Comprender el comportamiento maligno del cáncer requiere crear modelos precisos de cómo las células tumorales interactúan con los componentes del microambiente tumoral, como los macrófagos. En este trabajo describimos dos métodos para estudiar la interacción de las células del glioblastoma con los macrófagos asociados al tumor y la microglía, donde se evalúa el efecto sobre la invasión del glioblastoma.
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Artículo de método
Cocultivo Los ensayos para Estudiar macrófagos y microglia Estimulación de Glioblastoma Invasion
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Resumen
Resumen
El glioblastoma multiforme (grado IV glioma) es un cáncer muy agresivo humana con una supervivencia media de diagnóstico posterior a 1 año. A pesar de la mayor comprensión de los eventos moleculares que dan lugar a glioblastomas, este cáncer sigue siendo altamente refractaria al tratamiento convencional. La resección quirúrgica de los tumores cerebrales de alto grado es rara vez completa debido a la naturaleza altamente infiltrante de células de glioblastoma. Los enfoques terapéuticos que atenúan la invasión de células de glioblastoma, por tanto, es una opción atractiva. Nuestro laboratorio y otros han demostrado que los macrófagos y microglia tumor (macrófagos cerebrales residentes) estimular fuertemente invasión glioblastoma asociados. El protocolo descrito en este documento se utiliza para modelar la interacción glioblastoma y macrófagos / microglia utilizando ensayos de cultivo in vitro. Este enfoque puede facilitar en gran medida el desarrollo y / o el descubrimiento de fármacos que interrumpen la comunicación con los macrófagos que permite a este Behav malignoior. Hemos establecido dos ensayos de co-cultivo de invasión robustas donde microglía / macrófagos estimulan la invasión de células de glioma de 5 - 10 veces. células de glioblastoma marcados con un marcador fluorescente o expresar constitutivamente una proteína fluorescente se cultivan en placas con y sin los macrófagos / microglia en insertos de cámara de policarbonato de matriz recubierto o embebidas en una matriz tridimensional. la invasión de células se evaluó mediante el uso de microscopía de fluorescencia a la imagen y contar células sólo invasivos en la parte inferior del filtro. Usando estos ensayos, varios inhibidores farmacológicos (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, y Semapimod), se han identificado que bloquean los macrófagos / microglia estimulados invasión glioblastoma.
Introducción
El glioblastoma multiforme es un cáncer de cerebro humano agresivo con una supervivencia media de aproximadamente 12 meses desde el momento del diagnóstico 1,2. El glioblastoma es uno de los cánceres más mortales y clínicamente desafiantes, ya que es refractario a la quimioterapia estándar y la resección quirúrgica. La naturaleza difusa de glioblastoma permite a las células tumorales a extenderse por todo el cerebro normal haciendo que el tumor avanzado prácticamente imposible quirúrgicamente resecar completamente. Este aspecto altamente invasiva es una característica distintiva del glioblastoma y otros astrocitomas avanzadas. Por lo tanto, el foco de mucha investigación ha sido el mecanismo molecular de la invasión de células de glioblastoma. El microambiente del tumor glioblastoma juega un papel vital en el establecimiento de malignidad 3-6. Macrófagos tumorales asociados / microglía mostraron ser responsable de promover el glioblastoma invasión 7,8. La mayoría de estos estudios, sin embargo midió el efecto de los macrófagos / microglia utilizandoensayos que separan físicamente de las células de glioblastoma. Nuestro laboratorio ha dedicado a generar mejores ensayos que permiten estudiar cómo la invasión glioblastoma es dependiente de macrófagos / microglia en co-cultivos y permitirnos la imagen de la interacción física entre ellos durante la invasión.
Los ensayos clásicos para medir la invasión de células incluyen los quimiotaxis cámara de Boyden "estándar" y formatos quimioinvasión. Aquí las células para ser estudiados se colocaron en placas en una cámara de plástico que contiene un filtro de policarbonato en la parte inferior que tiene poros de un tamaño especificado (en general, entre 0,4 y 8 m de diámetro). El proceso de invasión de las células implica una barrera física, por lo general compuesta de proteína de la matriz extracelular. En el ensayo de quimioinvasión, la matriz preferido usado es Matrigel (en lo sucesivo denominado "matriz"), una mezcla de proteína de la matriz extracelular secretada por Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de ratón y consiste en gran parte de colLagen tipo IV y laminina. Las cámaras se colocan a continuación en un pozo de cultivo de tejidos que contiene medios de cultivo celular con o sin factores de crecimiento que se sospecha para estimular la invasión. Las células que tienen una mayor capacidad invasiva invadirá a través del filtro recubierto de matriz extracelular a una frecuencia superior y se adhieren a la parte inferior del filtro. Hemos modificado este ensayo con el fin de evaluar el papel de la microglía y los macrófagos asociados a tumores en la invasión de células de glioblastoma.
