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Artículo de método

Un modelo enzima y Cultura Neural Stem Cell libre de suero para la EMT Investigación Adecuado para el descubrimiento de fármacos

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DOI:

10.3791/54018

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23 de agosto de 2016

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1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La transición epitelial a mesenquimal (EMT) permite que los cánceres se vuelvan invasivos. Para investigar la EMT, se describe un modelo in vitro basado en células madre neurales (NSC) desprovisto de suero y enzimas. Este sistema estandarizado permite la evaluación cuantitativa y cualitativa de la migración celular, la expresión génica y proteica. El modelo es adecuado para el descubrimiento de fármacos.

Resumen

Transición epitelial a mesenquimal (EMT) describe el proceso de epitelio mesénquima en transdifferentiating. EMT es un proceso fundamental durante el desarrollo embrionario que también ocurre comúnmente en glioblastoma, el tumor cerebral maligno más frecuente. EMT también se ha observado en múltiples carcinomas fuera del cerebro incluyendo cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer gástrico. EMT está vinculado centralmente a la malignidad mediante la promoción de la migración, la invasión y la formación de metástasis. Los mecanismos de inducción EMT no se entienden completamente. Aquí se describe un sistema in vitro para el aislamiento normalizado de las células corticales neuronales madre (NSC) y posterior EMT-inducción. Este sistema ofrece la flexibilidad de utilizar cualquiera de las células individuales o cultivo de explantes. En este sistema, de rata o de ratón NSCs del cerebro anterior de embriones se cultivan en un medio definido, desprovisto de suero y enzimas. Las células madre neurales expresan Olig2 y Sox10, dos factores de transcripción se observa en oligodendroccélulas precursoras yte (OPC). Utilizando este sistema, las interacciones entre FGF, BMP y TGF-señalización que implica ZEB1, Zeb2, y Twist2 fueron observada en la que TGF-activación mejora de forma significativa la migración de células, lo que sugiere un efecto sinérgico BMP / TGF-interacción. Los resultados apuntan a una red de FGF, BMP y TGF-señalización de estar involucrados en la inducción y mantenimiento de EMT. Este sistema modelo es relevante para investigar EMT in vitro. Es rentable y muestra una alta reproducibilidad. También permite la comparación de los diferentes compuestos con respecto a sus respuestas de migración (medición de la distancia cuantitativo), y cribado de alto rendimiento de los compuestos para inhibir o potenciar EMT (medición cualitativa). El modelo es, por tanto, muy adecuado para poner a prueba las bibliotecas de drogas para las sustancias que afectan a la EMT.

Introducción

Durante varias etapas del desarrollo embrionario, las células epiteliales pierden su fuerte adherencia entre sí (por ejemplo, las uniones estrechas) y adquieren un fenotipo migratorio en un proceso llamado transición epitelial a mesenquimal (EMT) 1. Se requiere EMT para la formación de tipos de células adicionales, tales como las células de la cresta neural mesenquimales, una población que segrega desde el neuroepitelio 2. EMT no sólo es esencial durante las fases embrionarias, sino también necesaria en etapas posteriores de la vida adulta para mantener los procesos fisiológicos en el organismo adulto, tales como la curación de heridas 3 y la regeneración del sistema nervioso central (SNC) en lesiones desmielinizantes 4.

Los tumores epiteliales son conocidos para reactivar EMT como una etapa de iniciación para la migración, invasión y metástasis, en última instancia conduce a la progresión del cáncer 1,3. EMT es, en efecto vinculado centralmente a la fuerte migración de 1,3. Los pasos celulares de conditioning, iniciar, mantener y someterse a EMT no se entienden completamente y necesitan más investigaciones.

