Aislamiento y Celular del fenotipo de células madre mesenquimales derivadas del líquido sinovial y la médula ósea de cerdos enanos

Resumen

Se presenta un protocolo que establece células madre mesenquimales (MSCs) aisladas del líquido sinovial y de la médula ósea de minicerdos y recolectadas de forma no invasiva mediante aspiración con jeringa. El fenotipado celular se realizó mediante citometría de flujo después del aislamiento celular y cultivo in vitro de médula ósea y fluidos sinoviales derivados de MSCs.

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSCs) se han establecido después del aislamiento de varias fuentes de tejidos, incluyendo la médula ósea y el líquido sinovial. Recientemente, se informó que las MSC derivadas del líquido sinovial tienen potencial de diferenciación de múltiples linajes y características inmunomoduladoras, lo que indica que estas células se pueden usar para ingeniería de tejidos y tratamientos sistémicos. Este estudio presenta un protocolo para el aislamiento simple y no invasivo de MSCs derivadas de la médula ósea y el líquido sinovial de minipigs para analizar marcadores de superficie celular para el fenotipado celular y el cultivo in vitro. Utilizando minicerdos sexualmente maduros de seis meses de edad, se extrajo médula ósea del hueso de la cresta ilíaca utilizando un extractor de médula ósea, y el líquido sinovial se aspiró de la articulación femorotibial. Los procedimientos para la recolección de muestras de ambas fuentes no fueron invasivos. Se proporcionan los protocolos para el aislamiento efectivo de MSCs a partir de fuentes celulares recolectadas y para la creación de condiciones de cultivo in vitro para expandir MSCs estables de minipigs y la aplicación de tratamientos autólogos sistémicos. Para el fenotipado celular, los marcadores de superficie celular de ambas células se analizaron mediante citometría de flujo. En los resultados, las MSC se aislaron del líquido sinovial de los minicerdos y mostraron que las MSC derivadas del líquido sinovial tienen una morfología y un fenotipo celular similares a las MSC derivadas de la médula ósea. Por lo tanto, el líquido sinovial obtenido de forma no invasiva es una valiosa fuente de MSCs.

Introducción

Las células madre mesenquimales multipotentes (MSCs) se pueden clasificar en linajes de células mesenquimales, y las MSCs se han establecido y aislado de diversas fuentes de tejidos, como la médula ósea, los cordones umbilicales, las placentas, el tejido adiposo, la piel dérmica, el músculo esquelético, los folículos pilosos, las membranas sinoviales y los dientes^1-5. Actualmente, se ha prestado atención a las MSC derivadas de sinoviales porque estas células pueden ayudar a tratar enfermedades articulares, como la fracción ósea, la osteoartritis y la artritis reumatoide (AR), y debido al potencial regenerativo de las MSC en el cartílago o el hueso dañados, también pueden ayudar a tratar la modulación inmune o las enfermedades autoinmunes^6-8. La mayoría de las investigaciones sobre MSCs derivadas de fuentes sinoviales han empleado MSCs de la membrana sinovial en lugar de del líquido sinovial^2,9; por lo tanto, la comprensión biológica de las MSC derivadas del líquido sinovial es limitada.

El líquido sinovial es una fuente fácilmente accesible de MSCs, que puede ser aspirada durante los diagnósticos o tratamientos de pacientes y durante las confirmaciones diagnósticas de diversas afecciones de artritis que no requieren procedimientos invasivos, como la osteoartritis o la AR. La población de MSCs derivadas del líquido sinovial en la cavidad sinovial está significativamente aumentada en los pacientes artríticos en comparación con los pacientes no artríticos^10-12. Por lo tanto, el líquido sinovial es una excelente fuente candidata para las MSC, particularmente para la terapia con células madre autólogas en pacientes con articulaciones inflamadas o lesionadas. Además, las MSC derivadas del líquido sinovial tienen una capacidad condrogénica, capacidades de inmunomodulación y una alta tasa de proliferación. Este estudio estableció protocolos para la extracción de médula ósea y la aspiración de líquido sinovial de minicerdos utilizando métodos no invasivos y para la expansión in vitro de células aisladas y el análisis de fenotipos celulares.

