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Artículo de método

Modelado de la distrofia miotónica 1 en las células C2C12 mioblastos

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DOI:

10.3791/54078

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29 de julio de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston, 2Department of Economics, University of Houston, 3Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Nanchang University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este protocolo, se presentan los procedimientos para establecer modelos de distrofia miotónica de mioblastos 1, incluyendo el mantenimiento optimizado C2C12 celular, transfección de genes / transducción, y la diferenciación de los miocitos.

Resumen

La distrofia miotónica 1 (DM1) es una forma común de distrofia muscular. Aunque se han establecido varios modelos animales para DM1, modelos celulares de mioblastos son todavía importantes debido a que ofrecen una alternativa eficiente celular para el estudio de eventos celulares y moleculares. Aunque las células de mioblastos C2C12 se han utilizado ampliamente para estudiar la miogénesis, resistencia a la transfección de genes, o transducción viral, obstaculiza la investigación en las células C2C12. A continuación, describimos un protocolo optimizado que incluye procedimientos de mantenimiento diario, transfección y transducción para introducir genes en mioblastos C2C12 y la inducción de la diferenciación de los miocitos. Colectivamente, estos procedimientos permiten mejores eficacias de transfección / transducción, así como los resultados de diferenciación consistentes. El protocolo descrito en el establecimiento de modelos celulares de mioblastos DM1 beneficiaría al estudio de la distrofia miotónica, así como otras enfermedades musculares.

Introducción

La distrofia miotónica (DM) es una enfermedad autosómica dominante que afecta a múltiples sistemas, más notablemente los músculos cardíaco y esquelético 1. Hay dos subtipos de esta enfermedad, DM1 y DM2. DM1 es más común y tiene una manifestación más grave que DM2 2. La mutación genética subyacente DM1 es una expansión de repeticiones de tripletes CUG ubicadas en la región no traducida 3 '(UTR) del gen de la proteína quinasa DM (DMPK) 3. El número de repetición CUG en individuos no afectados varía de 5 a 37. Por el contrario, aumenta a más de 50, y a veces hasta miles de personas en los pacientes con DM1 4. Como resultado, las proteínas de unión a ARN, como muscleblind tipo 1 (MBNL1), CUGBP, y Elav-1 como de la familia (Celf1), son misregulated. Debido a la secuestro en las repeticiones CUG expandido, MBNL1 pierde su capacidad para regular splicing alternativo 5. Celf1, por el contrario, está regulado hasta 6,7. La sobreexpresión de Celf1 se asocia con la pérdida de músculoy debilidad, que no se atribuye a la pérdida de la función MBNL1. Los modelos animales que simulan alteraciones relacionadas-DM1, incluyendo DMPK 3'-UTR de expansión CUG, pérdida de MBNL1, y la sobreexpresión de Celf1, se han establecido. Sin embargo, el modelado de la DM1 en mioblastos ofrece una alternativa eficiente, especialmente para la disección de eventos celulares y moleculares relacionados con DM1.

C2C12 línea celular de mioblastos fue aislado por primera vez a partir de músculo de ratón C3H heridos y ampliamente utilizado para estudiar la diferenciación miogénica 8,9. células C2C12 proliferan rápidamente en el suero bovino fetal (FBS) que contienen los medios de comunicación y fácilmente experimentan diferenciación cuando se agote el FBS. Sin embargo, el uso de este modelo de diferenciación de mioblastos presenta dos retos: las células C2C12 son a menudo resistente a la transfección de genes / transducción viral; y ligeras variaciones en el manejo celular y la diferenciación procedimiento pueden conducir a cambios marcados en la formación de miotubos.

Nuestro laboratorio utiliza rutinariamente mioblastos C2C12 como acell modelo y ha desarrollado protocolos que transmitan efectivamente los genes de plásmido transfección, transducción retroviral, y la transducción lentiviral en la línea celular C2C12 10. En el video, que demuestran los procedimientos optimizados para la transfección / transducción de células C2C12 y el mantenimiento de la coherencia de diferenciación en el establecimiento de modelos de mioblastos DM1.