Aquí, se presenta un sistema normalizado in vitro modelo EMT basado en NSCs, con factores de crecimiento definidos y medios (sin suero y sin el uso de la enzima). Este sistema modelo es de relevancia para los científicos que trabajan en la EMT. El caracol, Zeb y twist familias de proteínas han demostrado ser crucial para la EMT, tanto en el desarrollo y la enfermedad 1. El caracol, familias Zeb y la torcedura también están involucrados en el sistema presentado. El sistema se basa en una región específica del cerebro anterior que normalmente no experimenta EMT proporcionar una ventaja particular para el estudio de los acontecimientos iniciales durante la inducción de EMT.

El sistema modelo potencialmente podría ser aplicado al estudio de EMT en el epitelio fuera del SNC, ya que los inductores de la EMT clave, como el caracol, Zeb y las proteínas de la torcedura, también se encuentran durante la EMT en sistemas de tejidos fuera del SNC. Este modelo sistema permite el aislamiento normalizado de células madre neurales de la corteza en desarrollo para estudiar las características de células madre en general y, en particular, la EMT. El uso de este sistema, se aislaron células madre neurales, EMT inducida y estudiamos la posterior migración bajo el efecto de FGF2 y BMP4. Hemos observado que interactúa FGF y BMP de señalización con TGF-señalización para promover la migración de células, validando así el sistema modelo.

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Protocolo

Todos los animales procedimientos siguieron la 'Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio "(publicación NIH, 8ª edición, 2011) y fueron aprobados por el Comité de Protección de los Animales de Basilea (Suiza Directrices para el Cuidado y Uso de los Animales). Por estas directrices del protocolo animal se considera de "grado de gravedad más bajo de los animales".

1. Preparación de medio de expansión

Nota: El trabajo en condiciones asépticas como estándar para el cultivo de tejidos.

  1. Tomar dos tubos de 15 ml, y añadir 5 ml de DMEM / F12-L-glutamina libre (1: 1) a partir de una botella de 500 ml de medio en cada uno de los dos tubos de 15 ml. Para el primer tubo 15 ml, añadir 50 mg humano de la apo-transferrina, 50 l de putrescina 1 stock M (0.1 mM de concentración final) y 30 l de selenio de sodio 500 mM de stock (concentración final 30 nM).
    1. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras en la botella de DMEM / F12 inicial.
  2. Para el segundo tubo de 15 ml, añadir 12,5 mg de insulina. Añadir6 - 9 gotas de NaOH 1 M. Vortex para disolver la insulina por completo. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras en la botella de DMEM / F12 inicial.
    Nota: NaOH es tóxico y corrosivo. Utilizar guantes de protección, abrigo, y gafas de seguridad.
  3. Añadir 5 ml de penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 g / ml) / anfotericina B (25 mg / ml) a la botella / medio F12 DMEM.
  4. Añadir 5 ml de 200 mM de stock de L-glutamina recién descongeladas u oligopéptidos que contienen glutamina (200 mM L-alanil-L-glutamina dipéptido) a la botella / medio F12 DMEM.
  5. Agitar bien. Preparar alícuotas de 50 ml.
    Nota: medio de expansión se puede almacenar durante al menos 2 semanas a 4 ° C. tubos aliquoted muestran menos cambios de pH en comparación con el medio guardado en botellas de 500 ml.

2. Preparación de pases Medium

  1. A 1 l de Ca 2 + - y Mg 2 + exento de medios HBSS, agregar 990,85 mg de glucosa (5 mM concentración final) y 840,10 mg de NaHCO3 (10 mM concentración final). Ajustar el pH a 7,3 con HCl (1 M de valores). Esterilizar por filtración con filtro de 0,2 micras y hacer alícuotas de 50 ml.
    Nota: medio pases se puede almacenar durante al menos 4 semanas a 4 ° C.

