En Vivo biosensor Pistas de apoptosis no caspasa actividad en Drosophila

Resumen

Para detectar las células sanas en animales enteros que contienen niveles bajos de actividad caspasa, el biosensor altamente sensible designado CaspaseTracker se generó para Drosophila. se detecta actividad biosensor dependiente de caspasa en las células sanas de larga vida a través de los órganos internos de los animales adultos criados en condiciones optimizadas en ausencia de estímulos de muerte.

Resumen

Las caspasas son los mediadores clave de la muerte celular apoptótica a través de su actividad proteolítica. Cuando las caspasas se activan en las células a niveles detectables por las tecnologías disponibles, generalmente se supone que la apoptosis ocurre poco después. Las caspasas pueden escindir muchos componentes funcionales y estructurales para causar una destrucción celular rápida y completa en unos pocos minutos. Sin embargo, la evidencia acumulada indica que en las células sanas normales las mismas caspasas tienen otras funciones, presumiblemente a niveles enzimáticos más bajos. Los estudios de la actividad de las caspasas no apoptóticas se han visto obstaculizados por las dificultades para detectar niveles bajos de actividad de las caspasas y para rastrear el destino final de las células in vivo. Aquí, ilustramos el uso de un indicador de caspasa ultrasensible, CaspaseTracker, que etiqueta permanentemente las células que han experimentado actividad de caspasa en animales enteros. Este biosensor CaspasaTracker de doble color in vivo para Drosophila melanogaster expresa transitoriamente la proteína fluorescente roja (RFP) para indicar la actividad reciente o en curso de la caspasa, y expresa permanentemente la proteína fluorescente verde (GFP) en células que han experimentado actividad de caspasa en cualquier momento en el pasado pero que no murieron. Es importante destacar que este biosensor in vivo dependiente de caspasas revela fácilmente la presencia de actividad de caspasas no apoptóticas en los tejidos de los sistemas de órganos de toda la mosca adulta. Esto se demuestra utilizando disecciones de montura completa de moscas individuales para detectar la actividad de los biosensores en células sanas en todo el cerebro, el intestino, los túbulos de Malpighi, el cardias, los conductos ováricos y otros tejidos. CaspasaTracker detecta la actividad de las caspasas no apoptóticas en las células de larga vida, ya que la actividad de los biosensores se detecta en las neuronas adultas y en otros tejidos al menos 10 días después de la activación de las caspasas. Este biosensor sirve como una herramienta importante para descubrir las funciones y los mecanismos moleculares de la actividad de las caspasas no apoptóticas en animales vivos.

Introducción

Las caspasas son proteasas de cisteína que median la muerte celular por apoptosis mediante la escisión de muchas proteínas intracelulares después de residuos de aspartato clave. Por ejemplo, caspasas iniciadoras activan las caspasas efectoras, nucleasas de ADN derepress, componentes del citoesqueleto escinden y alteran la composición de lípidos de las membranas celulares para desmantelar rápidamente las células y estimular su reconocimiento y la inmersión por las células que disponen de los cadáveres célula vecina. ^1-4 Se estima que miles de millones de células mueren por día en el cuerpo humano, y la apoptosis es un mecanismo importante de la muerte de cé....

Protocolo

1. Preparación de las moscas CaspaseTracker

1. Para preparar CaspaseTracker (DQVD) vuela de experimentos, realice esta cruz: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi> Stop> GFP-nls), mediante la transferencia de 7-10 hembra virgen (o macho) las moscas que lleva el sustrato de la caspasa-biosensor mCD8 DIAP1-Gal4 impulsada por el promotor de ubiquitina ³⁵ junto con el mismo número de hombres (o mujeres) moscas G-TRACE, que tienen el segundo cromosoma equilibrador CyO para evitar la letalidad de la combinación homocigótica del G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, y Ubi> Stop> GFP-nls) ^34. Lugar vuela en un vial de alime....

Resultados

Existen dos componentes clave que permiten CaspaseTracker para detectar la actividad de la caspasa en las células sanas normales (Figura 1A). El primero de ellos es un polipéptido de la caspasa-escindible 146 amino ácido el modelo de la caspasa biosensor Apoliner (Figura 1b). ²⁸ Este polipéptido se deriva de DIAP1 (inhibidor de Drosophila de apoptosis) que contiene un único sitio de la caspasa natural que se escinde durante la apoptos.......

Discusión

A continuación se ilustra la construcción y el funcionamiento interno de CaspaseTracker que facilitan la detección de la actividad de caspasa basal generalizada en los tejidos sanos. Los pasos críticos para la detección de la actividad de caspasa no apoptótica in vivo son: 1) la generación de moscas con el transgén biosensor, 2) verificar la función reportero-caspasa específico con controles apropiados, 3) la práctica de técnicas de disección para observar todos los sistemas de órganos internos de adulto Dr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Consumibles y reactivos
Vectashield	Vector Products	H-1000
Pinzas de	Ted Pella	#505 (110mm, #5)	Pinza Dumont grado de biología, acero inoxidable
Portaobjetos colgantes	Fisher Scientific	12-565B	Portaobjetos de vidrio
Hoechst 33342	Sondas moleculares	Tinción de ADN H1399
Alexa Fluor 633	Sondas moleculares de	A22284	Tinción de actina
Rat-Elav-7E8A10 anticuerpo anti-elav	Estudios del desarrollo Banco de hibridomas (DSHB)ID del	registro de anticuerpos:  AB_528218	Tinción para Drosophla pan-neuronal ELAV
Anticuerpo de caspasa-3 (Asp175) escindido	Tecnología de señalización celular	#9661	Tinción para fragmento activo de caspasa-3
ProLong Gold reactivo antidecoloración	Life Technologies	P36934	para preservar fluoróforos
ProLong Diamond Antifade Mountant Life	Technologies	P36961	para preservar los fluoróforos
Kit de elastómero de silicona SylGard 182	Dow Corning	Código de producto: 0001023934	para placas de
Equipment
LSM780 microscopio confocal	Carl Zeiss	N/A	Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000	Carl Zeiss	N/A	Drosophila disección
AmScope Fiber Optic Dual Swanneck Microscope Illuminator, 150  W	AmScope	WBM99316	Fuente de luz

medio de montaje faloidina disección