Abstract
Optisk superupplösning med strukturerad belysning mikroskopi (SIM) är en nyckelteknik för visualisering av processer på molekylär nivå i den kemiska och biomedicinska vetenskaperna. Även kommersiella SIM system finns tillgängliga, system som är specialanpassade utformade i laboratoriet kan överträffa kommersiella system, den senare typiskt utformad för enkel användning och allmänna tillämpningar, både när det gäller bildbehandling trohet och hastighet. I denna artikel presenteras en fördjupad guide till att bygga ett SIM-system som använder total inre reflektion (TIR) belysning och kan avbildning upp till 10 Hz i tre färger och en upplösning nå 100 nm. På grund av kombinationen av SIM-kortet och TIRF ger systemet bättre bildkontrast än konkurrerande tekniker. För att uppnå dessa specifikationer är flera optiska element används för att möjliggöra automatiserad kontroll över polarisationstillståndet och rumsliga struktur belysnings ljus för alla tillgängliga excitation wavelengths. Fullständig information om genomförande och kontroll hårdvara ges för att uppnå synkronisering mellan excitationsljus mönster generation, våglängd, polarisation tillstånd, och kamerakontroll med betoning på att uppnå maximal förvärv bildhastighet. Ett steg-för-steg-protokoll för systemjustering och kalibrering presenteras och den uppnåeliga upplösningen förbättringen valideras ideal testproverna. Möjligheten för video-rate superupplösning demonstreras med levande celler.
Introduction
Under det senaste ett halvt decennium har super-upplösning mikroskopi mognat och flyttade från specialiserade optik labb i händerna på biolog. Kommersiella mikroskop finns lösningar för de tre huvudsakliga varianter för att uppnå optisk superupplösning: enda molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM), stimulerade utarmning emissions mikroskopi (STED), och strukturerad belysning mikroskopi (SIM) 1,2. SMLM såsom photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) och stokastiska optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM) har varit de mest populära tekniker, till stor del på grund av enkelheten i optiska setup och löftet om hög rumslig upplösning, lätt ner till 20 nm. Emellertid super-resolution mikroskopi via enda molekyl lokalisering kommer med en inneboende kompromiss: den rumsliga upplösningen som kan uppnås är beroende av att ackumulera ett tillräckligt antal enskilda fluoroforenhetema lokaliseringar, därav begränsar den temporala upplösningen. Imaging dynamisk processes i levande celler blir därför problematiskt eftersom ett fullgott sätt prov rörelse strukturen av intresse för att förhindra rörelseartefakter samtidigt skaffa tillräckligt med lokaliserings händelser under den tiden för att rekonstruera en bild. För att möta dessa krav har levande cell SMLM demonstrationer erhållit erforderliga ökningen av fluoroforen photoswitching priser genom att kraftigt öka excitation makt, och detta leder i sin tur till fototoxicitet och oxidativ stress, vilket begränsar provöverlevnadstider och biologisk relevans 3.
En klar fördel med STED över både SIM och SMLM är att det kan bilden med superupplösning i tjocka prover, t ex lateral upplösning på cirka 60 nm uppnåddes i organotypiska hjärnan skivor på djup upp till 120 ^ m 4. Imaging vid sådana djup med enda mål implementeringar av SMLM eller SIM är ogenomförbar, men blir möjligt med antingen enda molekyl ljus ark eller galler ljus ark microscopy 5. Video-rate STED har också påvisats och används för att kartlägga synaptiska vesikler rörlighet, men hittills har begränsats till avbildning små synfält 6.
För tillämpningar inom cellbiologi och självmonterings reaktioner molekylär 7 - 12 som kräver avbildning med hög tidsupplösning under många tidpunkter, strukturerad belysning mikroskopi (SIM) kan vara väl lämpad eftersom det inte är beroende av fotofysikaliska egenskaperna hos en viss fluorescerande sond. Trots denna fördel för SIM, fram till nu dess användning har i huvudsak begränsad till avbildning fixerade celler eller långsamma processer. Detta är på grund av begränsningar i kommersiellt tillgängliga SIM-system: förvärv bildfrekvens på dessa instrument har begränsats av rotationshastigheten hos de gitter används för att generera de erforderliga sinusbelysningsmönster samt polarisationsbevarande optik. Den senaste generationen av kommersiell SIMinstrument klarar av snabb avbildning, men de är oöverkomligt dyrt att alla utom centrala avbildningsmöjligheter.
Detta protokoll presenteras en guide till konstruktionen av ett flexibelt SIM-system för avbildning av snabba processer i tunna prover och nära den basala ytan av levande celler. Den sysselsätter total inre reflektion fluorescens (TIRF) för att generera en belysningsmönster som tränger djupare än ca 150 nm i provet 13 som avsevärt minskar ofokuserad bakgrundssignal. Idén att kombinera SIM med TIRF är nästan lika gammal som SIM sig 14 men inte insett experimentellt före 2006 15. Den första in vivo bilder som erhållits med TIRF-SIM rapporterades under 2009 16 uppnå frame rates på 11 Hz att visualisera tubulin och kinesin dynamik, och två färg TIRF-SIM-system har presenterats 17,18. Senast, en guide för konstruktion och användning av en enda färg två-beam SIM sYSTEM presenterades med bildhastigheter på upp till 18 Hz 19,20.
Upplägget presenteras här är i stånd att SIM superupplösning på 20 Hz i tre färger, varav två kan drivas i TIRF-SIM. Hela systemet är uppbyggt runt ett inverterat mikroskop ram och använder sig av en motordriven xy translationssteg med en piezo-manövrerad z skede. Att generera sinusexciteringsmönster som krävs för TIRF-SIM, systemet presenterades använder en ferroelektrisk (Spatial Light Modulator SLM). Binära gittermönster visas på SLM och de resulterande ± 1 diffraktionsordningar filtreras, förmedlas och fokuseras i TIR ring objektiv. De nödvändiga fasförskjutningar och rotationer av gitter tillämpas genom att ändra den visade SLM bilden. Detta protokoll beskriver hur man bygger och rikta en sådan exciteringsbana, detaljer anpassningen av banan utsläpp, och presenterar testprov för att säkerställa optimal inriktning. Det från också beskrivs hur de frågor och utmaningar som är speciella för hög hastighet TIRF-SIM om polarisering kontroll och synkronisering av komponenter.
Design Överväganden och begränsningar
Innan du monterar TIRF-SIM-systemet som presenteras i detta protokoll, det finns flera konstruktionskrav att överväga som avgör valet av optiska komponenter. Alla förkortningar av optiska komponenter se figur 1.