3. Preparación de factores de crecimiento

  1. Preparar estéril 1x PBS con 1% de BSA (PBS-BSA) solo o con ácido clorhídrico (HCl) a 4 mM (PBS-BSA-HCl).
    Precaución: HCl es corrosivo y tóxico y requiere medidas especiales de seguridad (abrigos, gafas, guantes, capucha).
  2. Disolver 10 mg / ml de factor de crecimiento de fibroblastos recombinante humano 2 (rhFGF2) en PBS-BSA (10 ng / ml de concentración final), 10 mg / ml de la proteína morfogenética ósea recombinante humana 4 (rhBMP4) en PBS-BSA (10 ng / ml final concentración), y 20 mg / ml de factor recombinante humana transformador del crecimiento beta 1 (rhTGFβ1) en PBS-BSA-HCl (40 ng / ml de concentración final).
    1. No filtrar esterilizar. Preparar alícuotas.
      Nota: alícuotas de factor de crecimiento se pueden almacenar a-20 ° C durante al menos 2 años.

4. Recubrimiento de cultivo celular platos

  1. Disolver 1,875 mg de poli-L-ornitina (OLP) en 500 ml de H2O destilada para preparar una OLP de stock 250x. Esterilizar por filtración usando un filtro de jeringa de 0,2 micras y hacer porciones de 2 ml.
    Nota: Estas alícuotas se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos 2 años.
  2. Disolver 1 mg fibronectina bovina en 1 ml de H 2 O destilada estéril para preparar 1.000 x fibronectina de valores. No vórtice ya que pueden obstruir la proteína pegajosa. Agitar suavemente con la mano durante 10 minutos.
    1. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación ocasional. Consultar la disolución completa. Calentar la solución a menos de 37 ° C para la disolución completa de la fibronectina. No filtrar a esterilizar.
      Nota: La solución se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses.
  3. Utilice platos de plasma pretratadas de plástico de cultivo de células (100 mm u otros tamaños como se requiere parael experimento). Para evaluar la migración, utilice placas de 35 mm con rejilla de 500 micras. Incubar los platos durante la noche con 2 ml 1x OLP durante 12 horas a 37 ° C en un CO 2 incubadora de cultivo de tejidos 5%. Lavar dos veces con 2 ml de PBS 1x.
  4. Añadir 2 ml de 1x fibronectina (1 mg / ml de concentración final) y se incuban los platos durante un mínimo de 12 horas a 37 ° C en un incubador de CO2 5%. Retire la fibronectina justo antes de placas las células.
    Nota: platos recubiertos de fibronectina se pueden almacenar durante al menos 2 semanas a 37 ° C.

