Artículo de método

Análisis cicloheximida persecución de degradación de proteínas en

29.6K vistas

⸱

DOI:

10.3791/53975

⸱

18 de abril de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

En este artículo

Resumen

La abundancia de proteínas refleja las tasas de síntesis y degradación de proteínas. En este artículo se describe el uso de la cicloheximida seguida de western blot para analizar la degradación de proteínas en el modelo de eucariota unicelular, Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes).

Resumen

La regulación de la abundancia de proteínas es crucial para prácticamente todos los procesos celulares. la abundancia de proteínas refleja la integración de las tasas de síntesis de proteínas y la degradación de proteínas. Muchos ensayos de presentación de informes sobre la abundancia de proteínas (por ejemplo, de una sola vez punto de transferencia de western, citometría de flujo, microscopía de fluorescencia, o los ensayos de reportero basadas en el crecimiento) no permiten la discriminación de los efectos relativos de la traducción y la proteolisis en los niveles de proteína. En este artículo se describe el uso de persecución cicloheximida seguido por el Western Blot para analizar específicamente la degradación de proteínas en el eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes). En este procedimiento, las células de levadura se incuban en presencia de cicloheximida inhibidor de la traducción. Las alícuotas de células se recogen inmediatamente después y en puntos específicos de tiempo después de la adición de cicloheximida. Las células se lisaron, y los lisados ​​se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida for análisis de transferencia Western de la abundancia de proteínas en cada punto de tiempo. El procedimiento de persecución cicloheximida permite la visualización de la cinética de degradación de la población en estado estacionario de una variedad de proteínas celulares. El procedimiento puede utilizarse para investigar los requisitos genéticos para y las influencias ambientales sobre la degradación de proteínas.

Introducción

Las proteínas desempeñan funciones cruciales en prácticamente todos los procesos celulares. Muchos procesos fisiológicos requieren la presencia de una proteína específica (o proteínas) durante un período de tiempo determinado o en circunstancias particulares. Por lo tanto, los organismos supervisan y regulan la abundancia de proteínas para satisfacer las necesidades celulares 1. Por ejemplo, las ciclinas (proteínas que controlan la división celular) están presentes en fases específicas del ciclo celular, y la pérdida de los niveles de ciclina regulados se ha asociado con la formación de tumores malignos 2. Además de regular los niveles de proteína para satisfacer las necesidades celulares, las células emplean mecanismos de control de calidad de degradación para eliminar mal plegadas, las moléculas de proteína sin ensamblar, o de otra manera aberrantes 3. El control de la abundancia de proteínas implica regulación tanto de la síntesis de macromoléculas (transcripción y traducción) y la degradación (proteólisis y la decadencia de ARN). degradación de la proteína alterada o excesiva contribuye a múltiples patologías, Incluyendo el cáncer, fibrosis quística, enfermedades neurodegenerativas, y trastornos cardiovasculares 4-8. Por lo tanto, los mecanismos proteolíticos representan dianas terapéuticas prometedoras para una gama de enfermedades 9-12.

Análisis de proteínas en un solo punto de tiempo (por ejemplo, mediante transferencia Western 13, 14 citometría de flujo o microscopía de fluorescencia 15) proporciona una instantánea de la abundancia de proteínas en estado estacionario sin revelar las contribuciones relativas de la síntesis o degradación. Del mismo modo, reportero ensayos basados ​​en el crecimiento reflejan los niveles de proteína en estado estacionario durante un período de tiempo prolongado sin discriminar entre las influencias de la síntesis y degradación de 15-20. Es posible inferir la contribución de los procesos de degradación a los niveles de proteína en estado estacionario mediante la comparación de la abundancia antes y después de la inhibición de los componentes específicos del mecanismo de degradación (por ejemplo, mediante la inactivación de la prote farmacológicamenteasome 21 o la anulación de un gen de la hipótesis de ser necesarios para la degradación 13). Un cambio en los niveles de proteína en estado estacionario después de la inhibición de rutas de degradación proporciona una fuerte evidencia de la contribución de la proteolisis con el control de la abundancia de proteínas 13. Sin embargo, este análisis todavía no ofrece información sobre la cinética de rotación de proteínas. Persecución cicloheximida seguido por el Western Blot supera estas deficiencias, permitiendo a los investigadores visualizar la degradación de proteínas con el tiempo 22-24. Además, debido a la detección de proteínas cicloheximida siguiente persecución se realiza típicamente por el Western Blot, isótopos radiactivos y largos pasos de inmunoprecipitación no son necesarios para la persecución cicloheximida, a diferencia de muchas técnicas de persecución de impulsos de uso común, que también se realizan para visualizar la degradación de proteínas 25.

