Abstract
Her beskriver vi en detaljert fremgangsmåte for effektivt og direkte levere Haemophilus influenzae inn i de nedre luftveier hos mus. Vi viser fremgangsmåten for fremstilling av H. influenzae inokulum, intratrakeal instillering av H. influenzae inn i lungene, samling av bronkokonstriksjon alveolar lavage væske (Balf), analyse av immunceller i Balf, og RNA isolering for differensial genekspresjonsanalyse. Denne fremgangsmåten kan brukes til å studere lunge inflammatorisk respons til noen bakterier, virus eller sopp. Direkte trakeal instillasjon er mest foretrukket over intranasale eller aerosol innånding prosedyrer fordi det gir mer effektivt bakteriell podestoff i den nedre luftveier med mindre tvetydighet.
Introduction
Betennelse er en grunnleggende immunsystemet i forsvaret mot smittestoffer. Det fremmer patogen utrydding og reparasjon av skadet vev. Det letter også oppgangen til en normal sunn tilstand 1. Men feilregulert betennelse fører ofte til kroniske betennelsessykdommer 2. Luftveisinflammasjon er en første trigger for forskjellige pulmonale sykdommer slik som kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), astma, lungefibrose og 3.
Den ikke-typebestembar (ikke-innkapslet) Haemophilus influenzae (NTHI) er assosiert med kronisk øvre og nedre lungebetennelsessykdommer 4,5. Det er den dominerende arten isolert fra de nedre luftveier hos barn og voksne med kronisk obstruktiv lungesykdom 4,6,7. Den inflammatoriske respons etter smitte NTHI er karakterisert ved oppregulering av proinflammatoriske cytokiner (så som TNF og IL-1β), og det er mediert by mitogen aktivert protein kinase (MAPK) og nukleær faktor-kB (NF-kB) gjennom toll-like reseptorer (TLRs) 8.
Musemodeller er svært nyttige verktøy for å analysere den underliggende patologi lungeinfeksjon på grunn av tilgjengeligheten av ulike gen-mangelfull linjer. Flere metoder er blitt anvendt for å inokulere levende / svekkede bakterier og bakterielle produkter, deriblant intranasal innføring og aerosolisert inhalering 9,10. Her viser vi intratrakeal instillasjon. Selv om det benyttes mindre hyppig, er denne tilnærmingen mer effektiv og meget reproduserbar på grunn av den direkte levering av inokulumet til de nedre luftveier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble utført i samsvar med retningslinjene i Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Baylor Research Institute.
1. Dyrking Non-typebestembar Haemophilus influenzae (NTHI) og Klar Inoculum
- Plate NTHI på en sjokolade-agar-plate og holder platen opp ned i en fuktet CO2-inkubator over natten ved 37 ° C og 5% CO2. Den følgende dag, kultur bakteriene i hjerne-hjerte-infusjonsekstrakt. Deretter tilsett 1 ml av væsken i en steril 1,5 ml tube.
- Sentrifuger ved 4000 xg i 5 min ved romtemperatur. Deretter kast supernatanten og re-suspendere pellet i 1 ml steril 1x PBS. Gjenta dette trinnet en gang.
- Overfør 100 ul re-oppslemmet oppløsning til 900 ul av 1 x PBS og måle absorbansen av den fortynnede kulturen ved 600 nm bølgelengde på et spektrofotometer.
- Bestemme levedyktigheten og kolonidannende enhets (CFU) av podestoff ved dyrking 1:10 seriefortynninger i sjokolade-agar-plater og inkubering over natten ved 37 ° C og 5% CO2.
- Basert på levedyktigheten og CFU bestemt fra det foregående trinn, juster inokulum til en sluttkonsentrasjon på 20 x 10 6 CFU / ml.
2. Intra-tracheal (det) Instillasjon
- Injisere mus intraperitonealt (ip) med 0,1 ml / 10 g kroppsvekt av mus med en 150 mg / ml ketamin + 20 mg / ml xylazin oppløsning. Fremgangsmåten bør gjøres i hetten med en lyskilde for å holde dyret varme.
