El objetivo de este protocolo es demostrar las técnicas de aislamiento y cultivo de las células del músculo liso vascular primaria murino (CMLV) de la circulación coronaria. Una vez que se han aislado CMLV, que se pueden utilizar para muchas técnicas de cultivo estándar.
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Artículo de método
Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares
En este artículo
Resumen
Resumen
Mientras que el aislamiento y cultivo de las células del músculo liso vascular (CMLV) de buques de gran tamaño está bien establecida, hemos tratado de aislar y cultivar las CMLV de la circulación coronaria. Corazones con arcos aórticos intactos se retiraron y se sometieron a perfusión a través de Langendorff retrógrada con solución de digestión que contiene 300 unidades / ml de inhibidor de tripsina de soja ml de colagenasa tipo II, 0,1 mg / 1 y M CaCl 2. Los perfundidos se recogieron a intervalos de 15 min durante 90 min, se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en medio de siembra, y se sembraron en placas de cultivo de tejidos. CMLV se caracterizaron por la presencia de SM22α, α-SMA y vimentina. Una de las principales ventajas del uso de esta técnica es la capacidad de aislar las CMLV de la circulación coronaria de los ratones. Aunque el pequeño número de células obtenidas pueden limitar algunas de las aplicaciones para las que se puedan usar las células, CMLV coronarias aisladas se puede utilizar en una variedad de técnicas de cultivo celular bien establecidos y ASSAys. Los estudios que investigan las CMLV de ratones modificados genéticamente pueden proporcionar más información sobre los procesos de señalización asociados con patologías vasculares estructura-función y.
Introducción
El objetivo de este método es aislar células de músculo liso vascular (CMLV) de la circulación coronaria murino para uso en cultivo de células y ensayos de cultivo celular estándar. Hemos desarrollado esta técnica para evaluar los mecanismos moleculares de la remodelación vascular en diabetes. Hemos informado anteriormente hacia el interior remodelación hipertrófica en las arteriolas coronarias septales en el modelo de ratón db / db de la diabetes 1. Debido a la limitada cantidad de tejido que se encuentra en las coronarias septales murinos, técnicas experimentales estándar que investigan cambios en las proteínas (por ejemplo, Western blot) en rat....
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Protocolo
Declaración de Ética: Este estudio se realizó de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud, el cual fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión en el Hospital Nacional de Niños.
1. Preparación / Configurar
Nota: Esta técnica de aislamiento requiere dos serpentines de calefacción Langendorff de lado a lado posicionado en un soporte de anillo, y conectado en paralelo a un baño de agua circulante.
- A su vez en baño de agua circulante y ajustar la temperatura para alcanzar una temperatura final de 33-34 ° C en la punta de la cánula de Langendorff (el baño de agua utilizado en esta configuración se establece en....
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Resultados
Debido al aspecto novedoso de nuestra técnica de aislamiento CMLV coronaria, hemos tratado de determinar la pureza de la celda de aislamiento. CMLV coronarias de ratón se identificaron en base a su morfología y tinción de inmunofluorescencia hasta el paso 2. Basándose en la morfología de las células en cultivo después del primer lavado, el procedimiento de aislamiento elimina eficazmente los miocitos cardíacos y las células endoteliales. Las CMLV conservan su morfología hasta el paso 2 <.......
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Discusión
El propósito de este estudio fue adaptar los protocolos de aislamiento de células existentes para aumentar el rendimiento de liso vascular coronaria del corazón murino. La mayor parte del trabajo pionero en la biología del músculo liso vascular se realizó con células de músculo liso de aorta de rata cultivadas. Estos estudios proporcionan conocimientos fundamentales de los mecanismos moleculares que controlan el crecimiento de VSMC, migración y la hipertrofia 7. Sin embargo, como el campo avanzaba, se hizo ev.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01HL056046 a PAL y K99HL116769 a AJT), y el Instituto de Investigación del Hospital Nacional de Niños (para PAL y AJT).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Suero fetal bovino | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M solución | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (Alta Glucosa, Piruvato de Sodio, L-Glutamina) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Filtro de células estériles 100 µ m malla de nylon | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Plato de polistrene con tapa, estéril, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus sutura de seda negra 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Colagenasa Tipo-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Inhibidor de la tripsina de soja 25 mg | Sigma | T6522 | |
| Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (1x), líquida (transparente) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (1x), líquida (rojo de fenol) | Life Technologies | 14170-161 | |
| Bobina de calentamiento de 5,0 ml con trampa de burbujas de desgasificación | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus bomba | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Bomba | cualquier marca funcionará |
Referencias
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al.
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Reimpresiones y permisos