Protocolo

Los experimentos con animales fueron autorizados por el Centro de Experimentación Animal para Biomédica en la Universidad Nacional de Gyeongsang.

1. Preparativos para realizar el procedimiento de Animales

1. Preparar el adulto cerdos enanos hembra para la recogida no invasiva de las MSC de la médula ósea y el líquido sinovial. Realizar el examen clínico de los cerdos enanos un día antes de la anestesia y la recogida de muestras.
   1. Proporcionar los animales clínicamente normales para los exámenes físicos, que incluyen la temperatura corporal, la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca y de la observación del comportamiento y hematológicos estados de los cerdos, utilizando pruebas de conteo sanguíneo completo.
      Nota: los intervalos de parámetros para cerdos enanos clínicamente sanos son 11 a 29 / min para la velocidad de respiración, 68-98 / min para el ritmo cardíaco, y 37 a 38 ° C para la temperatura del cuerpo.
2. Retire la ropa de cama comestible a partir de la jaula durante el período de ayuno preoperatorio de 6 - 12 horas prior para la administración de la anestesia para cerdos enanos jóvenes y adultos, 3 h de ayuno debe ser observado para los recién nacidos. Proporcionar agua potable hasta el momento de la anestesia.

2. Preparación de los animales para la anestesia

1. Medicar los cerdos enanos antes de la administración de la anestesia con acepromazina (0,1 mg / kg), medetomidina (0,03 mg / kg), y atropina (0,04 mg / kg).
   1. Inyectar todos los medicamentos por vía intramuscular (IM) usando una aguja de 21 G con una longitud de al menos 30 mm para cerdos enanos adultos. Realizar la inyección IM 1-3 cm por detrás de la oreja en el músculo cervical lateral o en el músculo del muslo.
      Nota: Realizar todos los procedimientos sin provocar miedo o estrés en los animales o que requieren una manipulación brusca para inyectar la medicación previa.
2. Coloque los cerdos enanos en una posición dorsal-reclinada.
3. Quince minutos después de la administración de la medicación previa, iniciar la anestesia utilizando 1,5% de administrador isofluranotrado por inhalación.
   1. Continuar la inhalación de isoflurano (1,5%) a través de un tubo endotraqueal, seguido de un aumento en la concentración de 2,5%, con oxígeno (1,5 L / min) como gas portador.
4. Un seguimiento continuo de la frecuencia cardíaca, la temperatura corporal, y la saturación de oxígeno en sangre percutánea (SpO ₂₎ de los cerdos enanos durante la anestesia. Utilice una manta de agua circulante a una temperatura de 38-39 ° C para mantener la temperatura corporal. Aplicar una pomada oftalmológica para proteger los ojos se sequen durante la anestesia.
5. Siga la clasificación de Guedel para evaluar la profundidad de la anestesia ^13.

3. Preparativos para el aislamiento y cultivo celular

1. Para cultivar las MSCs derivadas de médula ósea y el líquido sinovial, se preparan 500 ml de medio avanzado de Dulbecco Eagle modificado (ADMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / ml de crecimiento de fibroblastos básico factor (bFGF), y 1,0% de penicilina-estreptomicina (10.000 UI y 10.000 g / ml, respectivamente, Pen-Strep).
   1. Incubar la ADMEM a 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO ₂ dentro de una incubadora de CO _2.
2. Preparar 500 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) según las instrucciones del fabricante para el aislamiento de células y lavado.

4. Recopilación de Médula Ósea de la cerdos enanos

1. Seleccione un área de aproximadamente 15 x 15 cm de tamaño en la cresta ilíaca (Figura 1), y quitar el pelo de esta área usando maquinillas de afeitar esterilizadas o una maquinilla eléctrica. Una vez que se coloca el cerdo enano, alternativamente fregar el sitio del procedimiento tres veces con los siguientes agentes de esterilización: yodo povidona y 70% de etanol. Después de que el área esté completamente seco, aplicar paños estériles.
2. Pre-capa de la jeringa 10 ml con 100 U / ml de heparina por lavado con 3 - 4 ml de heparina antes de ejecting el agente anti-coagulante.
   Nota: Realice este paso para evitar la coagulación en la jeringa durante la aspiración de médula ósea.
3. Extracto de un mínimo de 5 ml de médula ósea de la cresta ilíaca del hueso de la minipig bajo anestesia, utilizando un extractor de médula ósea (3,0 × 100 mm) firmemente unido a la jeringa 10 ml de heparina pre-revestido.