Hemos sido capaces de determinar usando ensayos de cocultivo descritos en este documento que la microglia pueden estimular la invasión de dos líneas celulares de glioblastoma por 5 a 10 veces 9,10. Esto refleja lo que se observa en los modelos animales de glioblastoma. Además, se desarrolló un ensayo de invasión de tres dimensiones donde las interacciones entre las células de glioblastoma y macrófagos / microglía se pueden examinar de forma más directa. La extensión de la invasión de células de glioblastoma estimulada por macrophages / microglia en el ensayo 3D es comparable a lo que se ve usando el enfoque de la cámara recubierta matriz. Ensayos similares se desarrollaron previamente para estudiar las interacciones de carcinoma de mama con macrófagos durante la invasión 11-13. Ambos métodos descritos en este documento deben ayudar en la capacidad de diseccionar el mecanismo molecular (s) de macrófagos / microglia invasión estimulada de las células de glioblastoma.
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Protocolo
1. etiquetado fluorescente de células
Líneas celulares de glioblastoma etiqueta y microglia con tintes fluorescentes 9: NOTA. Alternativamente, generar líneas celulares que expresan constitutivamente proteínas fluorescentes, tales como GFP / RFP como se describe en 14.
- células de la placa en una placa de 6 pocillos de tal manera que será de 70 - 80% de confluencia en el día de la tinción. Para la línea celular de glioblastoma murino GL261 y la línea celular de glioblastoma humano U87, placa 1 x 10 6 y 1,5 x 10 6 células, respectivamente, en una placa de 6 cm 24 horas antes de la tinción.
- Preparar la solución de tinte mancha de células fluorescentes en DMSO y añadir colorante 5 M a medios de comunicación, ya sea medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) o macrófagos medio libre de suero (MSFM) y agitar bien.
- Se incuban las células con colorante durante 30 min a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Retire los medios que contienen colorantes y añadir medio fresco (RPMI o MSFM) a las células.
- Se incuban las células durante 30 min. Nota: Las células son ahoramanchadas y listo para ser utilizado en el experimento.
Ensayo Matrix Cámara Coculture Invasion 2. Pre-revestido
- Diferenciar las células THP-1 utilizando acetato de forbol miristato (PMA) 15.
- Placa 2 - 3 x 10 5 THP-1 células en 1,5 ml de RPMI / 10% FBS en una placa de cultivo de 6 pocillos. Inmediatamente después de la siembra añadir 100 nM PMA y se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante 48 hr.
NOTA: Después de 48 horas, las células THP-1 que han superado con éxito la diferenciación van a ser adherente y se extendió a la parte inferior del pozo asumir una morfología redonda. - Retire PMA lavando una vez con PBS 1x y reemplazar con RPMI / FBS al 10%. Esperar otro 48 horas hasta que las células están listas para utilizar en el ensayo.
- Placa 2 - 3 x 10 5 THP-1 células en 1,5 ml de RPMI / 10% FBS en una placa de cultivo de 6 pocillos. Inmediatamente después de la siembra añadir 100 nM PMA y se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante 48 hr.
- Equilibrar cámaras de pre-recubiertas de matriz colocándolos en un pocillo que contiene 500 l de medio solo (sin suero) y la adición de 500 l de medio solo a la parte superior. Incubar las cámaras durante 2 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
NOTA: Las cámaras de pre-revestidas se adquiere del fabricante; véase la Tabla de Materiales / Equipos. - Para separar suavemente las células (líneas celulares de glioblastoma marcados con fluorescencia y la microglía / macrófagos), quitar el medio de las células mediante aspiración. Lavar las células en un plato con 2 mM EDTA / PBS. Añadir 500 l de 2 mM EDTA / PBS y se incuba durante 5 a 10 min en un incubador de células a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Resuspender las células en 5 ml de medio que contiene 0,3% de albúmina sérica bovina (BSA).