Spatial Light Modulator (SLM)
En binär ferroelektrisk SLM används i denna installation eftersom den kan under millisekund mönster växling. Gråskala nematisk SLM kan användas, men dessa erbjuder kraftigt reducerad kopplingstider. Vardera på eller av bildpunkt i en binär fas SLM förlänar antingen en π eller 0 fasförskjutning till den infallande plan vågfront, därför om ett periodiskt gitter mönster visas på SLM den kommer att fungera som en fas diffraktionsgitter.
ent "> total intern reflektion (TIR) För att uppnå TIR och producera ett evanescent fält, måste infallsvinkeln av exciterings- strålarna vid glas-prov gränsyta att vara större än den kritiska vinkeln 
. Detta ställer den minsta infallsvinkeln som krävs, och därmed även den maximala avstånd, eller tid, av den flyktiga belysningsmönster. Den maximala infallsvinkel 
(Acceptansvinkeln) begränsas av den numeriska aperturen (NA) hos objektivlinsen som kan beräknas från definitionen 
. Detta bestämmer minimi mönstret avstånd uppnås enligt Abbe formel 
som förbinder NA och våglängd 
till ett minimum mönsteravståndet
Rekonstruktion av TIRF-SIM bilder kräver förvärv av minst tre fas skift per mönster rotation därför SLM mönster perioden måste vara delbart med tre (se figur 1). Till exempel kan en period av 9 bildpunkter för 488 nm-belysning och 12 pixlar för 640 nm-belysning. För en omfattande diskussion om SLM mönsterdesign, inklusive delpixel optimering av mönsteravstånd använder klippta galler, Se tidigare arbete Kner et al. 16 och Lu-Walther et al. 20 Placeringen av de två exciterings fokus måste vara inne i TIR ring för alla våglängder, men diffraktionsvinkeln av ± 1 order från SLM är våglängden beroende. För standard SIM, kan flerfärgsbildalstring uppnås genom optimering av gitterperioden för den längsta våglängden, och tolerera en förlust i prestanda för de kortare kanaler. För TIRF-SIM dock optimera för en våglängd betyder att den andra våglängden fokus är inte längre inom TIR ringen. Exempelvis med användning av ett gitter period av 9 bildpunkter är tillräcklig för att ge TIRF för 488 nm, enligt de foci är vid 95% av diametern hos den bakre öppningen och inom TIR ringen, men för 640 nm denna period skulle positionera foci utanför öppningen. Av denna anledning olika pixelmönster mellanrum måste användas för varje exciteringsvåglängd.
Anpassningen av TIRF-SIM excitationsvägenär extremt känslig för små förändringar i positionen för den dikroiska spegeln (DM4 i figur 1) i mikroskopkroppen, mycket mer så än i konventionell SIM. rekommenderas inte användning av en roterande filter kub torn, istället använda en enda flerbands dikroisk spegel, som hålls i ett fast läge och utformats speciellt för exciteringsvåglängder som används. Det är viktigt att endast de högsta kvalitet dikroiska speglar används. Dessa kräver tjocka substrat av minst 3 mm, och ofta betecknas som "imaging platta" av tillverkarna. Alla andra substrat leder till oacceptabla avvikelser och bildförsämring i TIRF-SIM.
polarisationsstyrning
Att uppnå TIRF-SIM är det väsentligt att rotera polarisationstillståndet hos excitationsljuset i synchronicity med belysningsmönstret på sådant sätt att det förblir azimutalt polariserat i den objektiva pupillplanet med avseende på den optiska axeln (dvs.. s-polariserade). Inriktning av polariseringsstyr optik kommer att bero på den specifika optiska elementet användas, t ex en Pockels-cell 21, eller en halv våg plattan i en motordriven rotationssteget 22. I detta protokoll en anpassad flytande kristaller variabel retarder (LCVR) används, utformad för att ge full-wave (2π) hämmande över våglängdsområdet 488-640 nm, eftersom det möjliggör snabb (~ ms) växling. Om man använder en flytande kristall retarder är det väsentligt att använda en hög kvalitet komponent: standardkomponenter är vanligtvis inte tillräckligt stabila för att ge en konstant hämmande förmåga över längden av kamerans exponeringstid som leder till en suddig ut ur belysningsmönstret och låg moduleringskontrast . Flytande kristallretar är också starkt temperaturberoende och kräver inbyggd temperaturkontroll.
Synkronisering
Lasrarna måste synkroniseras med SLM. Binära ferroelektriska SLM internt viktad switching mellan ett på-tillstånd och fråntillstånd. Pixlarna bara fungera som en halv våg plattor i antingen deras på eller av staten, men inte under interomkopplingstiden. Därför bör stängas lasrarna endast under on / off stater via LED aktiveringssignalen från SLM för att förhindra en minskning av mönster kontrast till följd av mellanliggande tillstånd av pixlarna. En akusto-optisk modulator (AOM) skulle alternativt kunna användas som en snabb slutare om lasrarna inte kan digitalt modulerad.
Val av linser
Baserat på dessa begränsningar, till önskad förstoringsreduktion av SLM planet på preparatplanet ge de önskade belysningsmönster kan fastställas. Detta medger beräkning av de brännvidder på de två linserna L3 och L4 i bildrelä teleskopet och excitation kondensorlins L5. I detta system en 100X / 1.49NA oljeimmersionsobjektiv används med 488 nm och 640 nm excitation, använder därmed brännvidder på 300 och 140 mmför L4 och L3, och 300 mm för L5, vilket ger en total förstoringsreduktion av 357X, vilket motsvarar en SLM pixelstorlek på 38 nm vid preparatplanet. Med användning av denna kombination av linser, SLM gitterperioder 9 för 488 nm-belysning och 12 bildpunkter för 640 nm ger mönsteravstånd på 172 och 229 nm vid provet, motsvarande infallsvinklar av 70 ° och 67 ° respektive. För ett glas vatten gränssnitt, är den kritiska vinkeln 61 °, och är oberoende av våglängd, därför dessa två mönster avstånd tillåter TIRF excitation för båda våglängderna. En objektivlins utrustad med en korrekturring är användbar för korrigering av sfärisk aberration som införs genom variationer i täckglas tjocklek, eller om drift vid 37 ° C.
bildrekonstruktion
En gång har förvärvats rå SIM data är det en fråga om beräknings ansträngning för att generera superupplösta bilder i en två-stegsprocess. För det första har belysningsmönstret som skall fastställas förvarje bild och för det andra måste komponenterna i SIM-spektrum separeras och rekombineras på lämpligt sätt så att fördubbla den effektiva OTF stöd (se figur 6, infällningar).
Exakt kunskap om de planerade belysningsmönster är av största vikt, eftersom de superupplösta frekvenskomponenter måste vara oblandad så exakt som möjligt för att förhindra artefakter som orsakas av kvarvarande delar av överlappande komponenter. Vi bestämmer belysningsmönsterparametrar i efterhand från råbilddata enligt det förfarande som införts av et al. Gustafsson 23 Kort sagt, en uppsättning belysningsparametrar som beskriver en normaliserad tvådimensionell sinus har hittas för var och en av 
exciteringsmönster 
:
Härmed 
och 
beskriver frans kontrast och mönstret inledningsfasen av varje enskild bild m respektive. Komponenterna hos vågvektorn, 
och 
Endast förändras med olika inriktningar 
av mönstret och kan antas vara annars konstant. Att grovt bestämma komponenterna hos vågvektorn en korskorrelation av rå bildspektra utförs, som raffineras genom tillämpning av sub-pixel skift till en av de tvär korrelerade bilder för att optimera överlappningen. Detta sker via multiplikation av verkliga rymd fas gradienter 
att inducera en subpixel förskjutning i frekvens-utrymme. Observera att det är bra att ha en god uppskattning av våg-vektorerna innan själva mönstret uppskattningen och detta kan hittas genom att avbilda en fluorescerande pärla skikt.
Eftersom fas steg mellan skiftade mönster är 
, Ie. 