5. La disección y estandarizado Preparación de la zona subventricular cortical (SVZ)

  1. Obtener embriones de rata día 14.5 (E14.5, Sprague-Dawley) y E13.5 ratón (C57BL / 6) embriones por cronometrada de apareamiento. Aparear los animales de 18:00 a 08:00 de la mañana siguiente. Mediodía después del día de apareamiento se considera E0.5.
  2. Anestesiar al animal preñado con un 5% de isoflurano y el flujo de oxígeno de 0,8 l / min. Comprobar la respuesta por la compresión de la pata con diss agudafórceps exión. Decapitar al animal. Evitar la asfixia de CO 2 en forma de CO 2 afecta a la recuperación de células madre.
  3. Recuperar embriones por cesárea.
    1. Lugar de los animales en decúbito supino y desinfectar la piel con un 70% de etanol. El uso de fórceps quirúrgicos y tijeras para hacer incisión en la piel en forma de V de unos 8 cm en el abdomen inferior por encima del útero. Incisión en la piel solamente con la piel, manteniendo intactas las paredes musculares.
    2. El uso de fórceps y tijeras frescos para incidir los músculos y la pared muscular abdominal para entrar en el peritoneo.
    3. Identificar el útero en el peritoneo posterior inferior. Extraer el útero por la separación nítida de los tejidos circundantes.
    4. Lavar el útero con embriones con PBS estéril y 1x lugar en helado de PBS 1x.
    5. Con unas tijeras de punta fina para abrir las paredes uterinas para liberar embrión por embrión bajo un microscopio de disección (3X ampliación, Figura 1B). Use un par de pinzas para quitar los cascos embrionarias ( Figura 1B). Mantener embriones en medio de expansión en el hielo.
    6. Verificar el estado de desarrollo correcto por el Atlas del desarrollo del sistema nervioso de la rata 5. El tamaño del embrión correcta se muestra en la Figura 1B.
    7. Compruebe edad correcta aún más por la presencia de iniciar la formación de dígitos en la extremidad anterior de rata (FL) como se ilustra en la Figura 1A.
      Nota: La extremidad posterior (HL) no muestra todavía la separación dígitos (Figura 1B).
  4. Para la disección, la transferencia de embriones a los platos de Petri llenas sin recubrimiento con helado de PBS 1x. Realizar la disección bajo un microscopio de disección estéreo (3X a 20X) usando pinzas finas tratadas en autoclave.
    Nota: Las placas de Petri impedir la adhesión de tejido de la superficie del plato, como puede ocurrir con placas de cultivo celular recubiertas con plasma. agujas de alambre de tungsteno afiladas o similares también son útiles para ciertas etapas de la disección.
  5. Retire la piel de la cabeza y el cráneo a partir de la intersection del telencéfalo en desarrollo (TEL) y el diencéfalo (DI) (Figura 1B) tirando simultáneamente anterior y posteriormente con dos pinzas con el fin de obtener acceso al tubo neural en desarrollo (Figura 1C).
  6. Identificar el cerebro posterior-límite cerebro medio (MHB, cabeza de flecha negro en la Figura 1B-D), que separa el mesencéfalo (MES) del rombencéfalo. Cortar el rombencéfalo justo en o por debajo del MHB (Figura 1D, flecha triangular).
    Nota: El espacio subcutáneo adicional en el MHB facilita la retirada de la piel sin dañar el tubo neural.
  7. Cortar la conexión entre el telencéfalo / diencéfalo en la base del cráneo con el esqueleto facial (Figura 1E). Esto da lugar a un bloque que contiene el telencéfalo, diencéfalo y el mesencéfalo (TEL-di-MES) (Figuras 1F-H).
  8. Transferir el bloque TEL-DI-MES en medio de expansión en el hielo. Manténgalo completEly cubierto en medio de expansión en un plato de Petri sin recubrimiento. Mantenga el bloque en el mesencéfalo con un par de pinzas para evitar tocar el telencéfalo que contiene la SVZ cortical con células madre neurales.
  9. Repita los pasos 5.5 y 5.8 con todos los embriones (Figura 1F-H).
  10. Transferir uno TEL-DI-MES bloque en fresco enfriado con hielo 1x PBS. Corte a lo largo de la línea punteada en el mesencéfalo anterior (Figura 1F-H), que separa el mesencéfalo del diencéfalo, como se muestra en la figura 1I.
  11. Separar el DI del TEL cortando a lo largo de las líneas de trazos en la figura 1F. Ver telencéfalo aislado en la figura 1J.
  12. Dividir los dos hemisferios telencephalic, cortando a lo largo de la línea punteada en la figura 1J. Esto resulta en dos hemisferios separados como se ilustra en la Figura 1K.
    Nota: El hemisferio izquierdo se magnifica en la Figura 1L.
  13. Identificar la banda medialeminencias Lionic (MGE, la figura 2A; *) y eminencias ganglionares laterales (LGE, la figura 2A; +) visible a través de la futura interventriculare oval.
    1. El uso de pinzas o agujas, diseccionar a lo largo de una línea recta en la intersección entre la MEG y la LGE y la corteza anterior (ant-CTX, Figura 2B). Cortar una línea recta a través de la corteza, el hipocampo (cadera) y el plexo coroideo (CP). Esto separa la corteza anterior incluyendo el bulbo olfatorio (OB) de las eminencias ganglionares (GE, las Figuras 2B, C).
  14. Cortar una segunda línea recta en la intersección de la eminencia ganglionar caudal (CGE, la figura 2C, D) y la corteza posterior (Figura 2C), de nuevo corte a través de la corteza, el hipocampo y el plexo coroideo.
  15. Aplanar el telencéfalo. Eliminar completamente el polo posterior y el bulbo olfatorio (Figura 2D). Identificarel borde cortical que contiene el hipocampo y el plexo coroideo (Figura 2C), como se definió previamente 6,7.
    Nota: El hipocampo tiene un neuroepitelio más delgada que la corteza. El CP contiene vasos rojos.
    1. Separar el borde cortical de la corteza, dejando el tamaño de la corteza idéntico al tamaño de las eminencias ganglionares (Figura 2D). Esto da lugar a un bloque de la corteza (el tejido diana) y las eminencias ganglionares (GE, Figura 2D).
  16. Da la vuelta al bloque de corteza-GE con el lado ventricular (interior) de la superficie del plato.
    Nota: La superficie exterior del hemisferio se enfrentará al experimentador (Figura 2E). En la superficie exterior son las meninges que contiene los vasos sanguíneos-(Figura 2E).
    1. Pin de la GE de la superficie del plato con la mano izquierda y la cáscara de las meninges con un par de pinzas en la mano derecha (dominante) (Figura 2F ).
      Nota: Este es el paso técnicamente más exigente porque las meninges se adhieren fuertemente a la corteza. La separación de las meninges de la corteza se ve facilitada por el corte de una línea completamente recta (rectas) en pasos 5.13.1 y 5.14.
  17. Repita los pasos 5.12 a 5.16 para el otro hemisferio y todos los embriones. Cortar la corteza a lo largo de la LGE en una distancia de la mitad del diámetro principal de la LGE (Figura 2G, 2H). La corteza diseccionado se extiende por una superficie de 1,2 mm x 2,4 mm (Figura 2H) e incluye la capa SVZ / germinal de las células madre neurales.