- Klem inter plass på musen for å kontrollere at musen er tilstrekkelig bedøvet.
- Plasser musen på ryggen. Barbere ventralområdet av halsen og desinfisere med klorheksidin og 70% etylalkohol.
- Løft huden på øvre ventrale del av halsen ved hjelp av rotte tann tang. Lag et lite snitt (0,5-1,0 cm) over thymus ved hjelp av en skalpellog nøye dissekere muskelen til å avsløre luftrøret.
- Anvendelse av en 1 ml sprøyte med en 27 G nål, langsomt injiseres 0,05 ml luft, etterfulgt av 0,05 ml NTHI erholdt fra Section 1 eller saltløsning som en kontroll, etterfulgt av en 0,05 ml luft. Hold dyret vertikal for rundt 1 min.
- Lukk snittet med kirurgisk lim. Hold musen sidelengs tilbakelent og varm i ca 10 min.
3. Balf Collection
- Offer musen ved halshugging 24 timer etter smitte.
- Åpne bukhulen på mus med anatomiske saks og kutt ventral aorta å blø. Expose ventrale del av lungen.
- Expose luftrøret og intubere det med en 20 gauge kateter. Innpode 0,8 ml Balf buffer (1x PBS, 0,1% dekstrose, 10 U / ml heparin) og samle kylling ved forsiktig aspirasjon. Gjenta denne prosedyren tre ganger.
- Telle det totale antall celler i 100 mL av Balf suspensjonen med en hemocytometer etter 10X forstørrelse med trypanblått farging.
- Forbered lysbilder for endret Giemsa farging. Alikvote 100 ul Balf inn i passende brønner i cytospin og sentrifuger ved 500 xg i 5 min. Tørk lysbilder for 10 min og beis cellene ved hjelp av modifisert Giemsa beis i henhold til produsentens protokoller.
- Benytte de resterende celler for etterfølgende analyse, slik som florescence aktivert cellesortering (FACS), konfokal mikroskopi, genekspresjon og western blot 11-13.
4. Histopatologi Forberedelse
- For histopatologi analyse, infisere mus med NTHI som beskrevet i trinn 2.4. Etter 24 timer på infeksjon, ofre dyrene ved halshugging. Skjær åpne brysthulen med anatomiske saks for å avsløre lungene og luftrøret som nevnt før. Deretter setter du inn 20 gauge kateter inn i luftrøret.
- Fylle lungen med 2% agarose varm oppløsning fremstilt i 4% formalin. NårLungene er fullt oppblåst, sted is på toppen av lungene for å størkne den agarose løsning.
- Deretter forsiktig fjerne thorax pluggen og legg den i en 50 ml løsning av 4% formalin i 1x PBS inntil den er behandlet for hematoxylin og eosin (H & E) seksjoner.
5. FACS merke celler i Balf
- Sette 1 x 10 5 celler fra Balf fluidet i en 96-brønners V-bunn mikro- titer-plate.
- Vask cellene med 300 ul kald 1 x PBS og sentrifugering ved 4000 x g i 3 minutter ved 4 ° C.
- Flekk celler med celle fargende oppløsning i 100 pl 1 x PBS (1: 1000 fortynning) og hold ved romtemperatur i 15 min.
- Vask cellene med 300 ul kald 1 x PBS ved 4000 x g i 3 minutter ved 4 ° C.
- Holde-celler i 100 pl FACS vaskebuffer [vaskebuffer (1 x PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA, 0,1% natriumazid] som inneholdt 1: 100 fortynnet Fc-blokk i 15 minutter ved 4 ° C.
- Sentrifuger cellene ved 4000 xg for 3 min og forkaste supernatant.
- Flekk-cellene med 100 ul overflatefarging cocktail (1: 100 fortynning) i FACS vaskebuffer i 30 min ved 4 ° C.
- Vask cellene tre ganger med 300 ul vaskebuffer FACS ved 4000 x g i 3 minutter ved 4 ° C.
