Comprender el comportamiento maligno del cáncer requiere crear modelos precisos de cómo las células tumorales interactúan con los componentes del microambiente tumoral, como los macrófagos. En este trabajo describimos dos métodos para estudiar la interacción de las células del glioblastoma con los macrófagos asociados al tumor y la microglía, donde se evalúa el efecto sobre la invasión del glioblastoma.
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Artículo de método
Cocultivo Los ensayos para Estudiar macrófagos y microglia Estimulación de Glioblastoma Invasion
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Resumen
Resumen
El glioblastoma multiforme (grado IV glioma) es un cáncer muy agresivo humana con una supervivencia media de diagnóstico posterior a 1 año. A pesar de la mayor comprensión de los eventos moleculares que dan lugar a glioblastomas, este cáncer sigue siendo altamente refractaria al tratamiento convencional. La resección quirúrgica de los tumores cerebrales de alto grado es rara vez completa debido a la naturaleza altamente infiltrante de células de glioblastoma. Los enfoques terapéuticos que atenúan la invasión de células de glioblastoma, por tanto, es una opción atractiva. Nuestro laboratorio y otros han demostrado que los macrófagos y microglia tumor (macrófagos cerebrales residentes) estimular fuertemente invasión glioblastoma asociados. El protocolo descrito en este documento se utiliza para modelar la interacción glioblastoma y macrófagos / microglia utilizando ensayos de cultivo in vitro. Este enfoque puede facilitar en gran medida el desarrollo y / o el descubrimiento de fármacos que interrumpen la comunicación con los macrófagos que permite a este Behav malignoior. Hemos establecido dos ensayos de co-cultivo de invasión robustas donde microglía / macrófagos estimulan la invasión de células de glioma de 5 - 10 veces. células de glioblastoma marcados con un marcador fluorescente o expresar constitutivamente una proteína fluorescente se cultivan en placas con y sin los macrófagos / microglia en insertos de cámara de policarbonato de matriz recubierto o embebidas en una matriz tridimensional. la invasión de células se evaluó mediante el uso de microscopía de fluorescencia a la imagen y contar células sólo invasivos en la parte inferior del filtro. Usando estos ensayos, varios inhibidores farmacológicos (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, y Semapimod), se han identificado que bloquean los macrófagos / microglia estimulados invasión glioblastoma.
Introducción
El glioblastoma multiforme es un cáncer de cerebro humano agresivo con una supervivencia media de aproximadamente 12 meses desde el momento del diagnóstico 1,2. El glioblastoma es uno de los cánceres más mortales y clínicamente desafiantes, ya que es refractario a la quimioterapia estándar y la resección quirúrgica. La naturaleza difusa de glioblastoma permite a las células tumorales a extenderse por todo el cerebro normal haciendo que el tumor avanzado prácticamente imposible quirúrgicamente resecar completamente. Este aspecto altamente invasiva es una característica distintiva del glioblastoma y otros astrocitomas avanzadas. Por lo tanto, el foco de much....
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Protocolo
1. etiquetado fluorescente de células
Líneas celulares de glioblastoma etiqueta y microglia con tintes fluorescentes 9: NOTA. Alternativamente, generar líneas celulares que expresan constitutivamente proteínas fluorescentes, tales como GFP / RFP como se describe en 14.
- células de la placa en una placa de 6 pocillos de tal manera que será de 70 - 80% de confluencia en el día de la tinción. Para la línea celular de glioblastoma murino GL261 y la línea celular de glioblastoma humano U87, placa 1 x 10 6 y 1,5 x 10 6 células, respectivamente, en una placa de 6 cm 24 horas antes de la tinción.
- Prepara....
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Resultados
Utilizando los métodos descritos aquí, hemos demostrado que la microglia y macrófagos pueden estimular considerablemente la invasión de células de glioblastoma. Dos ensayos de invasión se emplean diferentes y se representan en la Figura 1. En la Figura 2, GL261 células que expresan constitutivamente la proteína fluorescente mCherry se sembraron en cámaras de pre-recubierto con y sin microglia por 48 hr. GL261 células fueron mínimamente invasivo por su pr.......
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Discusión
La naturaleza altamente invasiva de los astrocitomas de alto grado y el glioblastoma hacer estos cánceres cerebrales muy mortal. Por lo tanto, es de suma importancia para comprender los mecanismos moleculares y celulares de glioblastoma invasión. Se ha aprendido mucho sobre el proceso de invasión glioblastoma ya 17. El uso de los formatos de ensayo que se detallan en este documento, nuestro laboratorio ha demostrado, tanto en modelos de ratón y humanos que los macrófagos asociados a tumores pueden estimular l.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Konstantin Dobrenis por proporcionar microglía murina para estos estudios.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cámara de invasión Corning BioCoat Matrigel Matrix: Con matriz BD Matrigel | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Medios libres de suero de macrófagos (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker rojo CMTPX Dye Life | Technologies/Sondas moleculares | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye Life | Technologies/Sondas moleculares | C2925 | |
| Línea celular GL261 | Instituto Nacional del Cáncer (NCI) | ||
| Línea celular U87 | Colección Americana de Cultivo de Tipo de Tejido | HTB-14 | |
| Línea celular THP-1 | Colección Americana de Cultivo de Tipo de Tejido ATCC | TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medio (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Solución de formaldehído | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Insertos de cultivo celular de membrana de policarbonato Corning Transwell (8 µ M poro) 48 por paquete. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Extracto de membrana basal con factor de crecimiento reducido, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Suero fetal de ternero (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Albúmina sérica bovina, fracción V, tratada con choque térmico | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0,5 m EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
Referencias
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland,....
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Reimpresiones y permisos
