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Artículo de método

Generación de medios y aplicaciones acondicionado de órganos para el estudio de las influencias específicas de órganos en el seno cáncer metastásico Comportamiento

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DOI:

10.3791/54037

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13 de junio de 2016

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1London Regional Cancer Program, London Health Sciences Centre, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 3Department of Biochemistry, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 4Department of Oncology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 5Lawson Health Research Institute

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe un sistema modelo ex vivo compuesto por medios condicionados por órganos derivados del ganglio linfático, hueso, pulmón y cerebro de ratones. Este sistema modelo se puede utilizar para identificar y estudiar los factores solubles derivados de órganos y sus efectos sobre el tropismo de órganos y el comportamiento metastásico de las células cancerosas.

Resumen

El cáncer de mama hace metástasis preferentemente en los ganglios linfáticos, los huesos, los pulmones, el cerebro y el hígado en pacientes con cáncer de mama. Los esfuerzos de investigación anteriores se han centrado en identificar los factores inherentes a las células de cáncer de mama que son responsables de este patrón metastásico observado (denominado tropismo de órganos), sin embargo, se sabe mucho menos sobre los factores presentes dentro de órganos específicos que contribuyen a este proceso. Esto se debe en parte a la falta de sistemas de modelos in vitro que recapitulen con precisión el microambiente de los órganos. Para abordar esto, se ha establecido un sistema modelo ex vivo que permite el estudio de los factores solubles presentes en diferentes microambientes orgánicos. Este modelo consiste en generar medios condicionados a partir de órganos (ganglios linfáticos, huesos, pulmones y cerebro) aislados de ratones atímicos normales desnudos. El sistema modelo se ha validado demostrando que diferentes líneas celulares de cáncer de mama muestran un comportamiento maligno específico de la línea celular y del órgano en respuesta a medios condicionados por órganos que corresponden a su potencial metastásico in vivo. Este sistema modelo se puede utilizar para identificar y evaluar factores solubles específicos derivados de órganos que pueden desempeñar un papel en el comportamiento metastásico de las células cancerosas de mama y otros tipos de cáncer, incluidas las influencias en el crecimiento, la migración, el comportamiento similar al tallo y la expresión génica, así como la identificación de posibles nuevos objetivos terapéuticos para el cáncer. Este es el primer sistema modelo ex vivo que se puede utilizar para estudiar en detalle el comportamiento metastásico específico de un órgano y evaluar el papel de factores solubles específicos derivados de órganos en el proceso de metástasis del cáncer.

Introducción

El cáncer de mama es el cáncer más frecuentemente diagnosticado en mujeres y la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer 1. alta tasa de mortalidad de cáncer de mama se debe principalmente a la falta de la terapia convencional para mitigar y eliminar la enfermedad metastásica; aproximadamente el 90% de las muertes relacionadas con el cáncer se deben a la metástasis 2. La comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de la cascada metastásica es de suma importancia para el desarrollo de terapias eficaces tanto en temprano y el cáncer de seno en etapa tardía.

Las investigaciones anteriores han ayudado a aclarar la naturaleza de múltiples etapas de la metástasis del cáncer de mama y se plantea la hipótesis de que el resultado de la progresión de cáncer y la metástasis depende en gran medida de las interacciones entre las células cancerosas y el entorno de acogida 3. Las observaciones clínicas indican que muchos tipos de cáncer presentan tropismo de órganos, es decir., La tendencia a la metástasis preferentemente a lo específico organs.In el case de cáncer de mama, la enfermedad de un paciente típicamente se extiende o metástasis a 5 sitios principales, incluyendo el hueso, los pulmones, los ganglios linfáticos, el hígado y el cerebro 4-6. Muchas teorías se han desarrollado para explicar este proceso, pero sólo unos pocos han resistido la prueba del tiempo. La teoría de Ewing de metástasis, se propone en la década de 1920, la hipótesis de thatthe distribución de la metástasis era estrictamente debido a factores mecánicos; por el que las células tumorales se llevan a través del cuerpo por los patrones de flujo de la sangre fisiológica definidos normales y simplemente detienen en el primer lecho capilar que encuentran 7. Por el contrario, "semilla y del suelo" hipótesis de Stephen Paget 1889 sugirió que las interacciones moleculares adicionales fueron responsables de la supervivencia y el crecimiento de metástasis, en el que las células cancerosas ( "semillas") sólo pueden establecerse y microambientes de órganos proliferatein que producen factores moleculares apropiados ( "suelo ") 8. Casi un siglo más tarde, Leonard Weiss bajotomó un meta-análisis de los datos publicados anteriormente de la autopsia y se confirmó la predicción de Ewing que muchos tumores metastásicos detectados en el momento de la autopsia se encontraron en las proporciones previstas que se esperarían si metastásico tropismo órgano fue determinado por patrones de flujo sanguíneo solo. Sin embargo, en manyinstances hubo menos o más metástasis formadas en ciertos sitios a continuación, se podría esperar por factores mecánicos propuestos 9 de Ewing. Estas cuentas y teorías sugieren que los microambientes de órganos específicos desempeñan un papel fundamental en los patrones de difusión y posterior crecimiento y la supervivencia de muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de mama.