- Feste-celler i 100 pl av 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur.
- Vask cellene to ganger med 300 pl 1 x PBS ved 400 x g i 3 minutter ved 4 ° C og resuspendere i 300 ul FACS-vaskebuffer.
- Lag ensfargede fargekontroll ved hjelp av flowcytometri perler.
- Tilsett en dråpe av perler inn i 96-brønners V-bunn mikrotiter-plate og vask med 200 pl 1 x PBS.
- Tilsett 1 pl flekker antistoff og 100 pl 1 x PBS og perler og inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Vask perler to ganger med 300 mL 1x PBS.
- Analyser enkelt-farget kontroller og celler ved flowcytometri 14.
6. Homogenisering av lungevev å isolere RNA
- Etter infeksjon, samle en liten del av lungen (20-40 mg) og holde den i RNA-stabiliserende reagens ved 4 ° C over natten. Deretter lagre det ved -80 ° C til neste trinn.
- Vask lunge vev i kaldt 1x PBS for å bli kvitt den RNA stabilisering reagenser.
- Plasser vevet inn i en 1,5 ml sentrifugerør inneholdende lyseringsbuffer (1 ml lyseringsbuffer + 10 pl β-merkaptoetanol).
- Hakk vevet i små biter ved hjelp av spisse saks og homogenisere ved hjelp av en trådløs motor pellet stampe for 20-40 sek.
- Hold lysat på is i 5 min og fortsett med trinn 7.1.
7. RNA Isolation fra Lung
- Sentrifuger løsningen ved 18.000 x g i 3 min. Fjern supernatanten ved pipettering og nøye overføre den til en ny 1,5 ml tube.
- Tilsett 1 volum av 70% etanol til lysatet. Bland umiddelbart ved pipettering og vente på 2-4 min.
- Overfør opptil 700 mL av lysat til en spin kolonne plasserti en 2 ml oppsamlingsrør.
- Sentrifuger ved 9600 xg i 15 sek, og forkaste gjennomstrømning.
- Legg 350 mL stringent vaskebuffer og sentrifuger ved 9600 xg i 15 sek. Kast gjennomstrømnings.
- Legg 80 mL DNase I direkte til spinnkolonne membranen og holde den ved romtemperatur i 15 min.
- Legg 350 mL stringent vaskebuffer til den spinnkolonne og sentrifuger ved 9600 xg i 15 sek. Kast gjennomstrømnings.
- Legg 500 mL RNA vaskebuffer og sentrifuger ved 9600 xg i 15 sek. Kast gjennomstrømnings.
- Legg 500 mL RNA vaskebuffer og sentrifugering ved 9600 xg i 2 min. Kast gjennomstrømnings.
- Plasser spinnkolonne i en ny 2 ml oppsamlingsrør og sentrifuger ved 9600 xg i 1 min. Kast gjennomstrømnings.
- Legg 30-50 ul RNase-fritt vann direkte til spinnkolonne og sentrifuger ved 9600 xg i 1 min. Oppbevar RNA ved -80 ° C.
- Utfør RNAseq analyse 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intratrakeal instillering resulterte i en markert økning i antall leukocytter i Balf (figur 1A, venstre panel) enn installasjon med saltvann. Den differensielle telling analyse av leukocyttene viste tydelig økt nøytrofil infiltrasjon (figur 1, høyre panel). FACS-analyse av cellene i Balf ytterligere bekreftet økningen i antall neutrofiler (figur 1B). Histologisk analyse av H & E-fargede seksjoner av lungevevet viste økt luftveisinflammasjon (figur 1C). Disse data antyder at kollektivt intratrakeal instillasjon induserer luftveisbetennelse hos mus. For å støtte bruk av denne tilnærmingen for å studere signalveier som regulerer luftveis patogenesen vi brukt mus som er mangelfull for E3 ubiquitin ligase Itch. Itch er kjent for å være involvert i å regulere inflammatorisk signalveier 15. Vi vaksinertalders- og kjønns matchet villtype C57BL / 6-kontroll og Itch - / - mus med NTHI. Vi isolert RNA fra lunge vev av kontroll WT og Itch - / - mus og fullført hele transkriptom sekvensering for å identifisere de inflammatoriske gener som er forskjellig uttrykt. Som vist i figur 2, kløe mangel resulterte i differensiell ekspresjon av mange gener. Dette tyder på at intratrakeal instillering kan anvendes for å undersøke lungebetennelse, genekspresjonsprofiler og signalveier.