La cicloheximida se identificó por primera vez como un compuesto con buen anti-hongoslazos producidos por la bacteria Streptomyces griseus gram-positivas 26,27. Es una molécula de células permeable que inhibe específicamente citosólica eucariota (pero no organellar) Traducción al alterar ribosomal translocación 28-31. En un experimento de cicloheximida persecución, se añade la cicloheximida a las células, y las alícuotas de células se recogen inmediatamente y en puntos de tiempo específicos después de la adición del compuesto 22. Las células se lisaron, y se analiza la abundancia de proteínas en cada punto de tiempo, típicamente por Western blot. Las disminuciones en la abundancia de proteínas después de la adición de cicloheximida se puede atribuir a la degradación de proteínas con confianza. Una proteína inestable disminuirá en abundancia con el tiempo, mientras que una proteína relativamente estable exhibirá poco cambio en la abundancia.

Mecanismos de degradación de proteínas selectiva han sido altamente conservado a lo largo Eukarya. Mucho de lo que se conoce acerca de la degradación de proteínas se supo por primera vez enel modelo eucariota unicelular, Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes) 25,32-36. Los estudios con levaduras es probable que continúen proporcionando nuevos e importantes conocimientos sobre la degradación de proteínas. Un método para la persecución de cicloheximida en células de levadura, seguido por Western blot de la abundancia de proteínas se presenta aquí.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Crecimiento y cosecha de células de levadura