, Separation av frekvenskomponenter kan utföras av en Fourier-trans längs "fas axel". Den globala fas 
och frans kontrast kan sedan bestämmas med användning av komplex linjär regression av olika komponenter. De individuella separerade komponenterna kombineras sedan med användning av en generaliserad Wiener-filter. För en detaljerad beskrivning av både parameter utvinning och genomförande av den generaliserade Wiener filter vi hänvisar läsaren till Gustafssonet al. 23 där samma algoritm används.
Protocol
1. Ordna och Justera excitationsvägen
- Markera placeringen av komponenterna på den optiska bordet (se figur 1 för en översikt över den optiska installationen). Separera målet, linser L3, L4, L5, och SLM vardera av summan av deras respektive brännvidder så att SLM ytan kommer att skickas på fokalplan målet.
- Sätt flera kant dikroisk spegel DM4 i filter kuben torn av mikroskopstativet.
- Sätt den andra dikroiska spegeln DM3 i en en "fyrkantig kinetisk spegel montera, och placera den en brännvidd från samlingslinsen L5.
Notera: Denna excitation väg konstruktion innehåller två identiska dikroiska speglar DM3 och DM4 som tas från samma tillverkningssats för att säkerställa identiska optiska egenskaper. Den dikroiska spegeln (DM4) är placerad så att de S- och p- axlar omkopplas jämfört med den dikroiska belägen i mikroskopet (DM3) därigenom avbryta någonpolarisering ellipticitet infördes genom dess dubbelbrytning (Figur 1). Denna ersättning fungerar lika bra för varje belysningsvåglängd. Detta steg är nödvändigt för att upprätthålla hög modulation kontrast. - Innan du sätter alla linser i exciteringsbanan, definiera exakt den optiska axeln för systemet.
- Ta objektiv (OB) från tornet och istället skruva i en justeringsredskapet. Denna består av en 500 mm lång optisk bur-system med två inriktningsskivor i båda ändar.
- Använda den dikroiska spegeln DM3 och ett temporärt inriktnings spegel placerad vid den ungefärliga senare lokalisering av SLM för att styra en kollimerad referensstråle från laser 1 genom centrum av hålen i de två inriktningsskivor. Rikta strålen från laser 1 till den tillfälliga spegel såsom visas i fig 1 med användning av tre speglar och dikroisk spegel DM2. Den tillfälliga spegel på SLM positionen måste vara nära vinkelrät mot den optiska axeln.
- Bort justeringsverktyget när det grova optiska axeln har varit determined.Insert en iris i strålgången innan den inträder i mikroskopi kroppen och centrera den på balken. Fäst ett vitt kort med ett litet hål centrerat på iris.Reinsert objektiv (OB).
Notera: Strålen lämnar målet kommer nu att vara i hög grad divergenta, men det kommer att bli en mycket svag reflektion från den bakre ytan av den lins som kommer att vara synlig på den vita kortet. Alla linser, även om de är antireflexbelagd, kommer att ha svaga tillbaka reflektioner som kan användas för att säkerställa koaxiell inriktning. Om strålen är exakt vinkelrät mot linsen sedan den återreflektion kommer att gå tillbaka genom centrum av iris - Gör iterativa vinkel justeringar av två speglar (DM3 och inriktning spegel på SLM position) för att centrera tillbaka reflektionkortet med den inkommande strålen. Tillfälligt ta bort objektiv (OB) och markera laserpunkten på taket för att skapa en referensposition.
- Infoga ett par av irisar på höjden av referensstrålen utmed de gängade hålen i tabellen. Strålen bör vara parallell med ytan av den optiska tabell. Den optiska axeln är nu definierad.
- Sätt kondensorn linsen (L5) ungefär en brännvidd från målet. Montera denna lins på en linjär translationssteg uppsättning för att översätta längs riktningen av referensstrålen.
- Justera samlingslinsen position och vinkel så att strålen lämnar målet är kollimerad och träffar referens plats på taket. Kontrollera att linsen är vinkelrät mot strålen genom att återigen kontrollera återreflektion med iris och vitt kort. Ta objektiv (OB) och sätt den andra linsen av bilden relä teleskopet (L4).
Notera: Att säkerställa korrekt kollimering och icke-böjning av varaam underlättas när det finns ett jämnt antal linser i strålgången. - Justera position och vinkel denna lins med hjälp av en linjär förflyttning skede att upprätthålla kollimation och säkerställa referensstrålen fortfarande träffar den markerade platsen på taket.
- Byt objektiv (OB) och sätt den första linsen av teleskopet (L3). Justera position och vinkel denna lins för att säkerställa kollimering och icke-böjning, som beskrivs i tidigare steg.
- Montera SLM-chip på en gimbal fäste som ger rotation utan översättning om mitten av spånytan.
Obs: Den specifika monterings utformningen beror på SLM används. Om SLM levereras utan ett fäste, bör det fastställas att en anpassad bearbetas aluminiumplåt som sedan är fäst vid en lins kardanupphängning fäste. - Med linserna i linje, för in SLM i stället för spegeln. Justera positionen av SLM så att referensstrålen ligger vid centrum av SLM-chip, och justera ettGLE så att strålen passerar genom de två relälinser (L3 och L4). Kontrollera att referensstrålen fortfarande är centrerad på den markerade platsen.
- Expandera och kollireferensstrålen med hjälp av en Keplerian balk expander.
- Montera de två linser (L1 och L2) i en bur-system för enkel justering.
- Centre buren systemet på referensstrålen genom att avlägsna linserna och ersätta dem med iris.
- Sätt in de två linserna och justera den axiella positionen för L2 att kollimera den expanderade strålen med användning av en skjuvande interferometer. L2 bör vara en fokallängd bort från ytan av SLM.
- Kontrollera att den utökade balken fortfarande kollimeras efter de två relä linserna L3 och L4. Använd skär interferometer strax efter DM3 för att kontrollera kollimering.
- När exciteringsbanan har anpassats för en enda våglängd, par de andra två lasrar i strålgången. Styra varje stråle genom två iris centrerad på excitation sökväg medbalk kombinerar dikroiska speglar (DM1 och DM2).
2. Anpassning av Polarisering Rotator
- Montera LCVR med sin snabba axel vid 45 ° mot infallande polarisationen.
- Finjustera polarisering vinkel strålen händelsen till LCVR med hjälp av en akromatisk halv våg plattan (HWP) genom att föra in HWP och LCVR mellan korsade polarisatorer. Vrid HWP att minimera den överförda effekten.
Obs: För att fungera som en variabel polarisationsrotator, måste snabba axeln hos vätskekristall retarder (LCVR) exakt i linje vid 45 ° mot infallande vertikala balken polarisation. Den LCVR är fysiskt monterad vid 45 °, men detta är bara en grov inriktning. Den HWP används för att säkerställa perfekt 45 ° inriktning av den infallande polariseringen med avseende på den LCVR snabba axeln. Kvartsvågplattan (QWP) omvandlar den lutas elliptisk polarisation som induceras av den LCVR tillbaka till linjär polarisation vid en vinkel som styrs av den pålagda spänningen24. - Sätt i QWP efter LCVR och rotera den för att anpassa sin långsamma axeln till den inkommande polariseringen genom att minimera den överförda effekten mellan korsade polarisatorer.
3. Justering av utsläpps Path
- Grov placera kameran med hjälp av en korsbordsskalorna och transmitterat ljus.
- Fokus på hårkorset med hjälp av mikroskop okularen och fixera objektiv vid denna position.
