La aplicación secuencial de cubreobjetos de vidrio para evaluar la compresión Rigidez de la lente del ratón: tensión y el análisis morfométricos

Resumen

Los aumentos relacionados con la edad en la rigidez del cristalino del ojo están relacionados con la presbicia. Este protocolo describe un método sencillo y rentable para medir la rigidez de la lente del ratón. Las lentes de ratón, al igual que las lentes humanas, se vuelven más rígidas con la edad. Este método es preciso y se puede adaptar para lentes de animales más grandes.

Resumen

El lente del ojo es un órgano transparente que refracta y enfoca la luz para formar una imagen nítida en la retina. En los seres humanos, los músculos ciliares contrato para deformar la lente, lo que lleva a un aumento de la potencia óptica de la lente para enfocar objetos cercanos, un proceso conocido como alojamiento. cambios relacionados con la edad en la rigidez de la lente se han vinculado a la presbicia, una reducción en la capacidad de la lente 'para acomodar, y, por extensión, la necesidad de gafas de lectura. A pesar de que las lentes de ratón no se acomodan o desarrollar la presbicia, modelos de ratón pueden proporcionar una herramienta invaluable para patologías genéticas de lentes de comprensión, y el envejecimiento acelerado observado en ratones permite el estudio de los cambios relacionados con la edad en la lente. Este protocolo se muestra un método simple, preciso y rentable para la determinación de la rigidez de la lente ratón, utilizando cubreobjetos de vidrio para aplicar secuencialmente creciente cargas de compresión sobre la lente. Representante de datos confirman que las lentes de ratón se vuelven más rígidos con la edad, comolentes humanos. Este método es altamente reproducible y potencialmente se puede escalar hasta mecánicamente lentes de ensayo de los animales más grandes.

Introducción

El cristalino es un órgano transparente y avascular en la cámara anterior del ojo que es responsable del enfoque fino de la luz en la retina. Una membrana basal transparente, llamada cápsula del cristalino, rodea una masa de células de fibra alargada cubiertas por una monocapa anterior de células epiteliales^1,2. El crecimiento a lo largo de la vida del cristalino depende de la continua proliferación y diferenciación de las células epiteliales en el ecuador del cristalino en nuevas células de fibra que se añaden a las generaciones anteriores de células de fibra de forma concéntrica². Con el tiempo, las células de fibra del cristalino se compactan, lo que da como resultado un centro rígido en el centro del cristalino llamado núcleo¹. La acomodación, definida como un cambio dióptrico en la potencia óptica del ojo, ocurre en los seres humanos cuando los músculos ciliares se contraen para deformar el cristalino y permitir un verdadero aumento en la potencia óptica para^{enfocar objetos} cercanos. En el ojo no acomodado, el cristalino se mantiene en un estado relativamente aplanado debido a la tensión de las fibras zonulares. Cuando los músculos ciliares se contraen, se libera la tensión en el cristalino, lo que provoca una disminución del diámetro ecuatorial del cristalino y un aumento del grosor axial. Los cambios relacionados con la edad en el cristalino causan presbicia, una pérdida progresiva de la acomodación del cristalino, lo que lleva a la necesidad de gafas de lectura.

Varios estudios han relacionado la presbicia con el aumento de la rigidez intrínseca del cristalino relacionado con la edad^6-11. La rigidez se define como la resistencia de un objeto elástico a deformarse bajo la carga aplicada. Se han utilizado una variedad de métodos para examinar la rigidez de las lentes humanas, incluida la compresión de espín^12-14, la compresión del actuador¹⁵, la indentación de la sonda¹⁶, el análisis mecánico dinámico ^6,10 y la fuerza de radiación acústica basada en burbujas¹⁷. Si bien las lentes de ratón no se adaptan ni desarrollan presbicia, los modelos de ratón para patologías del cristalino son herramientas valiosas porque los ratones son menos costosos que los animales más grandes, están bien caracterizados genéticamente y experimentan cambios acelerados relacionados con la edad debido al rápido envejecimiento. Un puñado de estudios han examinado la rigidez del cristalino en ratones con métodos de compresión y han demostrado cambios en la rigidez del cristalino debidos al envejecimiento o a alteraciones genéticas específicas^18-21. Por lo tanto, las lentes de ratón son buenos modelos para estudiar los cambios relacionados con la edad en la rigidez de la lente.