- Centrifugar durante 5 min a 120 x g.
- Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en medios BSA MSFM / 0,3% (para las células GL261 y microglia) o RPMI /% BSA 0,3 (para U87 y las células THP-1) tal que la concentración de células es igual a 1 x 10 6 células / ml . Use un hemocitómetro para contar las células.
- Añadir 500 l de medios / BSA al 0,3% por pocillo de placa de 24 pocillos.
- Retire el medio de cámaras que han sido equilibrada durante al menos 2 horas (paso 2.2). lugar chambers en pocillos que contiene 500 l de medios / BSA al 0,3% (paso 2.7).
- Si inhibidores se utilizan para estudiar su efecto sobre los macrófagos / microglia estimulados invasión glioma, añadir la concentración apropiada tanto a la parte inferior y la parte superior partes de la cámara.
NOTA: Las concentraciones de CSF-1R inhibidor usado para inhibir completamente microglia estimulado GL261 invasión glioblastoma se puede encontrar en la referencia 9. - En función de las líneas celulares utilizadas, añadir células a la cámara superior como se describe en los siguientes dos pasos: glioblastoma ratón (2.10.1) y glioblastoma humano (2.10.2).
- Mezclar 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) células (150 l) y 5 x 10 4 microglia ratón (50 l) (véase el paso 2.6 para los detalles de los medios). Se ajusta el volumen a 500 l mediante la adición de 300 l MSFM / BSA al 0,3%. Añadir la mezcla de células a la cámara superior y se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante 48 hr.
NOTA: microglia murino se aislaron de ratones recién nacidos como se describe in 1 6.
- Mezclar 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) células (150 l) y 5 x 10 4 microglia ratón (50 l) (véase el paso 2.6 para los detalles de los medios). Se ajusta el volumen a 500 l mediante la adición de 300 l MSFM / BSA al 0,3%. Añadir la mezcla de células a la cámara superior y se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante 48 hr.
Mezclar 7,5 x 10 4 U87 (glioblastoma) células (75 l) y 2,5 x 10 4 THP1 (macrófagos) células (25 l). Llevar a un volumen de 500 l mediante la adición de 400 l de RPMI / BSA al 0,3%. Añadir la mezcla de células a la cámara superior. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO2 durante 24 hr.
- Después de la incubación, retirar las células de la parte superior de la cámara por aspiración suave y fijar mediante la colocación de cámaras en formaldehído al 3,7% en PBS. Permitir a cámaras permanezcan en fijador durante 15 min a temperatura ambiente (o durante la noche a 4 ° C). Retire el fijador por aspiración suave y reemplazar con 500 l de PBS 1x. Pase a la sección 4 para el análisis de imágenes.
NOTA: Experimento puede ser pausado en este momento y se guarda para la formación de imágenes en 1x PBS. señales de tinte fluorescente puede detectarse por hasta 2 semanas después de la fijación.
3. Ensayo de Invasión "3D" -embedding glioma y macrófagos / microglía en Matrix
- mezcla matriz de descongelar a 4 ° C durante la noche. Realizar todas las manipulaciones adicionales utilizando la matriz en el hielo en la campana.
- Preparar 10 mg de concentración / ml de matriz en medios de comunicación (MSFM o RPMI) con 0,3% de BSA en hielo.
NOTA: concentración de la de la matriz es típicamente alrededor de 15 mg / ml. - Para preparar las células marcadas en el paso (1) para la suspensión en la matriz, quitar el medio de las células mediante aspiración. Lavar las células en un plato con 2 mM EDTA / PBS. Añadir 500 l de 2 mM EDTA / PBS a las células y se incuba durante 5 a 10 min en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Resuspender las células en 5 ml de medio que contiene 0,3% de BSA.
- Centrifugar durante 5 min a 120 x g.
- Aspirar el sobrenadante de pellet. Resuspender pellet en media / 0,3% BSA tal que la concentración de células es igual a 1 x 10 6 células / ml. Use un hemocitómetro para contar las células.
- Añadir 1,5 x 10 5 células GL261 (en 150 l) + 5 x 10 4 células de microglia (en 50 l) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.Añadir 2 x 10 5 células GL261 (200 l) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por separado.