- Ungefär centrera kameran och flytta kamerans position för att få bilden av hårkorset i fokus genom att observera bilden på skärmen.
Obs: Om en extern filterhjulet används sedan filter kuben inte kommer att innehålla ett emissionsfilter, därför okularen får inte användas när lasrar är påslagna.
- Finjustera kamerans position med hjälp av en fluorescerande pärla prov.
- Förbered en monolager av fluorescerande pärlor genom att sprida en droppe 100 nm multicolor pärlor på en # 1,5 täckglas. Låt dry att adsorbera pärlorna till coverglass och sedan åter ner i vatten.
- Placera vulsten provet på målet med immersionsolja. Fint justera läget för kameran på sådant sätt att det fluorescerande pärla skiktet är i fokus. Justera inte objektiv läge när fokus har hittats.
OBS: Eftersom SLM måste vara i ett plan konjugerat till provplanet, placeringen av SLM, relä linser och mål måste fastställas. För att justera fokus, flytta provet axiellt i stället för mål med hjälp av en piezo z-scenen.
- Generera lämpliga SIM binära gittermönster som bitmap-filer.
- För 2D / TIRF-SIM, generera en serie av 9 binära gitter bilder tre mönsteroriente vardera 3 jämnt fördelade fasförskjutningar. Generera dessa numeriskt (med hjälp av MATLAB till exempel) från en roterad 2D sinus med en fasförskjutning tillämpas sedan tröskling för att producera en binär bild. Se Kompletterande kodfiler till exempel kod.
- för alignment ändamål, också generera gittermönster som har till fönster av en liten cirkulär öppning för var och en av de 3 orienteringar, såsom visas i figur 2. De fönsterinriktnings gittren behöver inte vara externt utlöst men kan manuellt kopplas om av användaren via SLM: s programvara.
Obs: Se referenser för en diskussion om de optimala rotationsvinklarna och ett exempel på galler mönster generation kod 16,20.
- Ladda bitmappsbilderna till SLM enligt tillverkarens programvara (till exempel MetroCon).
- Ladda SLM styrprogram och klicka på "Connect".
- I "Repertoire" -fliken, klicka på "Load" för att öppna repertoaren filen och kontrollera antalet Running Order finns i filen. I exemplet repertoaren filen ges finns fem springa beställningar.
- Klicka på "Skicka till styrelsen" för att ladda upp repertoaren filen till SLM.
- Vänta bitmappsbilderna att ladda upp ennd för enheten att automatiskt starta om.
Notera: Ett exempel repertoar fil, som innehåller gitter bitmappsbilder och en fil fastställa i vilken ordning, ingår som ett kompletterande kodfil. Den ".repz" fil kan öppnas med hjälp av ZIP-fil arkivet programvara.
- Visa en fönsterinriktningsgaller på SLM för första orientering (t ex 0 °).
- I SLM styrprogram, välj "Status" fliken, ange numret på den körklart skick (i fallet med exempelfilen, detta Running Order "1").
- Klicka på "Välj" för att ändra körklart skick till inriktningsgaller.
Obs: Detta kommer att belysa en liten rund region i provplanet. Om SLM ytan är korrekt konjugerad till preparatplanet sedan kanterna av denna region kommer att vara kraftigt i fokus. Gittermönstret kommer att producera multipla diffraktionsordningar i fokus för L3: den nollte ordningens reflektion från den reflekterande bakplan av denSLM, -1 och +1 order motsvarande gallret och även svagare högre order som uppstår från diffraktion av interna faktorer som är specifika för SLM-enheten (t.ex.. Reflektioner av de interna ledningar av SLM pixlar och oegentligheter vid pixelkanterna) . Alla men -1 och +1 order måste filtreras bort.
- Infoga en rumslig mask (SM) som är monterad i ett x, y skede i strålgången vid fokalpositionen för L3, och översätta dess läge med avseende på den optiska axeln på sådant sätt att endast de önskade första beställningarna får passera. Direkt efter den rumsliga filtret kommer endast två cirkulära strålar vara synlig.
Obs: Den rumsliga masken är tillverkad genom stansning 6 hål in i aluminiumfolie med användning av en nål. Hålen bör vara tillräckligt stora för att passera de första ordningens strålar för alla laservåglängder. En detaljerad analys av den rumsliga masken finns i hänvisning 20. - Visa nästa orientering inriktningsgaller (60 °, körklart 2) och återigensäkerställa att endast de första order släpps genom den rumsliga mask, justera sin position om det behövs.
- Upprepa för den slutliga orientering (120 °, körklart skick 3).
- Kontrollera bilden av den fluorescerande pärla skiktet på kameran. Om de två cirkulära balkarna inte är överlappande, såsom visas i fig 2 rikta sedan preparatplanet genom iterativ justering av objektivlinsen och kamerans position.
- Justera neutralt läge för att överlappa de två strålarna som kommer att föra bilden oskarp. Flytta kameran för att få tillbaka bilden i fokus och finjustera målet om två cirklar är fortfarande synliga. Upprepa denna process tills de två strålarna överlappar varandra och en enda cirkulär region är i fokus.
- När läget för provplanet har ställts in, hålla målet i samma läge.
- För att bekräfta TIRF belysning, bild en lösning av fluorescerande färg, till exempel för en 488 nm excitationsvåglängd, använd en lösning av 1081; M rodamin 6G.
- Bringa färgämnet provet i fokus. Om de två strålarna infaller på rätt TIRF vinkel då enstaka molekyler kommer att vara synlig utan hög bakgrund och kanter den cirkulära öppningen kommer att vara i fokus. Se figur 2B-D för exempel inriktade och dåligt anpassade TIRF balkar.
- Visa varje orientering av fönstergaller i sin tur och se till att alla tre inriktningar ge TIRF belysning och att de två strålarna överlappar varandra på preparatplanet. Fina justeringar av positionen av strålarna kan göras genom att justera dikroisk spegel DM3.
Obs! Även om olika våglängder fokuseras vid något olika positioner på grund av axiell kromatisk aberration, är detta inte kritiskt och kan korrigeras genom att en konstant z-offset till provposition före excitering med den andra våglängden.
4. systemsynkronisering och kalibrering
- Placera pärla mono sgott om målet och sätta i fokus.
- Programmera SLM med hjälp av dess styrprogram för att visa var och en av de tre fasskiftsdata bilder i tur och ordning, för det första mönstret orientering (0 °).
- Med hjälp av styrprogram SLM, byta till Running Order 4 i exemplet repertoaren.
- Konfigurera kameran med förvärvet programvara (till exempel HCImage) till utgång två signaler: en positiv och en negativ TTL triggsignal under den globala exponeringstiden. I kamerans programvara, under "avancerad kamera egenskaper", ställa Output Trigger Kind 1 och 2 till "Exposure" och Output Trigger polaritet 1 och 2 till "positiv" och "negativ" respektive.
- Anslut Utgång 1 och 2 i kameran till "Trigger" och "Finish" ingångarna på SLM respektive använder koaxialkablar. SLM är nu synkroniserad till kameran.
- Skaffa en serie av 3 bilder.
- I "Sekvens" rutan, välj &# 34; Hårddisk Record "som skanningstyp, och ställa in bild räkna till tre.
- Klicka på "Start" för att förvärva 3 ramar. SLM mönstret ändras vid varje exponering. De fluorescerande pärlor i bilden ser ut att blinka på och av mellan var och en av de 3 bilder. Mängden blinkande är en skriv ur den module kontrast hos den sinusformade belysningsmönstret.