5. Aislamiento de células extraídas de la médula ósea y cultivo in vitro

1. Aislar las células de la médula ósea extraída.
   1. Diluir la médula ósea se extrajo con un volumen igual de DPBS en un tubo cónico de 15 ml a temperatura ambiente.
   2. Añadir 3 ml de medio de centrifugación de densidad (Ficoll-Paque) al tubo cónico de 15 ml.
   3. Diluir una capa de 4 ml de la médula ósea con DPBS, que se coloca en el soporte de centrifugación de densidad sin mezclar y centrifugar al 400 × g durante 40 min a temperatura ambiente.
   4. Cosecha de la capa de células mononucleares(MNC) de la capa leucocitaria entre las dos capas que contienen el plasma (capa superior) y los medios de centrifugación de densidad (capa inferior), y transferir las multinacionales en un tubo cónico de 15 ml.
   5. Diluir las multinacionales transferidos con 7 - 8 ml de DPBS y centrifúguelas a 500 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y lavar las células dos veces con DPBS.
   6. Suspender el sedimento de células en 2 ml de ADMEM y transferirla a una placa de cultivo de tejidos de 35 mm. Incubar la placa de cultivo a 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO _2.
2. El cultivo in vitro de células aisladas de la médula ósea.
   1. Después de 48 hr, aspirar el medio con las células que no se han adherido a la placa, y reemplazar 2 ml de la ADMEM e incubar al 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO _2. Cambiar el medio cada tres días.
   2. En 70 a 80% de confluencia, se lavan las células con DPBS, disociar con 1 ml de 0,25%tripsina / EDTA, y incubarlos a 37 ° C durante 3 - 5 min hasta que las células se separan.
   3. Recoger las células utilizando 10 ml de ADMEM, transferirlos en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar ellos en 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante.
   4. Suspender las células recogidas en 1 ml de ADMEM fresco y contarlos utilizando un hemocitómetro.
   5. Colocar las células en un 5 a 7,5 x 10 ⁵ / 25T matraz que contiene 4 ml de ADMEM y incubarlos a 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO _2. Cambiar el medio cada tres días.

6. Recogida de líquido sinovial de los cerdos enanos

1. Al igual que en el procedimiento de aspiración de médula ósea, seleccionar un área adecuada de aproximadamente 15 x 10 cm (longitud / anchura) sobre la articulación del fémur, y quitar el pelo usando maquinillas de afeitar esterilizadas o una maquinilla eléctrica, siga por procedimientos de sanitización (paso 4.1).
2. Inserte una jeringa de 3 ml con un 23 Gaguja en la articulación después de los puntos de referencia (palpación de la cresta de la rótula y la tibia).
   1. Aplicar succión suave a las jeringas para la aspiración de líquido sinovial en la articulación. El volumen aproximado de líquido sinovial extraída de un conjunto es de 0,5 - 1 ml, pero esto varía de acuerdo con el tamaño de la minipig o la articulación. Enjuague a través de DPBS en la cavidad sinovial si el volumen recogido de líquido sinovial es demasiado pequeño.
   2. Inmediatamente retirar la jeringa para evitar la contaminación con sangre.

7. aislamiento de células del líquido sinovial y recogió el cultivo in vitro

1. Aislar las células del líquido sinovial aspirado.
   1. Diluir el líquido sinovial de aspiración con un volumen igual de DPBS en un tubo cónico de 15 ml a temperatura ambiente.
   2. Para eliminar los desechos, se filtra el líquido sinovial diluida usando un filtro de células de nylon de 40 micras.
   3. Añadir 10 ml de DPBS al tubo que contiene el filtrado sinovialfluido y centrifugar al 400 × g durante 10 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y lavar las células dos veces con DPBS.
   4. Suspender el sedimento de células en 2 ml de ADMEM, colocar las células en un 2 - placa de cultivo tisular 3 x 10 ⁵ células / 35 mm con 2 ml de ADMEM, y incubarlos a 38,5 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO ₂ .
2. Repita el paso 5.2 para el cultivo in vitro de las MSC de líquido derivado sinoviales aisladas.