Últimos esfuerzos de investigación se han centrado principalmente en los factores derivados de células del tumor y su contribución al tropismo de órganos observado en la metástasis del cáncer de mama 10-12, factores sin embargo pocos estudios han explorado derivados del microambiente de órganos que pueden proporcionar un nicho favorable para el establecimientode metástasis de cáncer de mama. Esto se debe en gran parte a las dificultades técnicas de estudio de los componentes del microambiente de órganos in vitro.

El presente artículo describe un sistema ex vivo integral modelo para el estudio de la influencia de los componentes solubles de los ganglios linfáticos, hueso, pulmón, cerebro y en el comportamiento metastásico de células de cáncer de mama humano. Estudios anteriores han validado este modelo de sistema mediante la demostración de que las diferentes líneas celulares de cáncer de mama muestran un comportamiento maligno de células línea específica y órgano-específica en respuesta a los medios de comunicación de órganos acondicionado que corresponde a su in vivo potencial metastásico 13. Este sistema modelo se puede utilizar para identificar y evaluar los factores solubles de órganos derivados específicos que pueden desempeñar un papel en el comportamiento metastásico de mama y otros tipos de células cancerosas, incluyendo las influencias sobre el crecimiento, la migración, el comportamiento y la expresión de genes como tallo, así como la identificación deposibles nuevas dianas terapéuticas para el cáncer. Este es el primer sistema de modelo ex vivo que se puede utilizar para estudiar el comportamiento metastásico de órganos específicos en detalle y para evaluar el papel de los factores solubles derivados de órganos en la conducción del proceso de la metástasis del cáncer.

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Protocolo

Se llevaron a cabo todos los estudios con animales de acuerdo con las recomendaciones del Consejo Canadiense de los Animales, en virtud de los protocolos aprobados por la Universidad de Western Uso de Animales Subcomité.

