La abundancia de proteínas refleja las tasas de síntesis y degradación de proteínas. En este artículo se describe el uso de la cicloheximida seguida de western blot para analizar la degradación de proteínas en el modelo de eucariota unicelular, Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes).
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Artículo de método
Análisis cicloheximida persecución de degradación de proteínas en
En este artículo
Resumen
Resumen
La regulación de la abundancia de proteínas es crucial para prácticamente todos los procesos celulares. la abundancia de proteínas refleja la integración de las tasas de síntesis de proteínas y la degradación de proteínas. Muchos ensayos de presentación de informes sobre la abundancia de proteínas (por ejemplo, de una sola vez punto de transferencia de western, citometría de flujo, microscopía de fluorescencia, o los ensayos de reportero basadas en el crecimiento) no permiten la discriminación de los efectos relativos de la traducción y la proteolisis en los niveles de proteína. En este artículo se describe el uso de persecución cicloheximida seguido por el Western Blot para analizar específicamente la degradación de proteínas en el eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes). En este procedimiento, las células de levadura se incuban en presencia de cicloheximida inhibidor de la traducción. Las alícuotas de células se recogen inmediatamente después y en puntos específicos de tiempo después de la adición de cicloheximida. Las células se lisaron, y los lisados se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida for análisis de transferencia Western de la abundancia de proteínas en cada punto de tiempo. El procedimiento de persecución cicloheximida permite la visualización de la cinética de degradación de la población en estado estacionario de una variedad de proteínas celulares. El procedimiento puede utilizarse para investigar los requisitos genéticos para y las influencias ambientales sobre la degradación de proteínas.
Introducción
Las proteínas desempeñan funciones cruciales en prácticamente todos los procesos celulares. Muchos procesos fisiológicos requieren la presencia de una proteína específica (o proteínas) durante un período de tiempo determinado o en circunstancias particulares. Por lo tanto, los organismos supervisan y regulan la abundancia de proteínas para satisfacer las necesidades celulares 1. Por ejemplo, las ciclinas (proteínas que controlan la división celular) están presentes en fases específicas del ciclo celular, y la pérdida de los niveles de ciclina regulados se ha asociado con la formación de tumores malignos 2. Además de regular los niveles de proteí....
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Protocolo
1. Crecimiento y cosecha de células de levadura
- Si no el análisis de la cinética de degradación de una proteína de levadura endógena, transformar la cepa (s) de levadura deseada con un plásmido que codifica la proteína de interés. Métodos fiables para la transformación de levadura se han descrito previamente 37.
- Inocular la levadura en 5 ml de medio apropiado (por ejemplo, selectiva definida (SD) medio sintético para el mantenimiento del plásmido de las células transformadas o YPD) medio de levadura no selectivo extracto-peptona-dextrosa (para las células no transformadas). Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación.
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Resultados
Para ilustrar la metodología de persecución cicloheximida, la estabilidad de Deg1 -Sec62 (Figura 1), un sustrato modelo de levadura retículo endoplásmico (ER) -asociado degradación (ERAD), se analizó 42-44. En ERAD, de control de calidad enzimas ubiquitina ligasa se unen covalentemente las cadenas de la pequeña proteína ubiquitina a las proteínas aberrantes localizado en la membrana ER. Tales proteínas polyubiquitylated se retiran posteriormente de la.......