  1. Si no el análisis de la cinética de degradación de una proteína de levadura endógena, transformar la cepa (s) de levadura deseada con un plásmido que codifica la proteína de interés. Métodos fiables para la transformación de levadura se han descrito previamente 37.
  2. Inocular la levadura en 5 ml de medio apropiado (por ejemplo, selectiva definida (SD) medio sintético para el mantenimiento del plásmido de las células transformadas o YPD) medio de levadura no selectivo extracto-peptona-dextrosa (para las células no transformadas). Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación.
    NOTA: 30 ° C es la temperatura óptima para el crecimiento de tipo salvaje típica cepas de levadura de laboratorio 38. Sin embargo, debido a que algunas cepas de levadura mutantes no crecen de manera óptima a 30 ° C y algunas proteínas sufren degradación dependiente de la temperatura, las temperaturas utilizadas para el crecimiento de células de levadura y Chase cicloheximida deben determinarse empíricamente 39.
  3. medir THdensidad óptica a 600 nm de correo (OD 600) de cada cultivo durante la noche.
    NOTA: Las células pueden estar en fase de crecimiento logarítmico o estacionario pero debe haber alcanzado mínimamente una densidad que permita la dilución hasta una DO 600 = 0,2 en 15 ml de medio fresco.
  4. Diluir los cultivos de una noche a un valor de DO 600 de 0,2 en 15 ml de medio fresco.
  5. Incubar levadura a 30 ° C, agitando hasta que las células alcanzan la fase de crecimiento semilogarítmica (es decir, una DO 600 entre 0,8 y 1,2).
  6. Durante el crecimiento de células de levadura, realice lo siguiente para prepararse para el procedimiento de cicloheximida grano:
    1. Establecer un bloque de calor que puede acomodar tubos de 15 ml cónicos a 30 ° C para la incubación de las células en presencia de cicloheximida. Añadir agua a los pozos del bloque de calor para permitir la distribución de calor eficiente a las culturas. Añadir agua a cada pocillo de tal manera que un tubo cónico de 15 ml hará que el nivel de agua a la altura de, pero no desborde, el labio del pozo.
    2. Establecer un segundo bloque de calor que puede acomodar tubos de 1,5 ml de microcentrífuga a 95ºC para la desnaturalización de proteínas después de la lisis celular.
    3. Pre-caliente medio de cultivo fresco (1,1 ml por punto de tiempo por la cultura para ser ensayadas) a 30 ° C.
    4. Añadir 50 l de 20x Detener la mezcla a tubos de microcentrífuga de pre-marcado (un tubo por el tiempo del punto por cultivo a ensayar). Colocar los tubos en hielo.
      PRECAUCIÓN: La azida de sodio, un ingrediente de 20x Detener la mezcla, es tóxico por ingestión o por contacto dérmico. Siga las recomendaciones del fabricante en la preparación, el almacenamiento y el manejo de azida de sodio. En caso de exposición accidental, consultar hoja de datos proporcionada por el fabricante.
  7. Cuando las células han alcanzado el crecimiento semilogarítmica, recoger 2,5 OD 600 unidades de cada cultivo por punto de tiempo a ensayar (por ejemplo, 7,5 OD 600 unidades para analizar la abundancia de proteínas en tres puntos de tiempo). Centrifugadora recogieron las células en 15 ml tubos cónicos a 3,000 xg a temperatura ambiente durante 2 min.
    NOTA: Una OD 600 unidad es igual a la cantidad de levadura presente en 1 ml de cultivo a una DO 600 de 1,0. El volumen de cultivo (en ml) que se requieren para cosechar X OD 600 unidades (V) se puede determinar mediante el uso de la siguiente ecuación: V = X OD 600 unidades / OD 600 de medición. Por ejemplo, para la cosecha de 7,5 OD 600 unidades de cultivo de células de levadura a una DO 600 de 1,0, recoger 7,5 OD 600 unidades / 1,0 = 7,5 ml de cultivo de levadura.
  8. Resuspender cada sedimento celular en 1 ml de 30 ° C (pre-calentado) medio de crecimiento fresco por 2,5 OD 600 unidades de células (por ejemplo, 3 ml de 7,5 OD 600 unidades).