6. Preparación de cultivos de explantes

  1. Cortar la corteza en explantes de menos de 400 m de diámetro (Figura 2I). Utilizar una cuadrícula de 400 micras (Figura 1) colocado por debajo de la placa de Petri para la disección de referencia (Figura 2H y 2I). Transferir todos los explantes en una placa de Petri fresca con hielo-cold medio de expansión.
  2. Retire la fibronectina a partir de una placa de cultivo tisular (paso 4.4). Deje que se seque. Añadir 1 ml de medio de expansión en frío para el centro de la placa de 35 mm de dimensión de cuadrícula de 10 mm x 10 mm (Figura 3). Dejar que el medio para formar una gota esférica (Figura 3).
  3. Inserte hasta 8 explantes al centro de la gota. Los explantes deben ser idealmente situados en la parrilla con al menos 3 mm de distancia entre sí para el análisis de la migración (ver sección 8).
  4. Incubar la placa durante aproximadamente 1 hr en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 21% de O 2, 5% CO 2) para la fijación de los explantes. Permitir que los explantes a asienten y se peguen a la superficie recubiertos de fibronectina. No agitar el plato, ya que los explantes pueden separar y mover fuera del centro de la rejilla óptima.
  5. Después de 1 h de incubación (37 ° C, 21% de O 2, 5% de CO 2), llenar el plato a un volumen total de 2 ml de medio de expansión más el crecimiento factores o sustancias de interés para probar e incubar.
    Nota: Ni digestión enzimática, ni suero o centrifugación son necesarios para la preparación de explante. Esto es óptimo para la integridad celular.

