En este protocolo, se presentan los procedimientos para establecer modelos de distrofia miotónica de mioblastos 1, incluyendo el mantenimiento optimizado C2C12 celular, transfección de genes / transducción, y la diferenciación de los miocitos.
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Artículo de método
Modelado de la distrofia miotónica 1 en las células C2C12 mioblastos
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La distrofia miotónica 1 (DM1) es una forma común de distrofia muscular. Aunque se han establecido varios modelos animales para DM1, modelos celulares de mioblastos son todavía importantes debido a que ofrecen una alternativa eficiente celular para el estudio de eventos celulares y moleculares. Aunque las células de mioblastos C2C12 se han utilizado ampliamente para estudiar la miogénesis, resistencia a la transfección de genes, o transducción viral, obstaculiza la investigación en las células C2C12. A continuación, describimos un protocolo optimizado que incluye procedimientos de mantenimiento diario, transfección y transducción para introducir genes en mioblastos C2C12 y la inducción de la diferenciación de los miocitos. Colectivamente, estos procedimientos permiten mejores eficacias de transfección / transducción, así como los resultados de diferenciación consistentes. El protocolo descrito en el establecimiento de modelos celulares de mioblastos DM1 beneficiaría al estudio de la distrofia miotónica, así como otras enfermedades musculares.
Introducción
La distrofia miotónica (DM) es una enfermedad autosómica dominante que afecta a múltiples sistemas, más notablemente los músculos cardíaco y esquelético 1. Hay dos subtipos de esta enfermedad, DM1 y DM2. DM1 es más común y tiene una manifestación más grave que DM2 2. La mutación genética subyacente DM1 es una expansión de repeticiones de tripletes CUG ubicadas en la región no traducida 3 '(UTR) del gen de la proteína quinasa DM (DMPK) 3. El número de repetición CUG en individuos no afectados varía de 5 a 37. Por el contrario, aumenta a más de 50, y a veces hasta miles de personas en los pacientes con DM1 4. Como resulta....
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Protocolo
1. Cultivo de células C2C12
- Mantener C2C12 mioblastos de ratón en una placa de 100 mm en medio de crecimiento (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)) suplementado con suero bovino fetal 20%, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina. Permitir que las células a pases C2C12 se conviertan en aproximadamente 50 - 60% de confluencia.
- Descartar el medio de cultivo y lavar las células C2C12 con solución salina tamponada con fosfato 3 ml temperatura ambiente (PBS). Retire el PBS y añadir 500 l 0,25% de tripsina-EDTA para desprender las células. Colocar la placa en un 37 ° C, 5% de CO2 durante 3 - 5 min....
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Resultados
C2C12 células fueron transfectadas con GFP-CUG5 o GFP-CUG200. Después de la selección de resistencia a fármacos, se establecieron piscinas estables, que puede ser visualizado por la expresión de GFP (Figura 1A). Formación de miotubos en los mioblastos diferenciadas fue detectado por la cadena pesada de la miosina inmunotinción 10 (Figura 1B). La cuantificación de la formación de miotubos demostró que los índices de fusión se redujeron de 35,4 .......
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Discusión
Línea celular C2C12 se ha utilizado como un modelo para estudiar la miogénesis 11-14. Estas células conservan un aspecto similar a fibroblastos, proliferan rápidamente en medios que contienen suero bovino fetal 20% y fácilmente diferencian en medios que contienen 2% de suero equino 15. El rápido crecimiento y la diferenciación son características ventajosas en un modelo celular miogénesis. Aquí, se demuestra el uso de plásmido, retroviral, y vectores lentivirales para introducir ADNc, 3'-UTR, y.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a los Dres. Tom Cooper del Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan de la Universidad de Wisconsin-Madison y Didier Trono de la Universidad de Ginebra por los reactivos. Este trabajo cuenta con el apoyo de un fondo inicial (YL) de la Universidad de Houston, una subvención de la Asociación Americana del Corazón (YL, 11SDG5260033) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (XP, 81460047).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM, alta glucosa | Life Technologies | 11965-084 | para medio de cultivo |
| Suero fetal bovino - Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | para medio de cultivo |
| Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100x) | Life Technologies | 10378-016 | para medio |
| de cultivo Insulina de páncreas bovino | Sigma Aldrich | I6634-100MG | para medio de diferenciación |
| suero equino | Atlanta Biologicals | S12150 | para medio de diferenciación |
| FuGENE Reactivo de transfección HD | Promega | E2311 | para transfección |
| Sulfato G418 | Biotecnología del Oro | G-418-10 | para la selección |
| Dihidrocloruro de puromicina | Sigma Aldrich | sc-108071 | para la selección de resistencia a los medicamentos |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Gel de proteína Bis-Tris, 1,0 mm, 15 pocillos | Life Technologies | NP0323BOX | para Western blot |
| Tampón de transferencia NuPAGE (20x) | Life Technologies | NP00061 | para Western blot |
| Búfer de ejecución NuPAGE MES SDS (20x) | Life Technologies | NP0002 | para Western blot |
| Amersham Protran soportado 0,2 NC, 300 mm x 4 m | GE healthcare life science | 10600015 | para western blot |
| MF 20 | Banco de hibridomas | del desarrollo MF 20 | primario MF 20 para inmunotinción |
| anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra, conjugado Texas Red-X | Thermo Fisher Scientific | T-862 | secundario Ab para inmunotinción |
| Un paso qRT-PCR MasterMix | AnaSpec | 05-QPRT-032X | para qRT-PCR |
| Reactivo de aislamiento TriPure | Roche | 11667165001 | para el aislamiento de ARN |
| CUG-BP1 Anticuerpo (3B1) | santa cruz | sc-20003 | primario Ab western blot |
| Anticuerpo de actina | santa cruz | sc-1615 | de cabra IgG policlonal para el control de carga |
| 293T Ecopack | de 631507 | Clontech | para la preparación de retrovirus |
| pMSCV-puro | Clontech | 634401 | vector retroviral vacío para la preparación de retrovirus |
| pMSCV-Celf1Flag-puro | casa | no disponible | vector retroviral que codifica Celf1Flag, utilizado en la preparación de retrovirus |
| psPAX2 | regalo de Didier Trono | no disponible | para la preparación de lentivirus |
| Regalo pMD2.G | de Didier Trono | no disponible | para la preparación de lentivirus |
| Regalo GFP-CUG5 | de M.S. Mahadevan | no disponible | detalles en la referencia 10 |
| GFP- CUG200 | regalo de M.S. Mahadevan | no disponible | detalles en la referencia 10 |
| Tritón X-100 | Sigma Aldrich | X100 | para inmunotinción |
| con paraformaldehído | Sigma Aldrich | P6148 | para inmunotinción |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P9416 | para inmunotinción |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | para inmunotinción |
Referencias
- Harper, P. S. Myotonic dystrophy. 3rd edn. , W. B. Saunders. (2001).
- Timchenko, L. Molecular mechanisms of muscle atrophy in myotonic dystrophies. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2280-2287 (2013).
- Brook, J. D., et al.
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Reimpresiones y permisos