Este protocolo describe un método de compresión simple y económico, pero preciso y reproducible, para determinar la rigidez de la lente del ratón basado en la aplicación de cubreobjetos de vidrio sobre la lente junto con la fotografía de la lente a través de un microscopio de disección y un espejo. Este método proporciona datos morfométricos y de deformación robustos con un aparato fácil de fabricar y ensamblar. Los resultados representativos confirman que las lentes de ratón aumentan su rigidez con la edad.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio por los Institutos Nacionales de Salud y en virtud de un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Instituto de Investigación Scripps.

1. Lente Disección

1. La eutanasia a los ratones de acuerdo a las recomendaciones de los Institutos Nacionales de la Salud "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" y protocolos para el uso de animales institución aprobados.
2. Enucleación del ojo de los ratones utilizando pinzas curvas. Presione el tejido alrededor del ojo con las pinzas para llevar el ojo de la toma, y ​​luego arrancar el ojo de la toma con las pinzas. Transferir a los ojos frescos de fosfato 1x (PBS) en el plato de la disección.
3. Cortar el nervio óptico tan cerca del globo ocular como sea posible. Suavemente y con cuidado inserte pinzas rectas finas en el globo ocular a través del orificio RCEste el nervio óptico sale de la parte posterior.
4. Con cuidado, hacer una incisión con tijeras en el globo ocular de la posterior hasta el borde de la córnea. lentes de roedores ocupan ~ 30% de los ojos. Hacer estas incisiones cuidadosamente, y no introduzca pinzas o tijeras demasiado profundo en el ojo para no dañar la pantalla.
5. Corte a lo largo de la unión entre la córnea y la esclerótica al menos a mitad de camino alrededor del globo ocular.
6. Empuje suavemente sobre la córnea para extraer el cristalino del ojo a través de la abertura que se hace en los pasos 1.4 y 1.5.
7. Utilice pinzas finas punta recta para quitar cuidadosamente cualquier escombros grandes que todavía está unido a la lente. una inspección visual de la lente de los daños antes de proceder a las mediciones de rigidez.

2. Las mediciones de rigidez

1. Se pesan por lo menos 10 cubreobjetos de la misma caja utilizando una balanza analítica. Encontrar el peso medio de los cubreobjetos. Por consistencia, utilizar la misma caja de cubreobjetos para todos los experimentos. Pre-húmedaLos cubreobjetos y en ángulo recto espejo en 1x PBS a temperatura ambiente durante al menos 2 horas antes de comenzar los experimentos.
2. Llenar la cámara de medición (véase la Figura 1) con 65 - 75 ml de 1x PBS. La cámara de medición fue hecha de plexiglás por un taller de maquinaria en la empresa, y las chuletas en la cámara fueron realizadas por un taladro de columna ajustado a la profundidad deseada con una broca apropiada. Objetivos, permanecen transparentes en 1X PBS a temperatura ambiente durante la duración de la prueba mecánica.