2. La cicloheximida Caza

  1. Equilibrar las suspensiones de células de levadura por incubación durante 5 min en el bloque de calor C 30 °.
  2. Preparar un temporizador para contar a partir de las 0:00.
  3. Para comenzar la persecución cicloheximida, pulse el botón "Inicio" en el temporizador. Rápidamente,pero con cuidado, lleve a cabo los siguientes pasos:
    1. Añadir cicloheximida a una concentración final de 250 mg / ml a la suspensión de células de levadura primero (por ejemplo, añadir 37,5 l de 20 mg / ml de la cicloheximida a 3 ml de suspensión de células), y vortex brevemente para mezclar.
      PRECAUCIÓN: La cicloheximida es un irritante cutáneo y es tóxico por ingestión oral. Siga las recomendaciones del fabricante en la preparación, el almacenamiento y el manejo de cicloheximida. En caso de exposición accidental, consultar hoja de datos proporcionada por el fabricante.
    2. Inmediatamente después de la adición de cicloheximida y agitación en vórtex, la transferencia de 950 l (~ 2,4 OD 600 unidades) de la suspensión de células de levadura con cicloheximida añadido a un tubo de microcentrífuga de pre-marcado que contiene 50 l enfriado en hielo mezcla 20x de parada. Vortex el tubo de microcentrífuga, y el lugar en hielo hasta que se han recogido todas las muestras.
    3. Devolver la suspensión de células de levadura a 30 ° C.
  4. Repita los pasos 2.3.1 a 2.30.3 para cada una de las suspensiones de células de levadura restantes a intervalos de tiempo regulares (por ejemplo, cada 30 segundos, de manera que se añade a la cicloheximida la muestra # 1 a las 0:00, muestra # 2 a las 0:30, muestra # 3 a las 1:00 , etc.).
  5. En cada punto de tiempo posterior, las suspensiones de células de levadura vórtice y de transferencia de 950 l a tubos de microcentrífuga de marcado que contiene 50 l pre-refrigerada 20x parada Mix. Vortex y lugar recogido células en hielo. Salida 15 ml tubos cónicos de 30 ° C bloque de calor.
    1. Por ejemplo, para la recogida de las células 30 min después de la adición de cicloheximida (suponiendo 30-sec intervalos entre adición de cicloheximida a suspensiones de células de levadura al principio de la evolución en el tiempo) y agitar y remover 950 l de suspensión de células de la muestra # 1 en 30:00 . Repita para la Muestra # 2 a 30:30, y así sucesivamente.
      NOTA: para evitar la sedimentación de la levadura, las suspensiones de células de vórtice en tubos de 15 ml cónicos aproximadamente cada 5 min durante todo el curso de la persecución. Alternativamente, la suspensión de células de levaduras puede ser mantenido en un baño de agua agitando de forma continua durante la duración del experimento cicloheximida persecución.
  6. Cuando todas las muestras se han recogido, pellet recogió células por centrifugación a 6500 xg a temperatura ambiente durante 30 seg. Eliminar el sobrenadante con la pipeta o aspiración. Las células están ahora listas para la lisis alcalina. Como alternativa, complemento de congelación células se sedimentaron en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.

3. extracción de proteínas post-alcalina (Modificado de 16,40)

  1. Añadir 100 ml de agua destilada a cada sedimento celular. Volver a suspender pipeteando arriba y abajo o vórtex.
  2. Añadir 100 ml de NaOH 0,2 M a cada muestra. Mezclar pipeteando arriba y abajo o vórtex.
  3. Se incuban las células en suspensión a temperatura ambiente durante 5 min. En esta etapa, las células de levadura no se han lisaron, y las proteínas no se han publicado 40.
  4. Precipitar las células por centrifugación a 18.000 xg en los estribos habitaciónambiente durante 30 seg. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración.
  5. Para lisar las células, añadir 100 l de tampón de muestra Laemmli a cada sedimento celular. Volver a suspender pipeteando arriba y abajo o vórtex.
    NOTA: la incubación secuencial de las células con proteínas libera tampón de muestra de Laemmli y NaOH en una forma compatible con sodio dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando un sistema de tampón de Tris-glicina.
  6. Incubar a 95 ° C durante 5 minutos para desnaturalizar completamente proteínas.
    NOTA: La incubación a 95 ° C puede no ser adecuado para el análisis de las proteínas que son propensas a la agregación (por ejemplo, las proteínas con varios segmentos transmembrana). Estas proteínas pueden llegar a ser insoluble cuando se incuban a temperaturas elevadas 41. Por lo tanto, para el análisis de tales proteínas, los lisados ​​deben incubarse a temperaturas más bajas (por ejemplo, 37 ° C - 70 ° C) durante 10 - 30 min, como se determina empíricamente.
  7. lisados ​​centrifugar a 18.000 xga room temperatura durante 1 min para sedimentar el material insoluble. El sobrenadante (solubilizado proteína extraída) está listo para la separación por SDS-PAGE y análisis de transferencia western posterior. Como alternativa, las tiendas lisados ​​a -20 ° C.