- Vrid polarisering av excitation laser med LCVR använder anpassade programvara för att uppnå azimutal polarisering och därmed den högsta modulerings kontrast för givet mönster orientering.
- Ladda LCVR kalibreringsprogram.
- Ange 0 och 8 för de minsta och största spänning respektive.
- Klicka på "Sweep LCVR Voltage" för att rotera polarisationen.
Obs! LCVR hämmande är en funktion av temperaturen och kan glida dag till dag även med temperaturkontroll. I detta steg är optimal azimutal polarisering hittas empiriskt genom Sweeping den pålagda spänningen mellan dess lägsta och högsta spänning som har effekten av att rotera polarisationen incident på provet. Moduleringskontrast beräknas för varje spännings 25 och spänningen som uppnår topp kontrast används i de följande stegen. - Vänta kalibreringsprocessen att slutföra, och anteckna den uppmätta spänningen.
- Upprepa denna kalibreringsprocess för de återstående två mönsteroriente (60 ° och 120 °) och var och en av exciteringsvåglängder.
- Synkronisera kamerans exponering med LCVR, laser, emissionsfilterhjul och piezo z steg 26. För att åstadkomma detta, använda en hög hastighet datainsamling (DAQ) ombord som huvudklockkälla för systemet, och använda SLM LED Aktivera utsignal att modulera laser (se figur 3B).
Obs! Specifikt genomförande är beroende av de komponenter som används, men användningen av en hög hastighet DAQ ombord för digital trigger synkronisering och styrning av LCVR med användning av en analog spänning, som styrs via mjukvara, rekommenderas. Styr programvara som används i detta protokoll finns tillgänglig på begäran. - På grund av axiell kromatisk aberration, för varje våglängd, gäller också en z-förskjutning till provstadiet.
- Beräkna längden experimentellt genom att fokusera på en flerfärgad pärla monolager provet vid den första våglängden (t.ex.. 488 nm) sedan byta till den andra (t ex. 640 nm). Kulorna kommer nu att vara ur fokus.
- Omfokusera vulsterna och mäta förändringen i z-positionen som behövdes. Denna förskjutning kan sedan appliceras till den piezo z-stadium varje gång excitationsvåglängden ändras.
- Använda SLM styrprogram, växla SLM körklart skick eller hela serien av 9 binära gitterbilder som krävs för TIRF-SIM. Detta är Running Order 0 i exemplet repertoaren.
- Med hjälp av programvaran kamera kontroll, förvärva 9 bilder av pärla provet.
- Klicka på "Start" för att få bilder.
- Spara förvärvade bilder som TIFF-filer genom att välja "TIFF" som bildtypen i "Spara Buffered Images" fönster, och klicka på OK.
Obs: För vår mikroskop använder vi anpassade rekonstruktion kod utvecklas både internt och Lin Shao 27.
Representative Results
Multi 100 nm diameter fluorescerande pärlor avbildades att jämföra standard TIRF till TIRF-SIM och kvantifiera uppnåeliga förbättringen i lateral upplösning (Figur 4A - B). Rekonstruktion av råramar till super upplösning utfördes med användning av standardalgoritmer som det beskrivs i litteraturen 27,28. Det framgår att TIRF-SIM har klart betydligt högre lateral upplösning jämfört med TIRF. Punktspridningsfunktionen (PSF) i ett mikroskop är väl approximeras med bilden av en enda sub-diffraktion storlek fluorescerande pärla, därför PSF och upplösningen kan kvantifieras genom att montera 2D Gaussfunktioner individuella pärlor för varje våglängd. Den beräknade upplösning mikroskop baserad på medelvärdet av den fulla bredden halv maximal (FWHM) är 89 nm och 116 nm för 488 och 640 nm TIRF-SIM respektive (Figur 4C). Detta motsvarar en två-faldig impromang i lateral upplösning för båda våglängder jämfört med den teoretiska diffraktionsbegränsad fall. Fluorescerande amyloidfibriller är också ett utmärkt prov för att visa fördubblats upplösning (Figur 4D). Amyloidfibriller bildades in vitro genom inkubering av β-amyloid märkt med 10% rodamin derivat färgämnen (488 nm excitation) för en vecka och därefter avbildning med TIRF-SIM. Se referens 12 för mer information.
Subcellulära strukturer med hög kontrast som emGFP märkta mikrotubuli (figur 5B, G) eller LifeAct-GFP (Figur 5D) är idealiska för TIRF-SIM avbildning och ger hög kontrast super-upplösning. TIRF-SIM avbildning med installationen som beskrivs i detta protokoll gör det möjligt för observation av en sub-population av mikrotubuli som ligger i närheten av basalcells cortex, och mikrotubuli polymerisering och depolymerisering kan be sett över tiden (animerad figur 1). Inte alla prover är mottagliga för avbildning med TIRF-SIM, i synnerhet låg kontrast prover utan diskreta strukturer. Celler som uttrycker cytosoliskt GFP saknar information av hög upplösning bortsett från vid kanterna av plasmamembranet (figur 5F, H och animerade figur 2) och är därmed optimal för TIRF-SIM avbildning som de resulterande rekonstruktioner är i huvudsak TIRF bilder överlagrade med artefakter. I sådana prover kan den ökning av kontrasten ofta hänföras till deconvolution steget av rekonstruktionsalgoritmen.
Hög module kontrast är avgörande för en framgångsrik SIM avbildning. Fouriertransformen av den rekonstruerade bilden tillåter visualisering av SIM optiska överföringsfunktionen (OTF) (Figur 6A, inlägg). Utan att maximera moduler kontrasten för varje orientering genom att azimutala polärnisering med en polarisationsrotator, det finns mycket lite modulering av den högupplösta informationen i provet vilket leder till en låg signal-till-brusförhållandet i SIM-passbanden. Rekonstruktion algoritmer som använder standard Wiener filter tillvägagångssätt kommer bara förstärker bruset i SIM-passband och ger en bild som är i huvudsak en standard TIRF bild överdragen med hexagonal (eller "honeycomb") ringande artefakter (Figur 6A, högra panelen). En möjlig förbättring skulle kunna vara att använda iterativa 29,30 eller blinda rekonstruktionsalgoritmerna 31,32 för att reducera dessa artefakter beroende på typ av prov. Vi rekommenderar användning av ImageJ plugin SIMcheck att kontrollera kvaliteten på SIM-data innan och efter ombyggnad 33.