NOTA: GL261 células solo sin microglia sirve como control. - Centrifugar las células en microcentrífuga durante 5 min a 120 x g.
- Resuspender las células en 200 l de matriz fría en hielo.
- Plate 50 l (50.000 células) en el centro del compartimiento superior de 8 M inserto de la cámara de tamaño de poro.
- Incubar a 37 ° C durante 30 min para la polimerización que se produzca.
- Añadir 200 l de medio libre de suero a la cámara superior y que contiene medio de cultivo de células 700 de suero l al pocillo inferior.
- Incubar a 37 ° C, 5% de CO2 durante 48 hr.
- Después de la incubación, retirar las células de la parte superior de la cámara por aspiración suave y fijar mediante la colocación de cámaras en formaldehído al 3,7% en PBS. Permitir a cámaras permanezcan en fijador durante 15 min a temperatura ambiente (o durante la noche a 4 ° C). Retire el fijador por aspiración suave y reemplazar con 500 l de PBS 1x. Pase a la sección 4 foanálisis de imagen r.
4. Los ensayos Imaging
- Retire las cámaras de formaldehído al 3,7% y se lava bien en fresco que contiene 500 l de PBS 1x.
NOTA: No permita que las cámaras se sequen. - El uso de un aplicador de punta de algodón, limpiar suavemente las células no invasivas de la parte superior del filtro (lado dirigido hacia el interior de la cámara), raspando la superficie del filtro. Comience lentamente y aumentar gradualmente la presión. Haga esto por lo menos 3 veces por cámara.
- Colocar cámaras, ya sea en un plato con fondo de cristal o dejarlo en una placa de 24 pocillos.
- Coloque la muestra en el escenario de un microscopio de epifluorescencia o láser confocal de fluorescencia equipado con cámara y software de captura de imágenes 9,10.
- Tome varias 10X o 20X imágenes de campos representativos.
- El uso de un software de análisis de imágenes, tales como ImageJ, contar el número de células de glioblastoma que han atravesado el filtro a la parte inferior 9,10.
- Si obtención de imágenes del "3D. "Ensayo de invasión (descrito en el apartado 3), generar una serie de pila Z usando un láser fluorescente microscopio confocal 5-6 Para la imagen de la población de células invasoras en la parte inferior del filtro, siga el protocolo de los pasos 4.2 a 4.6 se ha descrito anteriormente.
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Resultados
Utilizando los métodos descritos aquí, hemos demostrado que la microglia y macrófagos pueden estimular considerablemente la invasión de células de glioblastoma. Dos ensayos de invasión se emplean diferentes y se representan en la Figura 1. En la Figura 2, GL261 células que expresan constitutivamente la proteína fluorescente mCherry se sembraron en cámaras de pre-recubierto con y sin microglia por 48 hr. GL261 células fueron mínimamente invasivo por su pr...
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Discusión
La naturaleza altamente invasiva de los astrocitomas de alto grado y el glioblastoma hacer estos cánceres cerebrales muy mortal. Por lo tanto, es de suma importancia para comprender los mecanismos moleculares y celulares de glioblastoma invasión. Se ha aprendido mucho sobre el proceso de invasión glioblastoma ya 17. El uso de los formatos de ensayo que se detallan en este documento, nuestro laboratorio ha demostrado, tanto en modelos de ratón y humanos que los macrófagos asociados a tumores pueden estimular l...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al Dr. Konstantin Dobrenis por proporcionar microglía murina para estos estudios.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cámara de invasión Corning BioCoat Matrigel Matrix: Con matriz BD Matrigel | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Medios libres de suero de macrófagos (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker rojo CMTPX Dye Life | Technologies/Sondas moleculares | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye Life | Technologies/Sondas moleculares | C2925 | |
| Línea celular GL261 | Instituto Nacional del Cáncer (NCI) | ||
| Línea celular U87 | Colección Americana de Cultivo de Tipo de Tejido | HTB-14 | |
| Línea celular THP-1 | Colección Americana de Cultivo de Tipo de Tejido ATCC | TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medio (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Solución de formaldehído | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Insertos de cultivo celular de membrana de policarbonato Corning Transwell (8 µ M poro) 48 por paquete. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Extracto de membrana basal con factor de crecimiento reducido, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Suero fetal de ternero (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Albúmina sérica bovina, fracción V, tratada con choque térmico | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0,5 m EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