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Protocolo

1. Cultivo de células C2C12

  1. Mantener C2C12 mioblastos de ratón en una placa de 100 mm en medio de crecimiento (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)) suplementado con suero bovino fetal 20%, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina. Permitir que las células a pases C2C12 se conviertan en aproximadamente 50 - 60% de confluencia.
  2. Descartar el medio de cultivo y lavar las células C2C12 con solución salina tamponada con fosfato 3 ml temperatura ambiente (PBS). Retire el PBS y añadir 500 l 0,25% de tripsina-EDTA para desprender las células. Colocar la placa en un 37 ° C, 5% de CO2 durante 3 - 5 min.
  3. Neutralizar la tripsina mediante la adición de 3 ml de medio de crecimiento. Pipetear 6 - 8 veces para suspender las células. Añadir 1 ml de células en suspensión a una nueva placa 100 mm y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2.

2. C2C12 Cell transfección / transducción y selección

  1. C2C12 plásmido transfección
    1. 24 h antes de la transfección, pfinales de 7,0 x 10 5 C2C12 células en un pocillo de una placa de seis pocillos para cada transfección.
      Nota: Esto lleva a 50 - 60% de confluencia en el momento de la transfección.
    2. Permitir que el reactivo de transfección a la temperatura ambiente antes de su uso.
    3. Añadir 2 g de ADN plásmido (GFP-CUG5 o GFP-CUG200) en 200 l pre-calentado medio libre de suero y de vórtice brevemente. Añadir el reactivo de transfección 6 l al medio y mezclar inmediatamente durante 30 segundos usando un vórtice. Incubar la mezcla durante 30 min a temperatura ambiente.
    4. Cambiar el medio de células C2C12 a 2,5 ml de medio de crecimiento libre de suero. Añadir la mezcla de transfección a las células después de la incubación. Volver las placas a un 5% de CO 2, 37 ° C incubadora.
    5. Mantener las células en la mezcla de transfección el medio de crecimiento / libre de suero durante 4 horas o hasta durante la noche. Cambio de medio de nuevo a los medios de cultivo al día siguiente o cuando la citotoxicidad es evidente.
      Nota: La citotoxicidad se evaluó mediante la inspección microscópica de la ceLLS. Observar los cambios en la morfología celular y la retirada de las células. Mientras no hay citotoxicidad manifiesta, incubación durante la noche en medio de crecimiento libre de suero aumenta la transfección.
    6. Seleccionar las células 48 horas después de la transfección mediante la adición de 01.02 a 01.06 mg / ml de G418 durante unos 10 días hasta que el cultivo de control (sin transfectadas los plásmidos) no tiene células vivas. Cambiar el soporte de cada dos días con medio de cultivo suplementado con G418.
    7. Mantener las células resistentes a G418 en medio de crecimiento y 5% de CO2 a 37 ° C para los experimentos posteriores.
  2. preparación de retrovirus y C2C12 transducción retroviral
    1. Preparar HEK 293 medio de cultivo por DMEM que complementa alta glucosa con 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina.
      1. Aproximadamente 24 horas antes de la transfección, la placa de 4,0 x 10 células HEK 293 de embalaje a base de 6 ecotropic en una placa de 100 mm (confluencia del 80% en la transfección) cmedio de cultivo celular ontaining.
    2. Permitir que el reactivo de transfección a la temperatura ambiente antes de su uso.
    3. Mezclar 15 g de ADN plásmido (pMSCV-Puro o pMSCV-Celf1Flag-Puro) en 1 ml de medio de crecimiento libre de suero. brevemente Vortex. Añadir 30 l reactivo de transfección de la etapa 2.2.2 en el tubo de medio de crecimiento de ADN / libre de suero, y se mezcla bien con vórtice. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min.
    4. Añadir transfección mezcla gota a gota a las células de empaquetamiento ecotrópico HEK 293 basados ​​en. Hacer girar suavemente las placas y devolverlos de nuevo al 5% de CO2, a 37ºC. Después de 24 horas, cambiar el soporte de medio de cultivo fresco 10 ml previamente calentada.
    5. Se recoge el sobrenadante (que contiene retrovirus) 48 h después de la transfección usando una pipeta y transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 50 ml. Añadir 10 ml de nuevos medios cálidos a la placa y devolverlo a la incubadora. Mantenga el sobrenadante a 4 ° C.
      Nota: Los medios de comunicación se añade suavemente a tél lado del pozo a fin de no perturbar la monocapa de células.