4. Representante de SDS-PAGE y procedimiento de Western blot (Adaptado de 16)

  1. Carga de proteína estándares de peso molecular y el volumen determinado empíricamente de los lisados ​​en un gel de SDS-PAGE.
    NOTA: Elija el porcentaje de acrilamida y bis-acrilamida en el gel SDS-PAGE basada en el peso molecular de la proteína de interés. En general, inferiores geles porcentuales son más adecuados para la resolución de proteínas de mayor peso molecular.
  2. gel funcionar a 200 V hasta que el frente de colorante ha alcanzado el borde inferior del gel.
  3. Transferencia de las proteínas desde el gel a membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) por transferencia en húmedo a 20 V para 60 a 90 min a 4 ° C.
  4. Bloquear la membrana por incubación en Tris-solución salina tamponada (TBS) que contiene 5% de leche desnatada, oscilación, a temperatura ambiente durante 1 hr o a 4 ° C durante la noche.
    NOTA: Para evitar el crecimiento microbiano en la presencia de una membrana incubaron durante la noche, se recomienda incluir azida de sodio en la solución de bloqueo a una concentración final de 0,02%.
  5. Incubar la membrana con el anticuerpo primario específico para la proteína de interés en TBS con 0,1% de Tween-20 (TBS / T) y 1% de leche desnatada, oscilación, a temperatura ambiente durante 1 hr.
  6. Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose.
  7. Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en TBS / T con leche desnatada 1% a temperatura ambiente durante 1 hr, balanceo.
    NOTA: Los fluoróforos son sensibles a la luz. Por lo tanto, diluciones de anticuerpos conjugados con fluoróforos deben estar preparados en la oscuridad, y la incubación de las membranas en presencia de anticuerpos conjugados con fluoróforos y posteriores pasos de lavado debe ocurrir en prueba de luz (por ejemplo, envueltas en papel aluminio) containers.
  8. Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose.
  9. membrana de imagen utilizando LI-COR Odyssey CLx y el software Image Studio (o equipos de imagen comparable y software), siguiendo las recomendaciones del fabricante.
  10. Después de la adquisición de la imagen de la membrana, se incuba la membrana con un anticuerpo primario específico para una proteína de control de carga en TBS / T con leche desnatada 1% a temperatura ambiente durante 1 hr, balanceo.
  11. Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose.
  12. Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en TBS / T con leche desnatada 1% a temperatura ambiente durante 1 hr, balanceo.
  13. Lavar la membrana a temperatura ambiente de 3 x 5 min con TBS / T, meciéndose.
  14. membrana de imagen como en el paso 4.9.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Para ilustrar la metodología de persecución cicloheximida, la estabilidad de Deg1 -Sec62 (Figura 1), un sustrato modelo de levadura retículo endoplásmico (ER) -asociado degradación (ERAD), se analizó 42-44. En ERAD, de control de calidad enzimas ubiquitina ligasa se unen covalentemente las cadenas de la pequeña proteína ubiquitina a las proteínas aberrantes localizado en la membrana ER. Tales proteínas polyubiquitylated se retiran posteriormente de la...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