7. Preparación de NSC Cultura de los organismos unicelulares

  1. Calentar la expansión y medio realizando pases a 37 ° C.
  2. La transferencia de las piezas de la corteza disecados (desde el paso 5.17) en un tubo de 15 ml con medio de expansión en frío (tubo A). Centrifugar las piezas de la corteza durante 5 minutos a 1.200 x g. Aspirar el sobrenadante. Añadir 200 l medio de expansión pre-calentado para volver a suspender las piezas de la corteza.
  3. Añadir 700 l de medio de pases pre-calentado en el tubo de 15 ml con una punta de P1,000 (tubo A). Resuspender el pellet. Coloque la punta en la parte inferior del tubo 15 ml. Suave y lentamente disociar las piezas de tejido por aspiración tres veces con la punta P1,000.
    Nota: pases medio promueve la separación de células y es necesario para evitar el uso de enzimas.
  4. Deje que el tubo repose durante 30 a 60 segundos para grandes piezas no disociadas (más pesado) para ubicarse en la parte inferior. disociar las células individuales permanecerán en el sobrenadante. Transferir unos 700 l del sobrenadante a un tubo de 15 ml fresco (tubo B).
  5. Repita los pasos 7.3 y 7.4 para disociar las piezas más grandes.
  6. Repita los pasos 7.3 y 7.4 por segunda vez para disociar las piezas más grandes. Transferir toda sobrenadante a la fresca tubo de 15 ml (tubo B).
  7. Añadir medio de expansión a un volumen total de 5 ml. Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Evaluar las células muertas mediante tinción con azul de tripano.
    Nota: Las pequeñas NSC toleran los pasos 7.2 a 7.6 mejor que las células más grandes. A partir de 10 embriones esperar alrededor de 4 x 10 6 células con 10% de células muertas.
  8. Para la expansión de células madre neurales, la placa de 1,5 x 10 6 células por placa de 10 cm de cultivo de tejidos recubiertos de fibronectina en un volumen de 8 ml de medio de expansión. Para la expansión estándar, añadir 8 l de 1.000 x rhFGF2 de valores. Añadir 8 l rhFGF2 todos los días y me cambiede diámetro cada dos días.
    Nota: La corteza en esta etapa de desarrollo contiene una mayoría de NSCs y sólo una minoría de células diferenciadas. Las células diferenciadas minoritarios no responden a la rhFGF2 tratos y mueren durante el cultivo de expansión.
  9. Pasaje expandió NSC a 60% de confluencia.
    1. Para NSC paso, retire medio de expansión. Lavar las células rápidamente tres veces con medio de 5 ml pases. Espere de 2 - 4 min. Sin Ca + 2 y Mg + 2 las células desprenderse lentamente de la superficie, el redondeo. Verificar el desprendimiento de las células bajo el microscopio de fase. Esperar unos minutos, si es necesario, hasta que se observa el desprendimiento de la superficie visual.
      Nota: Las celdas individuales se separarán por completo, pero la mayoría de las células todavía se adhieren a la superficie del plato. La duración necesaria para el desprendimiento depende de la duración de recubrimiento fibronectina. Un recubrimiento de fibronectina corto (12 horas o menos) da como resultado el desprendimiento de células más rápido. Para los experimentos más largos (>; Se recomienda 1 semana) revestimiento de fibronectina de más de 24 horas.
  10. Usar una pipeta de 10 ml para separar suavemente las células de la superficie. Recoger el medio pases 5 ml con células y la transfiere a un nuevo tubo de 15 ml. Repetir con otros 5 ml de medio de pases.
  11. Disociar las células en el tubo de 15 ml pipeteando arriba y abajo tres veces, la colocación de la 10 ml pipeta en la parte inferior del tubo. Girar el tubo durante 15 minutos a 1200 xg a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 ml de medio de expansión. Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Utilice azul de tripano para evaluar las células muertas.
    Nota: Después de la expansión a 60% de confluencia, esperar 4 - 5 x 10 6 células con un recuento de células muertas en torno al 10%.
  12. Placa de 8 x 10 5 células por placa de 10 cm para obtener más pasajes.