    6. Se recoge el segundo lote de sobrenadante 60 horas después de la transfección y mezclarla con el sobrenadante de 2.2.5. Centrifugar a 500 xg, 4 ° C durante 7 min para eliminar restos celulares.
    7. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Utilice retrovirus para transducir células C2C12 en este punto por continuar con el paso 2.2.9 o alícuota y almacenar el sobrenadante a -20 ° C para uso futuro.
    8. Descongelar el retrovirus de 2.2.7 a temperatura ambiente, si se usa una solución madre congelada aquí.
      Nota: Evite múltiples ciclos de congelación-descongelación.
    9. Placa células C2C12 en el mismo día de la transducción con el objetivo de 30 - 40% de confluencia.
      1. Descartar el medio de cultivo y lavar las células C2C12 con 3 ml de PBS temperatura ambiente. Retire la PBS, añadir 500 l 0,25% de tripsina-EDTA, e incubar la placa en un 37 ° C, 5% de CO2 durante 3 - 5 min.
      2. Neutralizar la tripsina mediante la adición de 3 ml med crecimientoio. Pipetear 6 - 8 veces para suspender las células. Recuento de células utilizando un hemocitómetro y añadir 8,0 x 10 5 células C2C12 a una placa de 60 mm.
    10. Añadir 0,5 ml de retrovirus para infectar una placa de 60 mm de células en 3 ml de medio de crecimiento. Devolver la placa a la incubadora.
    11. Reemplazar con 3 ml de medio fresco suplementado con antibiótico de selección (puromicina 1-3 g / ml) 48 h después de la infección. Reemplazar 3 ml de medio con antibióticos para todos los días a 5 días hasta que el cultivo de control C2C12 transducido se extingue.
  3. preparación lentivirus y C2C12 transducción lentiviral
    Nota: Realizar todos los procedimientos relacionados con lentivirus de Bioseguridad Nivel 2 del gabinete y seguir las directrices de seguridad biológica. Los residuos líquidos que contiene el virus debe ser desinfectada antes de su eliminación.
    1. Placa 4.0 x 10 6 células 293T en una placa de 100 mm (~ 80% de confluencia en el día de la transfección) con HEK 293 medio de cultivo celular (DMEM alto contenido en glucosa, suplementado con 10% fetalde suero bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina) 24 h antes de la transfección.
    2. Calentar el reactivo de transfección a temperatura ambiente. Mezclar los vectores de empaquetamiento lentiviral (4 g pMD2.G y 6 g psPAX2) junto con vector de transferencia lentiviral 8 g (Celf1 shRNA o revueltos de control shRNA) en 1 ml de medio de cultivo celular libre de suero. brevemente Vortex.
    3. Añadir 36 l de reactivo de transfección pre-calentado en el tubo de ADN / DMEM y se mezcla bien por vórtice. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min.
    4. Retire las células 293T de la incubadora y añadir la mezcla de transfección a la placa. Hacer girar suavemente la placa y volver de nuevo a 5% de CO2, a 37ºC. Después de 24 hr, reemplace la mezcla de transfección con 10 ml de medio de cultivo fresco.
    5. Recoger el sobrenadante que contiene lentivirus 48 hr después de la transfección y la transfiere en un tubo de centrífuga de 50 ml. Añadir 10 ml nuevos medios cálidos a la placa y volverlaa la incubadora. Almacenar el sobrenadante a 4 ° C.
    6. Recoger el sobrenadante segundo lote de 60 horas después de la transfección y combinarlo con el sobrenadante de 2.3.5. brevemente centrifugar a 500 xg, 4 ° C durante 7 minutos.
    7. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml. Si se utiliza el virus fresca, continúe en el paso 2.3.9. Para uso futuro, tienda de virus que contienen sobrenadante a -20 ° C en alícuotas de 10 ml.
    8. Descongelar el virus de 2.3.7 a temperatura ambiente antes de su uso, si se usa una solución madre congelada.
      Nota: Evite múltiples ciclos de congelación-descongelación.
    9. células de la placa C2C12-CUG200 (obtenido en la Sección 2.1) como se describe en 2.2.9 en el mismo día de la transducción.
      Nota: Trate de 30 - 40% de confluencia.
    10. Añadir 0,5 ml de virus para infectar una placa de 60 mm de C2C12-CUG200 y devolver la placa a la incubadora.
    11. Sustituir el medio de cultivo con medio fresco suplementado con el antibiótico de selección (puromicina 1-3 g / ml) 72 horas después de la transducción.Refrescar los medios de cultivo todos los días con el antibiótico de selección para ~ 5 días hasta que todo el cultivo de control C2C12-CUG200 transducido se extingue.
    12. Utilice Western blot para verificar caída Celf1 en las células transfectadas GFP-CUG200.