Figur 1:. Layout av Multi TIRF-SIM Inställning TIRF-SIM mimikroskop består av tre huvuddelar, balken genereringsenheten, mönstret projektionsenheten, och detekteringsenheten. I balken genereringsenheten, är tre olika lasrar i linje på samma strålgången via dikroiska speglar (DM1 och DM2) och riktas genom fyra optiska element för polarisationsstyrning. Först, en polarisator (P) säkerställer renheten av den linjära polarisationstillståndet hos var och en av laserstrålarna. Följande tre optiska element behövs för att rotera polarisationen på ett snabbt och automatiserat sätt som beskrivits i detalj i texten. Efteråt två linser (L1 och L2) i ett teleskop konfiguration expandera strålen för att matcha den aktiva ytan hos den spatiala ljus-modulatorn (SLM) och är avböjda in i tre strålar av SLM prognostiserade binära gittermönster (exempel visas i plattor 1- 9). Polarisationstillståndet hos belysningsljuset i förhållande till SLM mönster visas som en pil. En andra teleskop (L3 och L4) de-förstorar mönstret och ger dig tillgång till the Fourier plan SLM mönster. I denna plan en rumslig mask (SM) används för att filtrera ut den centrala komponenten och andra oönskade diffraktion komponenter från pixelated struktur SLM och dess interna ledningar. Innan de två återstående strålarna fokuseras på det bakre fokalplanet av målet (OB) via kondensorn linsen (L5) är två dikroiska speglar (dm3 och DM4) som ingår i installationen. DM4 fungerar som en konventionell dikroisk spegel i fluorescensmikroskopi att separera belysning från emitterade ljuset. Men denna spegel framkallar oundvikligen ellipticitet i polarisationstillståndet hos belysningsljuset som kan kompenseras genom DM3, en dikroisk spegel från idealt samma parti som DM4. Oljeimmersions TIRF målet har en tillräckligt stor NA för att direkt inleda två motriktade vågorna på täckglas som reflekteras helt och ger upphov till ett strukturerat evanescent fält i täckglas. Provet är monterad på en xyz översättning skede. Upptäckt är perfOrmed genom samma mål och DM4 i transmission, plus en ytterligare filtrering genom bandpassemissionsfilter, monterat i en datorstyrd filterhjul (EFW). Slutligen är bilden projiceras på en sCMOS kameran genom den inre mikroskopröret lins (L6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Justering av överlappande strålar (A) En SLM gitter mönster fönster med en cirkulär öppning är användbar för justering. Om två icke-överlappande strålar syns på kameran (till vänster), sedan läget för provplanet måste flyttas genom iterativ justering av axiella positionerna för objektiv och kamera för att ge en enda cirkulär belysningspunkt (höger). Balkarna måste överlappa i order att producera sinusexciteringsmönster som krävs för TIRF-SIM. Om balkarna inte till fullo överlappar detta minskar synfältet över vilken interferensmönstret bildas. (B och C) Den exakta infallsvinkel av strålarna är viktigt för TIRF-SIM. Om vinkeln är felaktig, kommer en av strålarna inte vara på önskad vinkel för TIRF och detta är väl synlig när avbildning ett fluorescerande färgämne lösning. En balk har en infallsvinkel som är större än den kritiska vinkeln som ger den cirkulära plats, och den andra inte, vilket leder till den ljusa strimma till vänster på bilden i (B). (D) Inställning av vinkeln på spegeln DM3 ger båda strålarna infaller på samma vinkel, och detta kan valideras genom defokusering målet: om rätt linje, bör XZ projektion av ett z stapel av ett fluorescerande färgämne prov visar två symmetriskt korsande balkar med försumbar bakgrund påfokus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Synkroniserings beroenden av de olika systemkomponenter (A) för snabb SIM förvärvet är viktigt synkronisering av systemkomponenter med hjälp av en hårdvarubaserad lösning. (B) En dataupptagningskortet (DAQ) bör användas som en master trigger. En TTL signal från DAQ styrelse skickas till sCMOS extern ingång och används för att utlösa kamerans exponering. Kameran Global exponering utgång utlöser sedan SLM att visa ett galler mönster, och SLM LED Aktivera utgång används för att digitalt modulera laser excitation så att lasern endast avger när SLM pixlarna är i "på" tillstånd. Efter exponeringen är komplette, är kameran Global exponering utgång som används för att föra SLM mönstret till nästa galler fas eller vinkel. DAQ styrelse matar också en analog spänning till LCVR för att styra den linjära polarisationstillståndet hos belysningsstrålen. Denna spänning kopplas efter förvärvet av 3 fas bilder för varje mönster vinkel. Efter förvärvet av 9 bilder för en enda våglängd, matar DAQ ombord en signal till emissionsfilterhjul controller, och byter till nästa våglängd. DAQ ombord gäller också en z-offset till provet genom att mata ut en analog spänning till z-scenen piezo controller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: TIRF-SIM avbildning av prover av 100 nm multicolor pärlor och fluorescens Labelled amyloidfibriller. (A och B) Jämförelse av standard TIRF jämfört med TIRF-SIM rekonstruktioner för 488 nm och 640 nm excitation. (C) Histogram av full bredd halv-maximum (FWHM) av Gauss passar till TIRF-SIM pärlor visar det förväntade förbättringen. (D) TIRF kontra TIRF-SIM av p-amyloid fibriller märkta med 10% rodaminderivat färgämne (488 nm excitation). Skalstrecken = 1 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Levande cell TIRF-SIM Imaging Jämförelse av konventionell TIRF och TIRF-SIM bilder av (A, B) mikrotubuli (emGFP-tubulin) i en HEK293-cell, (C, D (E, F) cytosoliskt GFP i en HEK293-cell. Bilder i B och F är enstaka tidpunkter från filmerna. Boxed Områdena visas förstorat i (G, H). Skalstrecken = 3 fim. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:. Inverkan av polarisationsrotatorn på Rekonstruerade Bead Images (A) Utan användning av en polarisationsrotator såsom en LCVR, är signal-till-brusförhållandet i SIM-passbanden låg vilket resulterar i karakteristiska hexagonala artefakter i den rekonstruerade SIM bilder (höger), (B) i 2D-SIM, de strukturerade belysningsmönster är direkt synliga i Fourieromvandla de råbilder (vänster, markerade excitation spatial frekvens) eftersom de faller inom en radie av emissions OTF stöd, men i TIRF-SIM, de är utanför OTF stöd och inte synlig därför (höger). I detta fall måste mönstermodule kontrast bedömas med hjälp av en gles pärla monolager, som beskrivs i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7:. Spatial Light Modulator Baserat mönsterritning kan tillämpas för övriga avbildningsmetoder såsom multifokal SIM (A) I MSIM, ett galler med kvadrat pointsdisplayed på SLM (infälld) ger ett galler av diffraktionsbegränsad fokus på bildplanet. Ett tunt skikt av låg koncentration rodamin 6G avbildas till videoanläggning Lize det härdar. Mönstret är översatt över provet (B) och den förvärvade råa bilden z-stack rekonstrueras för att generera en bild med reducerad out-of-fokus ljus (C). Skalstrecken = 5 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Animerad figur 1. Tid Serie Film på EmGFP-tubulin i en HEK293 Cell Snabb polymerisation och depolymerisation av emGFP märkta mikrotubuli kan observeras med hjälp av TIRF-SIM. Bilder förvärvats med hjälp 50 ms exponeringstid per rå ram (450 ms per SIM ram) placeras ut med 0,5 sek. Exponeringstiden användes begränsades av ljusstyrka fluoroforen, inte av hastigheten på kameran eller SLM. 3988movie1.mov "target =" _ blank "> Klicka här för att se filmen.
Animerad figur 2. Tid Serie film av cytosoliska GFP i en HEK293 cellprover med låg kontrast som denna inte är idealiska prover för TIRF-SIM avbildning. Retrograd flödesmembranet kan ses i TIRF bilder men TIRF-SIM inte ge någon ytterligare information förutom vid cellkanterna. TIRF-SIM bilder förvärvades med användning av 50 ms exponeringstid per rå ram (450 ms per SIM ram) placeras ut med 5 sek. Klicka här för att se filmen.