1. Aislamiento de órganos (pulmón, cerebro, hueso, de ganglios linfáticos)

  1. Prepare cuatro estéril de 50 ml tubos cónicos (uno para cada órgano a ser aislado) que contiene aproximadamente 30 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Pre-sopesar cada tubo de PBS utilizando una balanza electrónica.
  2. La eutanasia de 6-12 semanas de edad ratones por inhalación de CO2. Los ratones se deben dejar en la cámara de CO 2 durante aproximadamente 1 - 2 min o hasta que el ratón deja de moverse y la respiración. la eutanasia exitosa puede confirmarse aún más por la falta de latidos del corazón cuando está marcada de forma manual con un dedo. Evitar la dislocación cervical ya que este método puede romper los vasos sanguíneos del cuello que lleva a dificultades para retirar los ganglios linfáticos axilares.
    Nota: El trabajo previo ha utilizado específicamenteratones desnudos femeninos sanos, Hsd: atímicos nu Nude- Foxn1 13.
  3. En una campana de cultivo de tejido estéril, colocar el ratón sobre su espalda en un cojín de espuma de poliestireno, difundir las extremidades y el uso de alfileres para mantenerlas en su lugar.
  4. El uso de pinzas y tijeras estériles, cortar la piel abdominal en la línea media en los genitales y cortar hacia arriba, hacia la boca. Tire suavemente la piel abdominal de los músculos abdominales y el pin en su lugar en la almohadilla de espuma de poliestireno.
  5. Busque la axilar, braquial, y los ganglios linfáticos inguinales.
    Nota: Los ganglios linfáticos suelen estar rodeados de tejido graso. Los ganglios linfáticos inguinales son los más fáciles de localizar ya que se encuentran superficialmente en la unión de dos vasos sanguíneos en la piel abdominal retirado. Axilares y ganglios linfáticos braquial se encuentran más profundamente dentro del tejido y requieren maniobras suaves del tejido.
    1. Después de haber localizado los ganglios linfáticos, usar las tijeras para cortar con mucho cuidado la linfa sindes de la piel, la grasa y los vasos y eliminarlas del ratón. Para confirmar la disección adecuada, rodar el fórceps sobre el tejido extirpado. Si existe un bulto duro al rodar el fórceps sobre el tejido, a continuación, un ganglio linfático ha probablemente ha eliminado con éxito.
    2. Coloque los ganglios linfáticos en PBS frío.
  6. Usando las pinzas y tijeras, abrir la cavidad abdominal mediante incisión en la pared abdominal expuesta en un movimiento ascendente hacia el pecho. Corte con cuidado a través del esternón, exponiendo la cavidad torácica.
  7. Situar la membrana debajo de los pulmones y cortar el diafragma. Se debe tirar hacia las costillas debido a la tensión.
  8. Levantar los pulmones desde abajo y cortar el tejido subyacente hacia la tráquea. Esto permite que los pulmones para ser removidos libremente de la cavidad torácica. Quitar el corazón y los pulmones en bloque y colocar en PBS frío. El corazón puede ser retirado de los pulmones aquí o simplemente antes de la pesada en el paso 2.
  9. Eliminar elpasadores, manteniendo el ratón en su lugar en la almohadilla de espuma de poliestireno. Ponga el ratón y cortar la piel de la espalda baja todo el camino al otro lado de flanco a flanco.
  10. Con un trozo de gasa estéril para mantener el torso del ratón, pelar la piel hacia atrás del ratón sobre las piernas y los pies del ratón.
  11. Utilizando el mismo trozo de gasa estéril, mantenga la pierna en su lugar, cuidadosamente romper la articulación del tobillo del pie del ratón y pelar la piel sobre la articulación proximal hacia la articulación de la rodilla.
  12. Con unas tijeras, retire la tibia libre de la articulación de la rodilla y colocar en PBS frío.
  13. Repetir los pasos 1,11) a 1,12) con el miembro opuesto.
  14. Con unas pinzas, mantenga el fémur en su lugar, cortar el tejido circundante muscular usando las tijeras y retire el fémur, colocándolo en PBS frío.
  15. Repita el paso 1.14) con el miembro opuesto.
  16. El uso de un nuevo trozo de gasa estéril, mantenga la cabeza del ratón en su lugar. El uso de pinzas y tijeras, retire suavemente la piel para exponer los sKull. Con unas tijeras, cortar cuidadosamente el cráneo occipital del centro de la parte superior en una línea recta y hacia abajo para exponer el cerebro posterior.
  17. Con unas pinzas, cuchara debajo del cerebro hacia la parte anterior y remover todo el cerebro. Coloque el cerebro en PBS enfriado en hielo.
  18. Repetir los pasos 1.1) a 1,17) durante al menos cuatro ratones.

2. Con un peso de órganos

  1. Después del aislamiento de órganos, pesar cada tubo de PBS que contiene de pulmón y tejido cerebral usando una balanza electrónica.
  2. Calcular la diferencia de peso restando el peso pre-aislamiento (PBS) a partir del peso del tubo de PBS + órganos (pulmón y cerebro).
  3. Determinar la cantidad de medios de comunicación necesarios para volver a suspender los fragmentos de tejido a partir de la diferencia de peso calculada.
    Nota: pulmón y el tejido cerebral son de peso normalizado por resuspensión en una relación 4: 1 los medios de comunicación: relación de tejido (vol / peso).

3. Generación de Medios Lung-neuronas del asta posterior acondicionado

  1. En un t estériltema cultura capó, invertir los tubos de PBS que contiene los pulmones o el cerebro tres veces para eliminar la sangre residual de órganos y aspirado de PBS que contenía la sangre. Repita con PBS frío fresco hasta que la solución aparece clara, sin evidencia de sangre.
  2. Coloque los pulmones y el cerebro en separadas 60 mm 2 placas de Petri de vidrio. El uso de dos hojas de bisturí estériles, los pulmones de carne picada o cerebros por corte repetidamente hacia atrás y adelante hasta que los fragmentos de tejido son aproximadamente ~ 1 mm 3 en tamaño.
  3. fragmentos de tejido Resuspender en volumen apropiado (determinado previamente en el paso 2.3) de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM): medio F12 suplementado con 1x concentró suplemento mitógeno y penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml).
  4. Añadir pulmonares o tejido cerebral fragmentos resuspendidos a un pocillo de una placa de 6 pocillos.
  5. Incubar los fragmentos de tejido en medios durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Después de la incubación, recoja acondicionado medios de comunicación para cada tejido y fás diluir mediante la adición de tres volúmenes equivalentes de medio fresco en un tubo cónico de 50 ml.
  6. Centrifugar a 1000 xg en medio condicionado diluido para cada órgano a 4 ° C durante 15 min para eliminar los residuos de tejido de gran tamaño. Recoger el sobrenadante medios y filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras.
  7. Piscina acondicionado medios de comunicación de cada órgano (es decir., Pulmón con cáncer de pulmón y el cerebro con el cerebro) a partir de varios ratones para tener en cuenta la variabilidad-ratón-a-ratón. Alícuota y almacenar los medios condicionados a -80 ° C hasta su uso.

