclerótica es un tejido conectivo denso que cubre y protege el ojo. Se compone principalmente de fibras de colágeno denso (tipos I, III, IV, V, VI, y VII). Debido a su autofluorescencia, opacidad, y el espesor, no se ha encontrado adecuado para microscopía confocal. Un enfoque alternativo a la presentada aquí, que utiliza esclerótica fijado con formalina se incluyeron en parafina para inmunohistoquímica, tiene desafíos técnicos, especialmente cuando el precalentamiento del tejido para la recuperación de antígeno. Desde la esclerótica es relativamente pobre en ambas células y vasos, se exploró el uso de muestras de tejido más grandes para ayudar a prevenir que las células vistas y para entender su localización en relación con los buques y otros sitios anatómicos. Para permitir el análisis de muestras de tejido más grandes en el microscopio confocal, una técnica de laminación se realizó para crear capas delgadas de la esclerótica. Tras el análisis de los resultados de los vasos sanguíneos CD31 y hyalu endotelial de vasos linfáticosRonan receptor 1 (LYVE1) células positivas, para lo cual se obtuvo la aprobación para el examen científico, se discuten las ventajas y limitaciones de este método.
Introducción
La esclerótica es la capa exterior rígida que cubre el ojo, que está hecha de tejido conectivo denso. Ayuda a proteger las estructuras intraoculares y para mantener la presión intraocular. Por lo tanto, la esclerótica es esencial para la visión clara. Está desprovisto de vasos linfáticos 1,2 y de ese modo forma un borde libre-linfático exterior entre él y el ojo interior libre de linfático 3-7. También proporciona sitios de unión para los músculos extraoculares, compartiendo así similitudes anatómicas con tendones. Debido a que la esclerótica se compone principalmente de densos haces de colágeno de tipo I y tiene un número menor de ti....
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Protocolo
La utilización de tejidos humanos debe ser revisado y aprobado por un comité de revisión institucional o su equivalente. El trabajo aquí descrito fue aprobado por el comité de ética local y tenía la aprobación de examen científico. Este trabajo fue realizado de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los especímenes esclerales humanos se obtuvieron de los ojos de los donantes de globo (máximo post-mortem de tiempo de 24 horas) en el Banco de Ojos del Departamento de Oftalmología de la Universidad de Colonia, Alemania.
1. Preparación Experimental
- Preparar 96% de etanol y solución salina tamponada con fosfato (PBS) en diferentes tubos. Preparar los a....
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Resultados
En los experimentos representativos realizados aquí, hay beneficios demostrables derivados de la utilización de esta técnica de laminación particular. El primer experimento ilustra la red diversa del plexo vaso sanguíneo episcleral en tres imágenes representativas (figura 3). Los vasos son positivas para CD31.
El segundo experimento muestra las células inmunes, en particular las células LYVE1 + de la epiescler.......
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Discusión
Laminar la esclerótica humana es un método para realizar la microscopía confocal en este tejido. Un paso crítico en este proceso es el uso de etanol en lugar de formalina para fijar el tejido. En nuestra experiencia, los mejores resultados se obtienen cuando se utiliza etanol en lugar de formol para su fijación. escalpelos Blunt agravan el procedimiento y se deben evitar. Del mismo modo, el agotamiento de la esclerótica debe evitarse, ya que complica el procedimiento y reduce la calidad de las imágenes.
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Divulgaciones
Los autores declaran que no divulgan información financiera. El contenido de este artículo es responsabilidad exclusiva de los autores.
Agradecimientos
Fundación Alemana de Investigación (FOR2240 "Angiogénesis (Linfa) e Inmunidad Celular en Enfermedades Inflamatorias del Ojo" para CC y LMH; HE 6743/2-1 y HE 7643/3-1 a LMH; CU47/6-1 a CC), Ayuda Alemana contra el Cáncer (a LMH y CC), programa GEROK Universidad de Colonia (a SLS y LMH), y EU COST BM1302 "Uniendo fuerzas para la regeneración corneal" (a CC).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 96% etanol | Merck Chemicals, Darmstadt, Alemania | P075.4 | |
| microscopio estereoscópico binocular | Motic, Hong Kong, China | n.a | |
| 26 G | Terumo, Lovaina, Bélgica | 303800 | |
| 15.5 mm trepán | Geuder, Heidelberg, Alemania | n.a | |
| no.10 bisturí | Pluma, pfm medical, Osaka, Japón | 2E+08 | |
| bisturí oftálmico micro pluma | Feather, pfm medical, Osaka, Japón | n.º 7657BR | |
| CD 31 anticuerpo (monoclonal de ratón anti humano) | Dako, EE. UU | Anticuerpo IR610 | |
| LYVE1 (conejo policlonal anti humano) | Zytomed, Alemania | RBK014-05 | |
| anti ratón de cabra Anticuerpo FITC | Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania | F0257 | |
| anti conejo de cabra Anticuerpo Cy3 | Dianova, Alemania | 111-165-003 | |
| Suero de cabra normal | Dako, Glostrup, Dinamarca | X090710-8 | |
| DAPI | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania | Microscopio 6335.1 | |
| diapositivas | Engelbrecht, Edermü nde, Alemania | WC7695002 | |
| Cubreobjetos 24 mm x 24 mm | Th. Gayer, Lohmar, Alemania | 7695026 | |
| medio de montaje fluorescente DAKO | DAKO, EE. UU. | S3023 | |
| LSM Meta 510 microscopía confocal | Carl Zeiss AG, Jena, Alemania | n.a |
Referencias
- Schlereth, S. L., et al. Enrichment of lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1)-positive macrophages around blood vessels in the normal human sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (2), 865-872 (2014).
- Schlereth, S. L., et al.
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Reimpresiones y permisos