En este trabajo, se presenta un método para el análisis de la cinética de degradación de proteínas. Esta técnica se puede aplicar fácilmente a una gama de proteínas degradadas por una variedad de mecanismos. Es importante tener en cuenta que los experimentos de persecución cicloheximida informan sobre la cinética de degradación de la piscina en estado estable de una proteína dada. Otras técnicas pueden ser usadas para analizar la cinética de degradación de poblaciones específicas de las proteínas. Por ejemplo, el destin...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los miembros actuales y anteriores del laboratorio de Rubenstein por proporcionar un entorno de investigación entusiasta y de apoyo. Los autores agradecen a Mark Hochstrasser (Universidad de Yale) por compartir reactivos y experiencia. E.M.R. agradece a Stefan Kreft (Universidad de Konstanz) y Jennifer Bruns (Universidad de Pittsburgh) por compartir su valiosa experiencia en el análisis cinético de proteínas. Este trabajo fue apoyado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (R15 GM111713) a E.M.R., un premio de investigación ASPiRE de la Universidad Estatal de Ball a E.M.R., un premio de investigación del capítulo de Sigma Xi de la Universidad Estatal de Ball a S.M.E., y fondos de la Oficina del Rector y el Departamento de Biología de la Universidad Estatal de Ball.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cepas de levadura, plásmidos, medio estándar y componentes
deseados Tubos de vidrio de borosilicato desechablesFisher Scientific14-961-32Disponible en una variedad de fabricantes
Incubadora con regulación de temperatura (p. ej. Incubadora Heratherm Modelo IMH180)Dot Scientific 51028068Disponible en una variedad de fabricantes
Tambor intercambiable New Brunswick para tubos de 18 mm (rodillo de tubo)New BrunswickM1053-0450Se recomienda un rodillo de tubo para mantener durante la noche cultivos iniciadores de células de levadura en suspensión. Alternativamente, si no se dispone de un rodillo de tubo, se puede utilizar un agitador de plataforma en una incubadora con temperatura controlada para los cultivos iniciadores durante la noche. Se puede usar un agitador de plataforma o un rodillo de tubo para mantener cultivos más grandes en suspensión.
New Brunswick TC-7 Tambor de rodillos 120 V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004Para uso con rodillo de tubo
SmartSpec Plus EspectrofotómetroBio-Rad170-2525Disponible en una variedad de fabricantes
Centrífuga 5430Eppendorf5427 000.216 El rotor que se vende con unidad tiene capacidad para tubos de microcentrífuga de 1,5 y 2,0 ml. El rotor se puede cambiar por uno que contenga tubos cónicos de 15 y 50 ml
Rotor de ángulo fijo F-35-6-30 con tapa y adaptadores para centrífuga modelo 5430/R, 15/50 ml Tubos cónicos, 6 plazasEppendorfF-35-6-30
Tubo de rosca serigrafiado de 15 ml 17 x 20 mm cónico, polipropilenoSarstedt62.554.205Disponible en una variedad de fabricantes
Tubo flexible de 1,5 ml, Tubos de microcentrífuga naturales y limpios por PCREppendorf22364120Disponibles en una variedad de fabricantes
Calentadores analógicos Dri-BathFisher Scientific1172011AQSe recomienda disponer de dos calentadores (uno para incubar células durante el tratamiento con cicloheximida y otro para hervir lisados para desnaturalizar proteínas). Alternativamente, 30 ° El baño de agua C se puede utilizar para la incubación de células en presencia de cicloheximida. El baño de agua hirviendo con placa caliente se puede utilizar alternativamente para desnaturalizar proteínas.
Bloque calefactor para tubos cónicos de 12 x 15 mlFisher Scientific11-473-70Para usar con el calentador Dri-Bath durante la incubación de células en presencia de cicloheximida.
Bloque calefactor para 20 tubos cónicos de 1,5 mlFisher Scientific11-718-9QPara usar con el calentador Dri-Bath para hervir lisados para la desnaturalización de proteínas.
Aparatos de funcionamiento y transferencia, fuentes de alimentación y equipos de imagen o cuartos oscuros de SDS-PAGE para SDS-PAGE y transferencia a membranaVariará según el laboratorio y la aplicación
Sistema de adquisición de imágenes Western blot (p. ej. Escáner Li-Cor Odyssey CLx y software Image Studio)Li-Cor9140-01Variará según el laboratorio y la aplicación
EMD Millipore Immobilon Membranas de transferencia de PVDFFisher ScientificIPFL00010Variará según el laboratorio y la aplicación
Anticuerpos primarios (p. ej. Fosfoglicerato quinasa (Pgk1) Anticuerpo monoclonal de ratón (clon 22C5D8))Life Technologies459250Variará según el laboratorio y la aplicación
Anticuerpos secundarios (p. ej. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))Life TechnologiesA-21065Variará según el laboratorio y la aplicación
tampón

Referencias

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11(2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428(2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021(2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

An lisis por Western BlotInhibici n de la s ntesis de prote nasLisis de c lulas de levaduraSeparaci n por SDS PAGEAn lisis de requerimientos gen ticosEstudio de efectos ambientalesPoblaci n en estado estacionario

Artículos relacionados