4. Generación de medios acondicionados de la médula ósea

  1. En una campana de cultivo de tejido estéril, recortar el exceso de tejido de la médula y quitar epífisis (piezas de terminación) de los huesos con unas tijeras.
  2. El uso de un 27 ½ G aguja, la cavidad medular de los huesos ras empujando 1 ml de PBS a través del centro de cada hueso. Esto le permitirá tomar muestras de células estromales de la médula ósea (BMSC) en un tubo nuevo que contenía PBS.
  3. Centrifugar a 1,000 xg durante 5 min a 4 ° C y se lava dos veces con PBS BMSC. Resuspender las células estromales de médula ósea en 20 ml de medio de crecimiento de las células estromales de la médula (DMEM: F12 suplementado con 1x concentran mitógeno suplemento, penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml) y 10% de suero Boven fetal (FBS) ).
  4. Placa 10 ml de células estromales de médula ósea se resuspendieron en un matraz T75.
    Nota: Combinar y células de la placa de cada 2 ratones en cada matraz T75; de cuatro ratones, dos matraces T75 se necesitan (aproximadamente 1 x 10 7 células / frasco).
  5. Se incuban las células estromales de médula ósea en los medios de crecimiento de las células estromales de la médula durante 24 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Después de la incubación, quitar el medio de los dos matraces T75 y poner en frasco nuevo T75, etiquetar este matraz como "flotador Frasco". Añadir medio de cultivo de células estromales de la médula fresca de 2 frascos anteriores e incubar los 3 matraces a 37 ° C y 5% de CO 2.
  6. Después de células alcanzan aproximadamente el 70% de confluencia (aproximadamente 5-7días) las células pasaje. Para ello, retire medio y lavar las células dos veces con PBS (3 ml cada lavado). Retirar PBS y añadir 3 ml de solución de tripsina / EDTA, asegurando que la tripsina cubre toda la superficie del matraz. Después las células se levantan del matraz (~ 2-3 min), deje de tripsinización reacción mediante la adición de 3 estroma medio de crecimiento de células ml hueso). Centrifugar 900 xg durante 5 min a 4 ° C, tirar medios de comunicación, y volver a suspender las células en 10 ml de medio de crecimiento de células estromales de la médula fresca.
  7. Las células de la piscina de todos los frascos y el paso 1: 5 en tres nuevos matraces T75 y se incuba a 37 ° C y 5% de CO2. Después las células lleguen de nuevo a 70%, repita el paso 4.6 y piscina y de paso todas las células adherentes por segunda vez. Re-placa de todas las células a cuatro matraces T75 e incubar 37 ° C y 5% de CO2. medios de cultivo de células estromales de médula se debe utilizar para todas las medidas.
  8. Permitir que las células alcanzan la confluencia, las células se lavan tres veces con PBS y se añaden estroma medio de recolección de células óseas (DMEM: F12 medios + 1x mitógeno concentrado dopplement + penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml); 10 ml / T75), asegurándose de que este medio está libre de FBS. Recoger los medios de médula ósea acondicionado 72 horas más tarde, se filtra a través de un filtro de 0,22 micras, piscina, alícuota y se almacena a -80 ° C hasta su uso.
  9. Si se desea, confirmar el fenotipo de las células del estroma de la médula ósea aisladas (BMSC) utilizando anticuerpos contra Sca-1 de ratón, CD105, CD29, y CD73, CD44, usando citometría de flujo estándar técnicas como se ha descrito previamente 13.