Figur 1: intratrakeal inokulasjon av NTHI induserer lungebetennelse hos mus Mus ble inokulert med NTHI (10 6 CFU / mus) eller en saltvannskontroll.. 24 timer etter inokulering, ble musene avlivet (A) Balf ble oppsamlet. Den totale leukocytter, monocytter og nøytrofile tall ble bestemt. Data er presentertsom betyr ± SEM. n = 4 mus / gruppe. * Indikerer p <0,05 sammenlignet med saltvann-behandlede mus. (B) Cellene i Balf ble farget med anti-GR1 antistoff og analysert ved FACS. (C) H & E-farget lunge seksjoner som viser leukocyttinfiltrasjon og betennelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Differential genekspresjon i lungene av WT og kløe - / - mus etter intratrakeal NTHI inokulering 24 timer etter NTHI inokulering, RNA ble isolert fra lungene av to WT (1, 2) og to kløe - / -. (1, 2) mus. (A) RNA kvalitet ble analysert ved hjelp av en Bioanalyzer. (B) Termisk kart som viser Z-score (tolket som et mål på sd bort framiddelverdien) for logg 2 teller per million (log 2 CPM) av 172 differensielt uttrykte gener er identifisert ved hjelp EDGER i Itch - / -. i forhold til WT mus Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri, beskriver vi en unik og minimalt invasiv prosedyre for å inokulere lungene av mus med en bakteriell lunge patogen. Vi viser at denne fremgangsmåte kan anvendes for å studere funksjonen av forskjellige gener ved bruk av mus som er mangelfulle i gener av inflammatoriske signalveier. Denne fremgangsmåten kan også brukes til å studere de inflammatoriske responser på virus- og sopplungeinfeksjoner. Fordelene med denne fremgangsmåten i forhold til andre metoder som for eksempel intranasal aerosol eller inhalasjon (1) i denne fremgangsmåten, den sykdomsfremkallende inokulum direkte dryppet til den nedre luftveier; (2) evnen til å styre inokulum størrelse; og (3) redusert risiko for bakteriell eksponering for behandleren.
Eksponering av luftrøret kirurgisk for instilling bakterier er et viktig skritt der omsorg må tas for å unngå å forårsake skade på omliggende vev, spesielt blodkar.
Instillasjon av bakterier inn i trakea shOuld gjøres nøye for å unngå muligheten for død av musene som følge av kvelning. Det er foreslått at podestoff (ca. 50 ul) bli frigitt langsomt og luft injiseres før og etter inokulum. Med muse vertikal etter drypping for en stund og holde dem sidelengs recumbent muliggjør raskere restitusjon. Den store ulempen med denne fremgangsmåten er at flere eksponeringer i løpet av en kort tidsperiode er ikke mulig på grunn av kravet om operasjonen. Et potensielt problem er at dersom kateteret er plassert for dypt i bronchus, vil Balf celletallet være lavere. Dette problemet kan løses ved å trekke i slangen gradvis oppover.
Siden forekomsten av luftveis inflammatoriske sykdommer øker på verdensbasis 3,16, forstå patofysiologien av disse sykdommene er svært viktig. Teknologiene som er beskrevet i denne studien kan bidra til å identifisere viktige regulatoriske stier og kunne legge til rette for utviklingav nye behandlingsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
- Medzhitov, R.
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
- Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
- King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).
- Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
- King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
- Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
- Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
- Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
- Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
- Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).
- Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446 (2015).
- Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22 (2015).
- Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
- Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M.