Figura 1:. Rigidez cámara de medición Una foto que muestra las dimensiones de la cámara de medición de la rigidez a la medida con una variedad de chuletas de diferentes profundidades y formas. Las chuletas redondas que son 200 micras o 300 micras (puntas de flecha de color amarillo) de profundidad se utilizan para las mediciones en las lentes de ratón. Divots son 2 mm de diámetro y 13 ~-. 14 mm del borde de la cámara Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Coloque espejo de ángulo recto en la cámara a una distancia constante de la chuleta que se utiliza para mantener la lente. Asegúrese de que el espejo no se mueve durante el experimento.
4. Transferencia de lentes de diseccionados a la cámara de medición cuidadosamente con unas pinzas o fórceps curvos incautación.
5. Tome una vista superior de imagen de la lente descargada directamente desde arriba. Tome fotos de lentes de ratón en un aumento de 30x con la iluminación del microscopio de disección (abajo) y una fuente de luz de fibra óptica en los lados izquierdo y derecho. Establecer la fuente de alimentación de fibra óptica a 80% de la intensidad máxima de la luz. Ajustar la salida de la fuente de alimentación basado en la iluminación ambiental, las preferencias del usuario y la calidad de la imagen según sea necesario.
6. Tome una imagen de vista lateral de la lente sin carga, que puede ser visto a través de la riEspejo GHT-ángulo. Si la cámara no está calibrado, tomar una foto del borde del espejo en el enfoque. El borde del espejo es de 5 mm de largo, y esta medición más adelante se puede utilizar para determinar la píxeles / mm y servir como una barra de escala en las imágenes.
7. Lugar objetivo en la chuleta, y confirme que la lente esté firmemente asentada y recta en la chuleta. Tome una fotografía de la lente antes de la carga. La lente debe estar descansando en la chuleta en su anterior o polo posterior.
8. Coloca 1 cubreobjetos con cuidado sobre la lente. Espere 2 minutos para permitir la fluencia, y tomar otro lado-vista de los cuadros de la lente cargado.
9. Continuar añadiendo cubreobjetos como en el paso 2.8 y teniendo lado a ver las imágenes después de la adición de cada cubreobjetos como en el paso 2.8 hasta que se haya aplicado un total de 10 cubreobjetos.
10. Eliminar todos los cubreobjetos. Espere 2 minutos, y tomar una vista lateral de imagen de la lente (dentro y fuera de la chuleta) tras retirar todos los cubreobjetos.

Medición de la lente 3. Núcleo

1. para determine el tamaño núcleo del cristalino, la lente para mover una placa de Petri limpia llena de PBS 1x.
2. decapsulate suavemente la lente con unas pinzas finas rectas.
3. Desprenderse de las células de las fibras corticales rodando la lente entre los dedos enguantados. El núcleo del cristalino restante se sentirá como un duro mármol. Use este procedimiento para aislar el núcleo de las lentes para adultos a partir de 1 mes de edad. Puesto que el núcleo aislado es un cuerpo rígido, más pruebas mecánica del núcleo de la lente no se puede realizar el uso de este método descrito.
4. Enjuague suavemente el núcleo de la lente en 1x PBS en la placa de Petri.
5. Coloque el núcleo de la lente de nuevo en la cámara de medición (no en la chuleta), y tomar una imagen del núcleo de la lente a través del espejo en ángulo recto.

Figura 2:. A Objetivos de ratón comprimido por cubreobjetos (A) Esquema y (B) Fotografía de la exconfiguración experimental que muestra una lente de 2 meses de edad de ratón en una chuleta 200-m de profundidad en la cámara de medición llena de 1x PBS. Un espejo de ángulo recto y una cámara digital montada en un microscopio de disección se utilizaron para recoger imágenes de la lente durante la compresión por cubreobjetos. (C) Fotos de puntos de vista sagital de una lente de tipo salvaje de 2 meses de edad, comprimido por el número de cubreobjetos sucesivamente crecientes proporcionó los datos en bruto para medir diámetros axiales y ecuatoriales y el cálculo de las deformaciones axiales y ecuatoriales durante las pruebas de compresión basada en cubreobjetos. Un reflejo de la lente a veces se puede ver en los cubreobjetos (más claramente visible la imagen de la 1 cubreobjetos in). Cuando se hacen mediciones, ignorar la reflexión y medir hasta el vértice de la lente. (D) Fotos de vistas sagitales de los 2 meses de edad, la lente de tipo salvaje después de la compresión y el núcleo del cristalino aislado. La lente posterior a la compresión y el núcleo aislado están sentados fuera de la chuleta. Las barras de escala, 1 mm. Esta cifra se modificó a partir de Gokhen, et al. PLoS ONE, 2012 ^19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis 4. Imagen

