Usando una técnica de laminación para realizar la microscopía confocal de la esclerótica humana

Summary

El tejido de la esclerótica humana es principalmente colágeno; por lo tanto, no es fácilmente utilizable para la inmunohistoquímica. Para lograr el objetivo de realizar inmunohistoquímica para la microscopía confocal de tejido escleral, se utilizó una técnica de laminación.

Abstract

La esclerótica es un tejido conectivo denso que cubre y protege el ojo. Se compone principalmente de fibras de colágeno denso (tipos I, III, IV, V, VI, y VII). Debido a su autofluorescencia, opacidad, y el espesor, no se ha encontrado adecuado para microscopía confocal. Un enfoque alternativo a la presentada aquí, que utiliza esclerótica fijado con formalina se incluyeron en parafina para inmunohistoquímica, tiene desafíos técnicos, especialmente cuando el precalentamiento del tejido para la recuperación de antígeno. Desde la esclerótica es relativamente pobre en ambas células y vasos, se exploró el uso de muestras de tejido más grandes para ayudar a prevenir que las células vistas y para entender su localización en relación con los buques y otros sitios anatómicos. Para permitir el análisis de muestras de tejido más grandes en el microscopio confocal, una técnica de laminación se realizó para crear capas delgadas de la esclerótica. Tras el análisis de los resultados de los vasos sanguíneos CD31 y hyalu endotelial de vasos linfáticosRonan receptor 1 (LYVE1) células positivas, para lo cual se obtuvo la aprobación para el examen científico, se discuten las ventajas y limitaciones de este método.

Introduction

La esclerótica es la capa exterior rígida que cubre el ojo, que está hecha de tejido conectivo denso. Ayuda a proteger las estructuras intraoculares y para mantener la presión intraocular. Por lo tanto, la esclerótica es esencial para la visión clara. Está desprovisto de vasos linfáticos ^1,2 y de ese modo forma un borde libre-linfático exterior entre él y el ojo interior libre de linfático ^3-7. También proporciona sitios de unión para los músculos extraoculares, compartiendo así similitudes anatómicas con tendones. Debido a que la esclerótica se compone principalmente de densos haces de colágeno de tipo I y tiene un número menor de tipos de colágeno III, IV, V, VI, VIII ^8,9 y elastina ^10,11, este tejido no es fácil de usar para inmunohistoquímica.

Anatómicamente, la esclerótica se puede separar en tres capas principales: (1) la epiesclerótica vascularizado superficial, que se encuentra debajo de la conjuntiva y la cápsula de Tenon y hacia los lados y THCuenta E del ojo hacia la órbita; (2) el estroma escleral, la parte principal de la esclerótica; y (3) la lámina fusca, que es una capa delgada, pigmentada situado directamente encima de la úvea. Nuestro conocimiento anatómico sobre la esclerótica se deriva principalmente de la primera mitad del siglo ^20. En ese momento, los investigadores estudiaron la anatomía de la vasculatura principalmente mediante el uso de inyecciones de tinta India ¹² y vasculares fundición ^13-15. Más tarde, se investigó en estudios angiográficos ^16-19.

Desde ese momento, las técnicas más antiguas se han mejorado y otros nuevos han sido desarrollados que nos han permitido complementar los conocimientos anatómicos anterior. Por ejemplo, ha sido solamente alrededor de una década desde que hemos tenido este tipo de marcadores linfáticos fiables como el endotelio vascular linfática hialuronano específico del receptor-1 (LYVE1) ²⁰ o ²¹ podoplanin. La microscopía confocal ofrece nuevas posibilidades para el estudio de las características anatómicas de los diferentes tiUNDIALES del ojo. Permite múltiples manchas a ser utilizados para diferenciar los marcadores de células o para la localización de las células en relación a los vasos sanguíneos y otras estructuras anatómicas. Proporciona una visión general cuando la muestra es de un tamaño más grande y nos permite escanear a través de una muestra cuando en busca de un tipo específico de célula. Con la tecnología Z-Stack, microscopía confocal se puede utilizar para muestras de hasta 100 a 200 micras. La esclerótica se diferencia de espesor entre 0,3 mm detrás de las inserciones musculares y 1 mm en el polo posterior ^11. Debido tanto a su espesor y opacidad, la esclerótica no es adecuado para microscopía confocal utilizando métodos tradicionales.

Para remediar esto, los tejidos esclerales se laminaron para permitir su análisis con el microscopio confocal. Esta tecnología es útil para obtener una mejor comprensión de las dos situaciones fisiológicas y patológicas en la esclerótica humana.

Protocol

La utilización de tejidos humanos debe ser revisado y aprobado por un comité de revisión institucional o su equivalente. El trabajo aquí descrito fue aprobado por el comité de ética local y tenía la aprobación de examen científico. Este trabajo fue realizado de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los especímenes esclerales humanos se obtuvieron de los ojos de los donantes de globo (máximo post-mortem de tiempo de 24 horas) en el Banco de Ojos del Departamento de Oftalmología de la Universidad de Colonia, Alemania.