Kompletterande kodfil: Exempel SLM repertoar fil (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3).d / 53988 / 48449_300us_1-bit_Balanced.seq3 "> Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil. Exempel SLM repertoar fil (period9_001.bmp) Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil. Exempel SLM repertoar fil (period9_002.bmp) Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil. Exempel SLM repertoar fil (period9_003.bmp) Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil: Exempel SLM repertoire fil (period9_004.bmp). Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil. Exempel SLM repertoar fil (period9_005.bmp) Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil. Exempel SLM repertoar fil (period9_006.bmp) Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil. Exempel SLM repertoar fil (period9_007.bmp) Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil. Exempel SLM repertoar fil (period9_009.bmp) Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil. Exempel SLM repertoar fil (period9_mask_1.bmp) Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil. Exempel SLM repertoar fil (period9_mask_2.bmp) Klicka här för att ladda ner filen. >
Kompletterande kodfil. Exempel SLM repertoar fil (period9_mask_3.bmp) Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil. Exempel SLM repertoar fil (TIRF-SIM_example.rep) Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil. Exempel galler generation kod (en av två) (generate_gratings.m) Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil: Exempel galler generation kod (2 av 2) (circular_mask.m).= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53988/circular_mask.m"> Klicka här för att ladda ner filen.
Kompletterande kodfil. Exempel kod för att beräkna modulation kontrast (calculate_contrast.m) Klicka här för att ladda ner filen.
Discussion
Skräddarsydda TIRF-SIM system såsom installationen beskrivs i detta protokoll är kapabla att flerfärgad superupplösning med hög hastighet jämfört med kommersiellt tillgängliga mikroskop. Den inneboende fördelen med SIM som en super-resolution tekniken är att den temporala upplösningen inte är begränsad av de fotofysik av fluoroforen, jämfört med andra metoder, såsom enda molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM) eller punktscanningsmetoder såsom stimulerad utarmning utsläpps mikroskopi ( STED). Till skillnad från dessa andra tekniker, inte SIM inte kräva photoswitchable eller tömmas fluoroforer så flerfärgsbildalstring är okomplicerad. Icke TIRF-SIM-system, till exempel optisk sektione SIM och multifokal SIM kan oftast uppnå upplösning förbättringar av 1,7 gånger eller mindre i praktiken i motsats till faktor förbättring 2 redovisas här, och kommersiella system är också ofta långsammare och mindre flexibelt än systemet presenteras i detta protokoll.
"> De två största svårigheterna vid genomförandet av denna teknik är för det första att det är nödvändigt för exakt positionering av de sex SIM balkar inom TIR zonen av målet rygg öppning, vilket kräver en mödosam och tidskrävande optisk inriktning förfarandet. För det andra, för att producera hög mönster kontrast på provet, är polariseringsrotations viktigt. för låga NA 2D-SIM-system, kan polariseringsrotation undvikas genom noggrant val av linjär polarisation orientering, men det blir omöjligt för TIRF-SIM 25. för hög hastighet flerfärgsbildalstring, elektro- optisk polarisering kontroll är nödvändig och detta ökar komplexiteten och kostnaden för systemet.Begränsningar av tekniken
TIRF-SIM, som konventionell TIRF, är naturligtvis begränsad till observation av biologiska strukturer och processer som ligger på den basala cellmembranet som kan belysas av 150-200 nm penetration av försvinnande fält. MedanSIM citeras ofta som mindre photodamaging till celler än antingen STED eller SMLM, inte i sidled fördubbling upplösning fortfarande öka erforderligt antal fotoner med åtminstone fyra gånger fem jämfört med konventionell TIRF mikroskopi. För avbildning med hög bildfrekvens med korta exponeringar gånger, kräver detta foton ökning användning av ökade belysningsnivåer. Även om alla fluorofor kan användas för SIM avbildning av fasta eller långsamma prover, hög ljusstyrka fluorescerande proteiner eller nästa generations syntetiska färgämnen med förbättrad fotostabilitet rekommenderas för levande cell imaging.
Även om detta genomförande är i stånd att avbilda en enda färg på SIM-frame rates på över 20 Hz, är flerfärgsbildalstring i den presenterade systemet begränsas av omkopplingstiden för motordrivna emissionsfilterhjulet. På grund av den stora storleken på sCMOS kamerachip, skulle användningen av ett flerbandsemissionsfilter och bild skärare optik vara möjligt och medge samtidig jagmaging med multipla våglängder på någon hastighet straff. En annan möjlighet skulle vara att alternera de olika exciterings lasrar och använda en flerbands notchfilter för att avvisa exciteringsljuset. Användning av en binär ferroelektrisk SLM i denna implementering är inte heller optimal. Diffraktionsverkningsgraden av en sådan SLM är mycket låg, så de flesta av det infallande ljuset är i det nollte ordningens reflektion, som filtreras ut genom den rumsliga mask. För applikationer som kräver mycket hög bildhastighet, är utskriftshastighet begränsas därför av uteffekten av laserdioder. SLM introducerar också en del ellipticitet i polarisationen för våglängder bort från 550 nm designen våglängd där pixlarna inte fungerar som ideala halv våg plattor. Även om detta skulle kunna kompenseras med en extra LCVR kan den idealiska lösningen vara att använda en digital mikrospegelanordning (DMD) som en mönstergenerator.
möjliga ändringar
Inställnings presented här är flexibel och lättare modifieras än kommersiella instrument så att andra avbildningsmetoder såsom 3D-SIM, snabb 2D-SIM, multifokal SIM (MSIM) och icke-linjär SIM (NL-SIM) kan genomföras 21,34,35.
2D-SIM kan vara väl lämpad för avbildning relativt platt, snabbrörliga strukturer som den perifera endoplasmatiska nätverket. Den perifera ER ligger djupare i cellen än vad som kan belysas med hjälp av en TIRF försvinnande fält men på grund av sin platta struktur kan avbildas med standard 2D-SIM med försumbar out-of-fokus bakgrund. Dessutom, användningen av förbättrade optiska sektionerekonstruktionsalgoritmer trycka out-of-fokus ljus utöka användningen av 2D-SIM optiskt tjocka prover, även om där axiell upplösning fördubbling krävs inte 21.
I MSIM provet belyses av en gles galler av excitation härdar 36. Denna modalitet kan genomföras genom att helt enkelt ta bort den rumsliga mask (SM) Och ersätta den med en polarisator. SLM fungerar nu som en amplitud-modulator. De binära SIM gitter som visas på SLM kan ersättas av en 2D-gitter av fläckar, med storleken av fläckarna som valts för att vara lika med storleken på en diffraktionsbegränsad fokus i bildplanet. I figur 7A är ett galler av 4 x 4 pixel rutor visas på SLM (infälld) som när förminskade på provet genererar diffraktionsbegränsad härdar av 150 x 150 nm, med tanke på den fysiska SLM pixelstorlek på 13,62 pm. Excitation fokus kan sedan översättas genom att flytta gallermönster på SLM och detta upprepas flera gånger för att belysa hela synfältet. Bilder förvärvas för varje översatt mönsterpositionen och stapeln är efterbehandlade för att ge en rekonstruerad bild med förbättrad upplösning på upp till en faktor av 
och minskad out-of-fokus ljus jämfört med motsvarande widefield bilden30. Denna modalitet kan vara användbara för avbildning av tjocka, täta prover för vilken standard SIM är olämpliga, till exempel låg kontrast strukturer såsom färgade röda blodkroppar (Figur 7C), även om förvärvstiden ökar på grund av det stora antalet rå ramar krävs per synfältet (i det här fallet N = 168).