8. Después del procedimiento de los cerdos enanos

1. Si es necesario, cerrar la piel en el sitio de la inyección extractor de médula ósea con una sola sutura con una grapadora de piel, después de la extracción de la médula ósea.
2. Después de que se completa el procedimiento, administrar una inyección intramuscular de enrofloxacina (5 mg / kg) y meloxicam (0,2 mg / kg) a los cerdos enanos una vez al día durante 3 días.
3. Después de que se completa el procedimiento, la desinfección de la médula ósea y el sitio de recogida de fluido sinovialcon 0,1% de yodo povidona una vez al día durante 3 días. Observe cuidadosamente a diario para vigilar los signos de complicaciones (por ejemplo, hinchazón, pus o enrojecimiento).

9. Fenotipificación celular mediante citometría de flujo

1. Cuando las MSCs son 70 a 80% de confluencia en pasajes 3 - 5, se lavan las células con DPBS y tratarlos con 1 ml de 0,25% (v / v) de tripsina / EDTA. A continuación, los incuban a 37 ° C durante 3 - 5 min hasta que se separan las células.
2. Recoger las células utilizando 10 ml de DPBS, transferirlos en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar ellos en 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Desechar la solución sobrenadante.
3. Para fijar las células, suspender el sedimento celular en 10 ml de una solución de formaldehído al 3,7% y mantenerlos a 4 ° C durante un día antes del análisis.
   1. Un día después de la fijación, se lavan las células con DPBS dos veces con centrifugación a 300 xg durante 5 min cada vez. Desechar la solución sobrenadante.
   2. Suspender el sedimento de células en 4 mlde DPBS, que se complementa con 1% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA), e incubar el sedimento durante 1 hora a 4 ° C para bloquear interacciones no específicas Fc mediada.
   3. Distribuir partes alícuotas de 500 l de la suspensión celular en tubos de 1,5 ml.
   4. Para los anticuerpos no conjugados (CD29 y vimentina), se lavan las células por centrifugación a 300 xg durante 3 min. Desechar la solución sobrenadante.
   5. Suspender el sedimento de células en 500 l de una dilución 1: 100 del anticuerpo primario y se incuba durante 1 hora a 4 ° C.
   6. Lavar las células dos veces con 1% de albúmina de suero bovino por centrifugación a 300 xg durante 5 min cada vez. Desechar la solución sobrenadante.
   7. Suspender el sedimento de células en 500 l de una dilución 1: 100 de la isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anticuerpo secundario e incubar durante 1 h en la oscuridad a 4 ° C.
4. Para los anticuerpos conjugados con FITC (isotipo, CD34, CD44 y CD45), se lavan las células por centrifugación a 300 × g durante 3 min. Desechar la solución sobrenadante.
   1. Suspender el sedimento celular en 500 l de la 1: 100 de anticuerpo conjugado con FITC y se incuba durante 1 hora en la oscuridad a 4 ° C.
   2. Por tanto en condiciones de tinción, se lavan las células dos veces con DPBS por centrifugación a 300 xg durante 5 min cada vez. Desechar la solución sobrenadante.
   3. Suspender las células en 500 l de DPBS, transferirlos a un tubo de 5 ml de fondo redondo, y analizar los resultados utilizando un citómetro de flujo ^8.