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Discusión
En este trabajo, se presenta un método para el análisis de la cinética de degradación de proteínas. Esta técnica se puede aplicar fácilmente a una gama de proteínas degradadas por una variedad de mecanismos. Es importante tener en cuenta que los experimentos de persecución cicloheximida informan sobre la cinética de degradación de la piscina en estado estable de una proteína dada. Otras técnicas pueden ser usadas para analizar la cinética de degradación de poblaciones específicas de las proteínas. Por ejemplo, el destin.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los miembros actuales y anteriores del laboratorio de Rubenstein por proporcionar un entorno de investigación entusiasta y de apoyo. Los autores agradecen a Mark Hochstrasser (Universidad de Yale) por compartir reactivos y experiencia. E.M.R. agradece a Stefan Kreft (Universidad de Konstanz) y Jennifer Bruns (Universidad de Pittsburgh) por compartir su valiosa experiencia en el análisis cinético de proteínas. Este trabajo fue apoyado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (R15 GM111713) a E.M.R., un premio de investigación ASPiRE de la Universidad Estatal de Ball a E.M.R., un premio de investigación del capítulo de Sigma Xi de....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cepas de levadura, plásmidos, medio estándar y componentes | |||
| deseados Tubos de vidrio de borosilicato desechables | Fisher Scientific | 14-961-32 | Disponible en una variedad de fabricantes |
| Incubadora con regulación de temperatura (p. ej. Incubadora Heratherm Modelo IMH180) | Dot Scientific 51028068 | Disponible en una variedad de fabricantes | |
| Tambor intercambiable New Brunswick para tubos de 18 mm (rodillo de tubo) | New Brunswick | M1053-0450 | Se recomienda un rodillo de tubo para mantener durante la noche cultivos iniciadores de células de levadura en suspensión. Alternativamente, si no se dispone de un rodillo de tubo, se puede utilizar un agitador de plataforma en una incubadora con temperatura controlada para los cultivos iniciadores durante la noche. Se puede usar un agitador de plataforma o un rodillo de tubo para mantener cultivos más grandes en suspensión. |
| New Brunswick TC-7 Tambor de rodillos 120 V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | Para uso con rodillo de tubo |
| SmartSpec Plus Espectrofotómetro | Bio-Rad | 170-2525 | Disponible en una variedad de fabricantes |
| Centrífuga 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | El rotor que se vende con unidad tiene capacidad para tubos de microcentrífuga de 1,5 y 2,0 ml. El rotor se puede cambiar por uno que contenga tubos cónicos de 15 y 50 ml |
| Rotor de ángulo fijo F-35-6-30 con tapa y adaptadores para centrífuga modelo 5430/R, 15/50 ml Tubos cónicos, 6 plazas | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| Tubo de rosca serigrafiado de 15 ml 17 x 20 mm cónico, polipropileno | Sarstedt | 62.554.205 | Disponible en una variedad de fabricantes |
| Tubo flexible de 1,5 ml, Tubos de microcentrífuga naturales y limpios por PCR | Eppendorf | 22364120 | Disponibles en una variedad de fabricantes |
| Calentadores analógicos Dri-Bath | Fisher Scientific | 1172011AQ | Se recomienda disponer de dos calentadores (uno para incubar células durante el tratamiento con cicloheximida y otro para hervir lisados para desnaturalizar proteínas). Alternativamente, 30 ° El baño de agua C se puede utilizar para la incubación de células en presencia de cicloheximida. El baño de agua hirviendo con placa caliente se puede utilizar alternativamente para desnaturalizar proteínas. |
| Bloque calefactor para tubos cónicos de 12 x 15 ml | Fisher Scientific | 11-473-70 | Para usar con el calentador Dri-Bath durante la incubación de células en presencia de cicloheximida. |
| Bloque calefactor para 20 tubos cónicos de 1,5 ml | Fisher Scientific | 11-718-9Q | Para usar con el calentador Dri-Bath para hervir lisados para la desnaturalización de proteínas. |
| Aparatos de funcionamiento y transferencia, fuentes de alimentación y equipos de imagen o cuartos oscuros de SDS-PAGE para SDS-PAGE y transferencia a membrana | Variará según el laboratorio y la aplicación | ||
| Sistema de adquisición de imágenes Western blot (p. ej. Escáner Li-Cor Odyssey CLx y software Image Studio) | Li-Cor | 9140-01 | Variará según el laboratorio y la aplicación |
| EMD Millipore Immobilon Membranas de transferencia de PVDF | Fisher Scientific | IPFL00010 | Variará según el laboratorio y la aplicación |
| Anticuerpos primarios (p. ej. Fosfoglicerato quinasa (Pgk1) Anticuerpo monoclonal de ratón (clon 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Variará según el laboratorio y la aplicación |
| Anticuerpos secundarios (p. ej. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) | Life Technologies | A-21065 | Variará según el laboratorio y la aplicación |
Referencias
- Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
- Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
- Amm, I., Sommer, T.,....
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Reimpresiones y permisos