5. Generación de Medios acondicionado Linfonodular

  1. En una campana de cultivo de tejido estéril, invertir tubo de PBS que contenía ganglios linfáticos tres veces para eliminar sangre residual de los ganglios linfáticos y el aspirado sangrienta PBS. Repita con PBS frío fresco hasta que la solución aparece clara, sin evidencia de sangre.
  2. Coloque los ganglios linfáticos en placas de Petri de 60 mm 2 de vidrio. El uso de dos hojas de bisturí estériles, picadillo de ganglios linfáticos por corte repetidamente hacia atrás y adelante hasta que tissufragmentos de correos son de aproximadamente 1 mm 3 en tamaño.
  3. En un tubo cónico, fragmentos de tejido se resuspende en 10 ml de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) medio suplementado con penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml), 5 x 10 -5 M β-mercaptoetanol (estéril 1,75 l / 500 ml de medio) y 10% de FBS.
  4. Centrifugar a 900 xg durante 5 min a 4 ° C y volver a suspender todas las células en 30 ml de medio. Añadir 5 ml de medio / pocillo en una placa de 6 pocillos y se incuban durante 7 días a 37 ° C y 5% de CO2.
  5. Después de la incubación de 7 días, descartar los medios de comunicación, lavar las células adherentes con 5 ml de PBS caliente y añadir 5 ml de medio fresco a cada pocillo. Permitir que las células crecen hasta la confluencia (aproximadamente 5 - 7 días), trypsinize, piscina para todas las células, y el paso como se describe en el paso 4.6. células re-placa a placa de 6 pocillos. Repita este paso tres veces.
  6. Después de tres pasajes, permiten que las células crezcan hasta confluencia, se lavan los pocillos tres veces con PBS y añadir 2 ml / pocillo de DMEM: F12 + 1xsuplemento concentrado mitógeno y penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml), asegurándose de que este medio está libre de FBS. Recoger los medios de comunicación con ganglios linfáticos acondicionado después de 72 horas, piscina, alícuota y se almacena a -80 ° C hasta su uso.
  7. Si se desea, confirmar el fenotipo de las células de los ganglios linfáticos estromales aisladas (LNSC) utilizando anticuerpos contra CD45 de ratón y GP38, utilizando citometría de flujo estándar técnicas como se ha descrito previamente 13.

6. El uso de los medios de comunicación acondicionado de órganos para los ensayos intermedios relacionados con el comportamiento metastásico de células de cáncer

  1. Una vez que los medios de comunicación de órganos acondicionado se ha generado como se describe en los pasos 1 - 5, lo utilizan para llevar a cabo diferentes células de aguas abajo y los ensayos de biología molecular con el fin de determinar la influencia de los factores de órganos derivados solubles en el comportamiento metastásico de las células cancerosas. Ejemplos de ensayos convencionales (descritas en otra parte en la literatura) incluyen arrays de proteínas, 13 ensayos de crecimiento celular Ensayos 13, la migración celular 13, tumorsphere formación 14, y RT-PCR 15. Los medios de comunicación de base original usada para generar los medios de órgano-acondicionado (es decir, no condicionado DMEM:. Medio F12 suplementado con 1x concentró suplemento mitógeno y penicilina (50 mg / ml) / estreptomicina (50 mg / ml) se debe utilizar como un control negativo .

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Resultados

Generación de Medios de órganos acondicionado

Un diagrama general / esquemático del proceso de aislamiento de órganos y generación de medios acondicionados se presenta en la Figura 1, con las imágenes fotográficas representativas del procedimiento que se muestra en la Figura 2. Debe tenerse en cuenta que cuando este protocolo era primera fase de desarrollo, se incluyó hígado e...