Resultados

Establecimiento de las MSC derivadas de la médula ósea y de líquido sinovial de los cerdos enanos

MSCs se aislaron con éxito de la médula ósea y de las articulaciones sinoviales articulares de los cerdos enanos y se expandieron in vitro (Figura 2). Jeringa de aspiración de líquido sinovial es simple, y es posible obtener suficientes células adherentes durante el cultivo in vitro

Discusión

Cerdos enanos se utilizaron para establecer el aislamiento MSC de la médula ósea y el líquido sinovial. Para eliminar diversas condiciones fisiológicas, tales como la edad, el género, y la enfermedad, cerdos enanos de donantes fondo isogénicas se eligieron para evaluar con precisión la caracterización dependiente fuente de células. Los cerdos son conocidos por ser anatómicamente, fisiológicamente, y genéticamente similares a los humanos y, en particular, cerdos enanos pueden producir órganos tamaño emparejados; por lo t...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dulbecco avanzado' s medio Eagle modificado (ADMEM)	Gibco	12491-023	MSC medio de cultivo
Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)	Gibco	14190-144	Medio de lavado celular, libre de Ca2+/Mg2+
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	16000-044	Componente del medio MSCs
Glutamax	Gibco	35050-061	Componente del medio MSCs
Penicilina/estreptomicina	Gibco	10378-016	Componente del medio MSCs
Factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF)	Simga	F0291	Componente del medio MSCs
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma	A6003	Componente del medio MSCs
Tripsina-EDTA	Gibco	25200-072	Reactivo de disociación celular
β-mercaptoetanol	Sigma	M7522	Componente del medio MSCs
Anticuerpo de isotipo	BD Pharmingen	BD 550616	Control de isotipo
Anticuerpos CD29	BD Pharmingen	BD 552369	Integrina beta-1 Marcador de MSCs Marcador
CD44	BD Pharmingen	BD 553133	Glicoproteína de superficie celular Marcador de MSCs
Anticuerpo CD45	BD Pharmingen	BD 340664	Marcador de células madre hematopoyéticas Anticuerpos
CD34	BD Pharmingen	BD 555821	Marcador de células madre hematopoyéticas
Anticuerpos CD90	BD Pharmingen	BD 555595 Thy-1	glicoproteína de membrana Marcador de MSCs
MHC Anticuerpo MHC Clase II	Santa Cruz	SC-32247 Marcador de	células presentadoras de antígenos
Anticuerpo Vimentina	Sigma Sigma-S6389		Filamento intermedio tipo III Marcador MSCs
Fosfatasa alcalina	Promega	S3841	Mezcla de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) y tetrazolio azul nitro (NBT)
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Centrifugación en gradiente de densidad Filtro
células	BD Falcon	352340	40 µ m Filtro de células de nailon
tubo cónico de poliestireno de 15 ml	BD Falcon		351095 Recogida de muestras y aislamiento celular
Placas de 35 mm	Nunc	153066	Placa de cultivo celular
Extractor de médula ósea	GmbH Medizintechnologie, Alemania	1145-1W010	TrokaBone, 3,0 x 100 mm
Cámara de hematocrito	Marinfeld	640130	Cámara
Atropina	Jeil Pharmaceutical Co, Corea		Sulfato de atropina
Hidrato de acepromazina	Samu Median, Corea		Fármaco sedante y antiemético preanestésico
Medetomidina	Pfizer		Fármaco anestésico y analgésico
Enrofloxacina	Bayer Healthcare, Alemania		Antibióticos
Meloxicam	Sobre Medicina Veterinaria, Argentina		Medicamento antiinflamatorio y analgésico
Isoflurano	Hana pharm, Corea		Anestesia inhalatoria
Povidona yodado	Korea Pharma, Corea		Agente de esterilización
Etanol	Sigma	E7023	Agente de esterilización
Heparina	Sigma	H3393	Agente anticoagulante
Formaldehído	Sigma	F8775	Agente de fijación celular
Pomada oftalmológica	Pfizer		Oxitetraciclina HCl con sulfato de polimixina B
Manta de agua circulante	Industrias		Sistema de calentamiento durante y después de la anestesia
Grapadora de piel	Covidien, EE. UU.		Cierre de la piel
con sutura CO2 Incubadora	Thermo Forma	3111	Equipo de cultivo celular
Citómetro de flujo	BD Biosciences		Analizador de células
Minipig	PWG Genetics Korea, Ltd.	Cerdo miniatura	tipo T