Slutligen kan installationen modifieras för att möjliggöra antingen hög-NA linjär TIRF-SIM eller mönstrade aktivering icke-linjär SIM (PA NL-SIM), som lades fram nyligen av Li et al., Genom användning av en ultra 1,7 NA mål eller tillägg av en 405 nm fotoaktivering laser och noggrann optimering av SLM gittermönster 35.
framtida tillämpningar
SIM är fortfarande en snabbt växande teknik och många tillämpningar inom livsvetenskaperna kommer att aktiveras i framtiden. Hastighet, upplösning och kontrast förbättringar av tekniken och förmåga att använda standard fluoroforer mean att för Bioimaging är SIM inställd på att ersätta konventionella många mikroskopsystem, såsom konfokala och breda fält plattformar. Kommersiella SIM-system finns redan idag med enastående tekniska specifikationer, men de är utanför den finansiella räckhåll för många forskningslaboratorier, och, framför allt, de är oflexibla att ändras och utvecklas för att genomföra de senaste forskningsutvecklingen inom området. De saknar också det väsentliga förmåga att "anpassas för försöket till hands", ofta en kritisk flaskhals i framkant biovetenskaplig forskning. Systemet som beskrivs här kommer att vara särskilt väl lämpad för att studera dynamiska processer nära cellytan, för in vitro-studier i ombildade tvåskiktsmembran system, för att studera ytkemin i materialen och fysik, t.ex.. av 2D material, och många andra tillämpningar.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från Leverhulme Trust, Engineering and Physical Sciences Research Council [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimers Research UK [Aruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089.703 / Z / 09 / Z] och Medical Research Council [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Vi tackar E. Avezov och M. Lu för transfektion av LifeAct-GFP och cytosoliska-GFP celler respektive och W. Chen för beredning av HEK293 kultur. Vi tackar även K. O'Holleran för hjälp med utformningen av mikroskop, och L. Shao och R. Heintzmann för nyttiga diskussioner och förslag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 488 nm laser | Toptica | iBeam SMART | with digital modulation |
| 561 nm laser | Coherent | OBIS LS | with digital modulation |
| 640 nm laser | Cobolt | MLD | with digital modulation |
| Long-pass dichroic mirrors | Thorlabs | for combining excitation beams | |
| Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube |
| Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | From same batch as above, 25 x 25 mm |
| 1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-860 | |
| Glan-Taylor calcite polarizers | Thorlabs | GT5-A | For alignment of LCVR |
| Glan-Taylor mount | Thorlabs | SM05PM5 | |
| Achromatic half wave plate | Thorlabs | AHWP05M-600 | 400-800 nm |
| Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | For HWP |
| Liquid Crystal Variable Retarder | Meadowlark Optics | SWIFT | Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm. |
| LCVR controller | Meadowlark Optics | D3060HV | Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders |
| Achromatic quarter wave plate | Meadowlark Optics | AQM-100-0545 | |
| Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1P/M | For QWP |
| 10 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC080-010-A-ML | For beam expander |
| 200 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC254-200-A-ML | For beam expander |
| Cage XY Translators | Thorlabs | CXY1 | |
| Ferroelectric spatial light modulator | Forth Dimension Displays | M0787-00249 | SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1,280 x 1,024 pixels, with driver board |
| SLM mounting frame | Forth Dimension Displays | M0787-10014 | Fixed to custom built aluminium mount |
| Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount | Thorlabs | GM200/M | For SLM mounting |
| Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform | Thorlabs | XYR1/M | For SLM mounting |
| Rail carrier | Newport | M-PRC-3 | For SLM mounting |
| Precision Optical Rail | Newport | PRL-6 | For SLM mounting |
| 300 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 273 322 | f = 300 mm, 31.5 mm diameter |
| 140 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 239 322 | f = 140 mm, 31.5 mm diameter |
| Precision XY Translation Mounts | Thorlabs | LM2XY | |
| Lens Mounting Adapters | Thorlabs | SM2AD32 | For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts |
| Translation stages | Comar | 12XT65 | Dovetail, side drive |
| XY Translator with Differential Drives | Thorlabs | ST1XY-D/M | for spatial filter |
| Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | for spatial filter |
| 300 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC508-300-A-ML | Excitation tube lens |
| Automated XY stage with Z-piezo top plate | ASI | PZ-2150-XYFT-PZ-IX71 | with MS-2000 controller |
| Inverted microscope frame | Olympus | IX-71 | |
| Objective lens | Olympus | UAPON100XOTIRF | 100X/1.49NA |
| High speed filter wheel | Prior Scientific | HF110A | with Prior ProScan III controller |
| Bandpass emission filters | Semrock | FF01-525/30, FF01-676/29 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | |
| Stage top incubator | OKO Lab | H301-K-FRAME | For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers |
| Stainless steel optical posts | Thorlabs | TR series | for mounting optical components |
| Post holders | Thorlabs | PH series | for mounting optical components |
| Kinematic mirror mounts | Thorlabs | KM100 | for mounting 1" mirrors |
| Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
| 100 nm fluorescent microspheres | Life Technologies | T-7279 | Tetraspeck |
| Rhodamine 6G | Sigma Aldrich | 83697-250MG | |
| 8 well glass bottom dishes | ibidi | 80827 | with #1.5 coverglass |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | with #1.5 coverglass |
| 0.01 mm microscope reticle slide | EMS | 68039-22 | |
| CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific | C10613 |
References
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices. Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Westphal, V., et al. Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement. Science. 320 (5873), 246-249 (2008).
- Davies, T., et al. CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation. PLOS Biol. 13 (4), e1002121 (2015).
- Laine, R. F., et al. Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging. Nat. Commun. 6, 5980 (2015).
- Pinotsi, D., et al. Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy. Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).
- Esbjörner, E. K., et al. Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation. Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).
- Michel, C. H., et al. Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology. J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).
- Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques. Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
- Cragg, G. E., So, P. T. Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves. Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).
- Chung, E., Kim, D., So, P. T. Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy. Opt. Lett. 31 (7), 945 (2006).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).
- Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).
- Brunstein, M., Wicker, K., Hérault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks. Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).
- Förster, R., et al. Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator. Opt. Express. 22 (17), 20663 (2014).
- Lu-Walther, H. W., et al. fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy. Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001 (2015).
- Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. High speed structured illumination microscopy in optically thick samples. Methods. , (2015).
- von Olshausen, P. Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging. , University of Freiburg. (2012).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Meadowlark Optics Inc. Basic Polarization Techniques and Devices. , (2005).
- O'Holleran, K., Shaw, M. Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy. Opt. Lett. 37 (22), 4603 (2012).
- Brankner, S. Z., Hobson, M. Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera. , http://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0098E_synchronization.pdf (2013).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Wicker, K. Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space. Opt. Express. 21 (21), 24692 (2013).
- Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy. 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3 (1), 995-998 (2014).
- Ströhl, F., Kaminski, C. F. A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data. Methods Appl. Fluoresc. 3 (1), 014002 (2015).
- Mudry, E., et al. Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns. Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).
- Ayuk, R., et al. Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm. Opt. Lett. 38 (22), 4723 (2013).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Sci. Rep. 5, 15915 (2015).
- York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
- Li, D., et al. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
- York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