1. Preparación Experimental

1. Preparar 96% de etanol y solución salina tamponada con fosfato (PBS) en diferentes tubos. Preparar los anticuerpos primarios en la dilución recomendada de PBS que contiene 2% de albúmina de suero bovino (BSA) y tener todas las soluciones en hielo. Preparar 100 l por muestra.
2. Limpiar todos los instrumentos y usar escalpelos afilados. Después de repetir el corte con el mismo bisturí, cambiar el bisturí.
3. Obtener 1-2 fórceps Colibri, de rectas tijeras de disección micro, un bisturí # 10o un bisturí oftálmica micro pluma, y ​​cuatro agujas de 26 G.
4. Envuelva el papel de aluminio alrededor de una placa de poliestireno o usar una placa de corcho para fijar el tejido. Trabajar debajo de un microscopio estereoscópico binocular. Trabajar estéril debajo de un flujo de aire laminar si es necesario.

2. Preparar la esclerótica

1. coloque un lado del bulbo y realizar una trepanación perforación en la parte corneoscleral, a continuación, girar el trépano. Rotar el trépano con cuidado y de manera uniforme sobre la superficie para realizar un corte por igual todo el año. Use un trépano de tamaño 15,5 mm. Cortar los archivos adjuntos restantes con tijeras curvas. Retire la trepanación corneoscleral. Esto dará lugar a una bombilla en sentido anterior abierto.
   1. Ponga la esclerótica en un hisopo con la parte abierta hacia arriba. Retire la retina y la úvea, el uso de fórceps colibri de lograr ambas capas (retina y Uvea) de la esclerótica. No deje la úvea pigmentada sobre la esclerótica interior. Utilice tijeras curvas para eliminar la retina y la úvea de la papila. Retire el remconjuntiva aining, músculos extraoculares, y la cápsula de Tenon de la esclerótica superficial.
2. Retire la muestra escleral en el tamaño requerido por el uso de las tijeras de tipo recto y las pinzas Colibri. Tomar alrededor de 2 cm ² muestras de tamaño esclerales de diferentes lugares. Debido a su pequeño tamaño, mantenga la esclerótica con suavidad y cortar al tamaño deseado como cuadrados usando las tijeras de tipo lineal. La trepanación corneoscleral define el margen anterior de las muestras esclerales.
   1. Evitar repetida agarrar con el fórceps como el área en la que el tejido fue agarrado no es adecuado para los análisis de microscopía confocal. Preparar el número requerido de muestras en función del tipo experimento (por ejemplo, en sentido anterior vs. posterior, comparar la figura 1) y la cantidad de anticuerpos usados.
3. Poner las muestras en tubos de 1,5 ml para su uso posterior. Fijar las muestras en 1,5 ml 96% de etanol durante 15 min, y luego los lavar tres veces cada uno durante 5 minutosen 1,5 ml de PBS en el agitador. Si se trabaja con tejido congelado, lleve a cabo este paso antes de la congelación a presión.
4. Utilice tejido fresco. Sin embargo, si esto no es posible, broche congelar la esclerótica en nitrógeno líquido y mantenerlo a -20 ° C para su uso posterior. Si se trabaja con tejido congelado, descongelar antes de su uso. Evitar la descongelación repetida y ciclos de congelación.
5. Mantener cada muestra en PBS que contenía 1,5 ml 5% de BSA a temperatura ambiente durante 2 hr. Este paso induce una inflamación de la muestra que es útil para la laminación y también evita la unión no específica.
6. Después de que las muestras se han hinchado, preparar las plazas esclerales para la laminación. Trabajar por debajo de un microscopio, por ejemplo, un microscopio estéreo binocular. Colocar las muestras esclerales posteriores a la membrana de poliestireno envuelto en papel de aluminio o la placa de corcho utilizando las agujas de 26 G.
7. Doblar los bordes de las agujas para que no se interfieren con el campo visual debajo del microscopio.
8. Laminar el samp escleral de espesor totalles.
   1. En primer lugar, mantenga el borde anterior de la esclerótica utilizando pinzas Colibri. A continuación, cortar cuidadosamente una capa delgada de la esclerótica superficial utilizando el bisturí # 10, la pluma micro bisturí oftálmica, o una hoja de la espátula. Mantenga el bisturí horizontal y cortar la capa superficial lo más finas posible de la capa subyacente.
   2. Diseccionar una capa delgada escleral de la plaza escleral. Este método es comparable a las técnicas quirúrgicas estándar para preparar un colgajo durante la trabeculectomía y deberían dar lugar a capas gruesas 30-80 micras (comparar Figura 2).
9. Evitar el secado de la esclerótica mediante la adición de pequeñas cantidades de PBS a los tejidos, por ejemplo, 50 l de PBS utilizando una pipeta.
10. Poner las capas cortadas en 100 l de PBS en la placa de 96 pocillos y la etiqueta tanto en la orientación (hacia extern y pasante) y la capa (superficial y profunda), por ejemplo con un color resistente al agua.
11. Repita los pasos 2.7-2.9 hasta que el tejido se lamina completamente.