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Discusión

La metástasis es un proceso complejo por el cual una serie de eventos celulares que son en última instancia responsable de la invasión de tejidos y tumores distantes establecimiento 4,30,31. El sistema modelo ex vivo que aquí se presenta puede ser utilizado para estudiar dos aspectos importantes de la progresión metastásica: vivienda de células de cáncer o de migración a un órgano específico ( "llegar allí") y el crecimiento en dicho órgano ( "creciendo allí"). Muchos estudios se ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Canadiense de Cáncer de Mama-Región de Ontario, la Fundación Canadiense para la Innovación (No. 13199), y el apoyo de donantes de John y Donna Bristol a través de la Fundación de Ciencias de la Salud de Londres (a A.L.A.). El programa de becas de posgrado de Ontario (provincia de Ontario, a G.M.P. y J.E.C.), el programa de becas de posgrado de Canadá (a M.M.P.), el Programa de Capacitación Estratégica de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (a M.M.P., G.M.P y J.E.C.) y la Unidad de Investigación Traslacional de Cáncer de Mama Pamela Greenaway-Kohlmeier en el Programa Regional de Cáncer de Londres (a M.M.P., G.M.P., J.E.C. e Y.X.). A.L.A. cuenta con el apoyo de un Premio al Nuevo Investigador del CIHR y un Premio al Investigador Temprano del Ministerio de Investigación e Innovación de Ontario.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos cónicos de 50 mlThermo Scientific (Nunc)339652Mantener estéril
1x Solución salina tamponada con fosfatoThermoFisher Scientific10010-023Mantener estériles
Ratones desnudosHarlan LaboratoriesHsd:Athymic Nude-Foxn1nuUso a las 6 - 12 semanas de edad
Almohadilla de espuma de poliestirenoN/AN/ALa tapa desechada (~ 4 x 8 pulgadas o más) de un contenedor de envío de espuma de poliestireno se puede usar para este propósito. Esterilizar limpiando con etanol.
PinzasFine Science Tools11050-10Mantener estériles
TijerasFine Science Tools14058-11Mantener estériles
almohadillas de gasaFisher Scientific22-246069Mantener estériles
60 mm2 placas de Petri de vidrioSigma-Aldrich CLS7016560Mantener estériles
Hojas de bisturíFisher ScientificS95937AMantenga estéril
DMEM:F12Life Technologies21331-020Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar, mantener estéril  
1x Mito + Serum ExtenderBD Biosciences 355006Referido como "suplemento concentrado de mitógenos" en el manuscrito. Mantener estéril
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)Life Technologies15140-122Mantener estéril
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)Life Technologies11875-093Caliente en 37 ° C baño de agua antes de usar, mantener estéril  
Suero fetal bovinoSigma-AldrichF1051-500MLMantenga la solución estéril
tripsina/EDTAThermoFisher ScientificR-001-100caliente en 37 ° C baño de agua antes de usar, mantener estéril  
Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillosThermo Scientific (Nunc)140675Mantener estéril
0,22 μ m filtros de jeringaSigma-Aldrich Z359904Mantener estériles
Matraces de cultivo de tejidos T75Thermo Scientific (Nunc)178905Mantener estériles
TranswellsSigma-AldrichCLS3464Mantener estéril, uso para ensayos
de migración Anti-ratón Sca-1R& D SistemasFAB1226Puso en 10 y micro; l/106 pilas
Anti-ratón CD105 R& D SistemasFAB1320Puso en 10 y micro; l/106 células
Anti-ratón CD29R& D SistemasFAB2405P-025uso a las 10 y micro; l/106 pilas
Anti-ratón CD73R& D SistemasFAB4488Puso en 10 y micro; l/106 células
Anti-ratón CD44R& D SistemasMAB6127 uso de SPa 0,25 y micro; g/106 células
Anti-ratón CD45eBioscience11-0451-81uso a 5 µ l/106 células
Anti-ratón gp38eBioscience12-5381-80uso a las 10 y micro; l/106 células
β-mercaptoetanol Sigma-AldrichM6250 Mantener estéril
Matrices de proteínasRayBiotech Inc.AAM-BLM-1-2Utilice 1 matriz por condición de medio (incluido el control negativo), por triplicado
de

Referencias

  1. Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  3. Fidler, I. J. The organ microenvironment and cancer metastasis. Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).
  4. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  5. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  6. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  7. Ewing, J. Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors. Am J Med Sci. 176 (2), 278(1928).
  8. Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).
  9. Weiss, L. Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy. Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).
  10. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
  11. Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
  12. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
  13. Chu, J. E., et al. Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins. Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).
  14. Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).
  15. Deepak, S., et al. Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes. Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).
  16. Hammerschmidt, S. I., et al. Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo. J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).
  19. Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 1 (5), 621-632 (2001).
  20. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets. Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).
  21. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).
  22. Radisky, E. S., Radisky, D. C. Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion. Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).
  23. Kakinuma, T., Hwang, S. T. Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis. J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).
  24. Zlotnik, A. Chemokines and cancer. Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).
  25. Schlesinger, M., Bendas, G. Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis. Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).
  26. Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. Autophagy and endocrine resistance in breast cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).
  27. Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer. Med Oncol. 31 (1), 805(2014).
  28. Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis. Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).
  29. Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain. Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).
  30. Chambers, A. F., et al. Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy. Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).
  31. Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).
  32. Gupta, G. P., et al. Identifying site-specific metastasis genes and functions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).
  33. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).
  34. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
  35. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).
  36. Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
  37. Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).
  38. Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair. J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).

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