8. Valoración de la migración

  1. Para la evaluación de la migración, aislar explantes de acuerdo con la Sección 5. Las semillas en los explantesPlacas de 35 mm de rejilla. Una hora después de la siembra, añadir FGF2 (rhFGF2). Colocar las cápsulas en una incubadora a 37 ° durante 2 días.
    Nota: Para la fijación explante óptimo, evitar mover los platos.
  2. Retire medio de 1.000 l punta. Añadir 2 ml de medio de expansión por 1.000 l punta de partida en el círculo interno (Figura 3). Esto reduce la tensión superficial en los explantes.
  3. Añadir los factores de crecimiento solo o en combinación según sea necesario para el experimento. Utilice FGF2 / BMP4 / TGFß1 como control positivo. Nota: En este experimento, se añadieron 2 FGF2 l por placa de 35 mm, 2 l BMP4 y 4 l TGFß1 solo y en combinación (Figura 5).
    1. Añadir factores adicionales y / o sustancias comprobables. Mantener los platos de nuevo sin tocar durante 2 días a 37 ° C.
  4. Tome fotografías de explantes en un microscopio invertido.
    Nota: Los explantes de estar dan mejores imágenes de contraste de fase que las células fijas. Ambos pueden ser utilizados.
  5. para la migraciónevaluación, utilizar un software de gráficos que permite mediciones de píxeles (por ejemplo, Fiji 8).
  6. Medir la red plato de 500 m de distancia en píxeles y utilizarlo como referencia interna.
  7. Definir el centro del explante como punto de inicio de la migración. Medir la distancia entre el centro del explante y el grupo más exterior de 10 células.
    Nota: Todas las células migran centrífugamente lejos del explante. Se forman espontáneamente una hoja en la periferia en las circunstancias analizadas (Figura 5).

9. Evaluación Invasion

  1. Preparar cultivo de tejidos de placas de 24 pocillos recubiertas de fibronectina de acuerdo con el artículo 4 del Protocolo.
  2. Colocar 300 l de medio de expansión caliente en el bien superior de cámaras de invasión celular. Se incuban las cámaras durante 30 minutos a 37 ° C y 5% de CO 2.
  3. Retire el medio de expansión del pozo superior y coloque la cámara de Boyden en la placa de 24 pocillos recubierta.
  4. Añadir 500 l de medio de expansión caliente con 0,5 l de rhFGF2 y rhBMP4 0,5 l a la parte inferior también.
  5. NSC paso y contar como se describe en la Sección 7. Los pasos del 1 al 4 son adecuados.
  6. La placa 5 x 10 5 células en un volumen de 300 l de medio de expansión caliente con 0,3 l de rhFGF2 y 0,3 l de rhBMP4 en el pocillo superior de la cámara de Boyden.
  7. Cultivar las células madre neurales semillas durante 24 horas.
  8. Añadir factores adicionales y / o sustancias comprobables a la cámara y cultivar las células durante otras 48 hr.
    Nota: Si las células son invasivos, que se pasan desde la parte superior bien a través de la capa de membrana basal hasta la parte inferior también. células invasoras se aferran a la parte inferior de la cámara de Boyden.
  9. Siga el protocolo proporcionado por el fabricante. Use hisopos de algodón (incluidos en el kit de ensayo de invasión) para eliminar las células no invasivas en el hoyo superior mediante la limpieza dos veces.
  10. Retire el medio de los pocillos y añadir 500 l con medio de expansiónuna mancha de la membrana plasmática de las células vivas y con el DAPI colorante nuclear a los pocillos.
  11. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C y 5% de CO2.
    Nota: Los colorantes se integrarán en la membrana y el núcleo de las células invasoras, respectivamente, para la visualización óptima 8. Opción: omitir tinte membrana plasmática cuando se haya previsto inmunocitoquímica multicolor.
  12. Retire el medio con los colorantes y lavar dos veces con medio de expansión. Visualizar y contar las células invasoras con un microscopio de fluorescencia invertido como se ha demostrado con anterioridad 8.
    Nota: Algunas células invasoras pueden haber separado de la parte inferior de la cámara y se han reducido a la superficie muy por debajo de donde se adhieren a la superficie recubierta. Para el análisis completo incluir las células en la superficie del pocillo.
  13. Se elimina el medio y fijar las células en helado fresco PFA al 4% durante 10 min. Lavar 3 veces con PBS 1x. Realizar inmunocitoquímica en las células invasoras, como se describió anteriormente 8-10.