1. Medir diámetros ecuatoriales y axiales de las lentes antes de la carga y después de cada etapa de carga usando ImageJ o software similar. Medir el diámetro de cada núcleo de la lente. El núcleo de la lente es casi esférica por lo que una medición en cualquier orientación será suficiente ^19,21.
2. Corregir la lente axial diámetros mediante la adición de la profundidad de la chuleta utilizado. En la cámara de medición, el divot oscurecida 200 micras (lentes 2 meses de edad de ratón) o 300 micras (lentes de ratón 4 meses de edad y 8 meses de edad) de el espesor axial de la lente.
3. Calcular la axial y cepas ecuatoriales de las mediciones de diámetro de la lente usando la ecuación, ε = (d - d ₀₎ / d _0, donde ε es la cepa, d es el axial o correoQuatorial diámetro a una carga dada, y d ₀ es el diámetro axial o ecuatorial correspondiente a carga cero.
4. Trazar la axiales y ecuatoriales cepas en función de la carga impuesta (en mg).
5. Trazar la axial, ecuatorial y diámetros nucleares. Calcular y representar gráficamente la relación de aspecto de la lente dividiendo el diámetro axial por el diámetro ecuatorial.
6. Calcular y representar gráficamente el volumen de la lente usando la ecuación, volumen = 4/3 π × × r _E ² × r _A, donde r es el radio _E y r ecuatorial _A es el radio axial medida a partir de la imagen tomada en el paso 2.6. Esta ecuación asume que el objetivo es un esferoide achatado (elipsoide) ^1,22.
7. Calcular y representar gráficamente el volumen nuclear usando la ecuación, volumen = 4/3 π × × r _N ^3, donde r _N es el radio del núcleo de la lente como se mide desde la foto tomada en el paso 3.5. Esta ecuación supone que el i núcleo de la lentesa esfera ^19,21.
8. Calcular y trazar la fracción nuclear como la relación del volumen nuclear con el volumen de la lente.

Resultados

La rigidez y dimensiones de 2, 4 y 8 meses de edad lentes de ratón se midieron. Los ratones fueron todos los animales de tipo silvestre en un fondo de pura cepa C57BL6 obtenido a partir de la instalación de cría de animales TSRI y cada lente se cargó con 1 a 10 cubreobjetos. Las cepas axiales y ecuatoriales se calcularon como una función de la carga aplicada por la medición de la axial y diámetros ecuatorial de la lente después de la adición de cada cubreobjetos, y luego la normalización...

Discusión

Hay varias consideraciones clave al utilizar este método para medir la rigidez de la lente. En primer lugar, los cubreobjetos se aplican a la lente en un ángulo ligeramente oblicuo (8-8,5 °) con respecto a la parte inferior de la cámara (θ). Esto se aplicará un componente muy pequeño de la carga ecuatorial en lugar de axialmente. Sin embargo, esta carga ecuatorial se considera insignificante porque el pecado θ ≈ 0,1 ^19. Si este método se adapta para lentes más grandes, tendría que ser medida para determinar s...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinza recta de punta fina	Fine Scientific Tools	11252-40
Tijeras de microdisección, borde recto	Fine Scientific Tools	15000-00
Pinzas curvas	Fine Scientific Tools	11272-40
Pinzas de agarre	Hammacher	HSC 702-93	Plato
disección	Fisher Scientific	12565154
Placa de Petri de 60 mm	Fisher Scientific	0875713A
1x solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Life Technologies	14190
18 x 18 mm cubreobjetos de vidrio	Fisher Scientific	12-542A
medición con hendiduras para sujetar lentes			Hecho a medida (ver Figura 1)
Espejo en ángulo recto	Edmund Optics	45-591
Fuente de luz	Schott/Fostec	8375
Microscopio de disección iluminado	Olympus	SZX-ILLD100	Con fototubo SZ-PT
Cámara digital	Nikon	Coolpix 990