3. Realizar inmunohistoquímica

1. Añadir 100 l de los anticuerpos primarios requeridos en la dilución recomendada. Aquí, por ejemplo, uso de CD 31 anticuerpo LYVE1 (de conejo anti humano) (ratón monoclonal anti humano) y, tanto en una dilución de 1: 100 en PBS (que contiene 2% de BSA) y se incuba a 4 ° C durante la noche. Para cambiar el medio en la placa de 96 pocillos, mantenga la pipeta a la pared del pozo y extraer el líquido.
2. El día siguiente, lavar las muestras tres veces cada una durante 5 minutos con 200 a 300 l de PBS en el agitador. Añadir 100 l de los anticuerpos secundarios correspondientes; aquí utilizar de cabra anti ratón isotiocianato de fluoresceína (FITC) y de cabra anti conejo colorantes de cianina 3 (Cy3), y se incuban las muestras a temperatura ambiente durante 1-2 horas. Diluir los anticuerpos secundarios 1: 300 en PBS que contenía 2% de suero de cabra.
3. Enjuagar las muestras de nuevo tres veces cada una durante 5 minutos en 200 a 300 l de PBS en el agitador.
4. Realizar tinción núcleo, por ejemplo, . 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (dilución 1: 2000, 100 l en cada pocillo e incubar 10 min a temperatura ambiente), a continuación, lavar de nuevo 2 veces en 200 a 300 l de PBS en el agitador.
5. La transferencia de las muestras en portaobjetos de microscopio, incrustarlos en 1-2 gotas de medio de montaje fluorescente, añadir un cubreobjetos, sellarlo, cubriendo los bordes con barniz transparente y se almacena a 4 ° C para su uso posterior o examinar directamente las diapositivas con el confocal microscopio.
6. Use un microscopio confocal (o equivalente) para analizar las muestras. Utilice la ampliación deseada, por ejemplo 10-40x ampliación.
7. Para verificar el espesor de las muestras, medir con microscopía confocal utilizando Z-pilas. La cantidad de posibles secciones esclerales depende de la ubicación de la esclerótica, como el espesor difiere ecuatorial y posterior (comparar introducción).

Results

En los experimentos representativos realizados aquí, hay beneficios demostrables derivados de la utilización de esta técnica de laminación particular. El primer experimento ilustra la red diversa del plexo vaso sanguíneo episcleral en tres imágenes representativas (figura 3). Los vasos son positivas para CD31.

El segundo experimento muestra las células inmunes, en particular las células LYVE1 + de la epiescler...

Discussion

Laminar la esclerótica humana es un método para realizar la microscopía confocal en este tejido. Un paso crítico en este proceso es el uso de etanol en lugar de formalina para fijar el tejido. En nuestra experiencia, los mejores resultados se obtienen cuando se utiliza etanol en lugar de formol para su fijación. escalpelos Blunt agravan el procedimiento y se deben evitar. Del mismo modo, el agotamiento de la esclerótica debe evitarse, ya que complica el procedimiento y reduce la calidad de las imágenes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% etanol	Merck Chemicals, Darmstadt, Alemania	P075.4
microscopio estereoscópico binocular	Motic, Hong Kong, China	n.a
26 G	Terumo, Lovaina, Bélgica	303800
15.5 mm trepán	Geuder, Heidelberg, Alemania	n.a
no.10 bisturí	Pluma, pfm medical, Osaka, Japón	2E+08
bisturí oftálmico micro pluma	Feather, pfm medical, Osaka, Japón	n.º 7657BR
CD 31 anticuerpo (monoclonal de ratón anti humano)	Dako, EE. UU	Anticuerpo IR610
LYVE1  (conejo policlonal anti humano)	Zytomed, Alemania	RBK014-05
anti ratón de cabra Anticuerpo FITC	Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania	F0257
anti conejo de cabra Anticuerpo Cy3	Dianova, Alemania	111-165-003
Suero de cabra normal	Dako, Glostrup, Dinamarca	X090710-8
DAPI	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania	Microscopio 6335.1
diapositivas	Engelbrecht, Edermü nde, Alemania	WC7695002
Cubreobjetos 24 mm x 24 mm	Th. Gayer, Lohmar, Alemania	7695026
medio de montaje fluorescente DAKO	DAKO, EE. UU.	S3023
LSM Meta 510 microscopía confocal	Carl Zeiss AG, Jena, Alemania	n.a