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Resultados

Este sistema modelo de EMT se basa en el aislamiento normalizado de NSCs tanto como células individuales o como explantes de una región específica del tubo neural en desarrollo, la corteza central (Figuras 1 y 2). Para la evaluación cuantitativa, los explantes se sembraron a la derecha en el centro de una placa de cultivo de rejilla 500 micras (Figura 3). Explantes de la corteza por el medio fueron expuestos primero en FGF2 durante dos d...

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Discusión

En este estudio se describe un sistema estandarizado para el análisis de la EMT que utilizan células madre neurales (que se resumen en la Figura 3 complementario). La estandarización asegura la reproducibilidad (Tabla 1 y 2). Los NSCs se derivan de la corteza en desarrollo, un tejido que normalmente no experimenta EMT. Esto es ventajoso para el análisis de los primeros pasos en EMT. Los pasos iniciales en la EMT no pueden ser estudiados adecuadamente en las células tumorales que se han ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

El estudio fue apoyado por la Fundación Universidad de Basilea Ciencia y la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza con una donación de MHS y AG (SNF IZLIZ3_157230). Agradecemos a: Dr. Tania Rinaldi Burkat generosamente para proporcionar la infraestructura; todos los miembros del grupo Bettler para los debates y comentarios. Agradecemos a Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Suiza) para la instalación profesional y competente de la cámara de vídeo de alta definición completa MC170 (Leica Microsystems, Suiza).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BMP4, rhBMP4Sistemas RnD 314-BP-01M
Insulina de páncreas bovinoSigma I1882
Cámara de Boyden, ensayo de invasión celular CytoSelectplacas de 24 pocillosCBA-110Cell Biolabs
Placa de cultivo celular con rejillaPlato Ibidi de 500 mm, 35 mm80156
CellMask OrangeLife TechnologiesC10045Colorante de membrana plasmática, uso a escala 1:1.000.
DAPILifeTechnologiesD1306Stock a 5 mg/ml. Usar a 1:10.000. cancerígeno. Se requiere protección adecuada (guantes, abrigo, gafas).
DMEM/F12 Frasco mediano 1:1Gibco Invitrogen21331-020
FGF2, rhFGF2RnD Systems233-FB-01M
Fibronectina,bovina Sigma F4759
Suplemento Glutamax Gibco Invitrogen 35050-061
Software gráfico con función de medición de píxelesFijifiji.sc/Fijiversión 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS mediaSigma H9394
Apo-Transferrina humanaSigmaT1147Posible irritante pulmonar. Evite la inhalación. Use la protección adecuada.
L-glutaminaGibco Invitrogen 25030-024
Nestin, Anticuerpo anti Nestin para ratonesGenetexGTX26142Uso a 1:100, 4% de fijación de PFA, Triton X100 al 0,1%
Olig2, Anticuerpo anti Olig2de conejo Proporcionado por Hirohide TakebayashStock personalUso a 1:2.000, 4% de fijación de PFA, Triton X100 a 0,1%
Penicilina/Estreptomicina/FungizoneGibco Invitrogen 15240-062
Podoplanin, Anticuerpo anti Podoplaninpara ratones AcrisDM3614PÚselo a 1:250, fijación de PFA al 4%, evite Triton X100
Poly-L-ornitinaSigma P3655
PutrescineSigma P5780Irritante de la piel y los ojos. Se requiere una protección adecuada.
Selenito de sodioSigma S5261
Sox10, Anticuerpo anti Sox10 de conejoMillipore ChemiconAB5774Uso a 1:200, 4% de fijación de PFA, Triton X100 al 0,1%
TGFb1, rhTGFb1RnD Systems240-B-010
Placas de Petri sin recubrimientoFalcon Corning351029
Sistema de de

Referencias

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