3. Diferenciación celular C2C12

  1. Plate 2 x 10 6 células en un pocillo de una placa de 6 pocillos en 2,5 ml de medio de crecimiento 24 horas antes de la iniciación de la diferenciación.
    Nota: La densidad de placas se puede ajustar de modo que la confluencia completa se alcanza en 24 hr.
    1. Enjuagar las células confluentes con PBS y añadir 2,5 ml de medio de diferenciación bajo en suero (medio modificado de Eagle suplementado con suero equino al 2%, 100 U / ml de penicilina de Dulbecco, 100 mg / ml de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, y 1 mM de insulina) . Reemplazar el medio cada dos días.
      Nota: guardar la acción de la insulina congelada y añadirlo a los medios de comunicación en cada cambio de medio.
  2. Durante la diferenciación de C2C12, recoger muestras para quancuanti- RT-PCR (ver sección 4) en los siguientes puntos de tiempo: Day0, 1, 2, 4 y 6. Proceso de la cultura para la inmunotinción en el día 6 - 8 (véase la sección 5).

4. Aislamiento de ARN y RT-PCR cuantitativa

  1. Utilice el protocolo del fabricante para el aislamiento de ARN. Después del aislamiento, resuspender el pellet de ARN en 30 l de agua libre de RNasa y pipetear arriba y abajo varias veces.
    Nota: Las muestras pueden proceder a RT-PCR cuantitativa o pueden ser almacenadas a -80 ° C.
  2. Utilice un kit de RT PCR cuantitativa para la RT-PCR cuantitativa 10 y siga las instrucciones del fabricante. Preparar la mezcla de reacción de acuerdo con la Tabla 1.
Componente Volumen (l) concentración final
tampón de reacción 2x 10 1x
cebador directo 0,5 200 nM
cebador inverso 0,5 200 nM
Sonda 0,5 200 nM
La transcriptasa reversa y RNasa Inhibidor 0,1 0,25 U / ml
Modelo 1 100 ng de ARN total
RNasa libre de agua 7.4 N / A
mezcla total 20

Tabla 1. Quantitative RT-PCR Master Mix Preparación

  1. Ejecutar un 20 l de reacción RT-qPCR utilizando perfil térmico Tabla 2.
paso de transcripción inversa 30 min, 48 ° C
polímero de ADNactivación ase / inactivación de la transcriptasa inversa 10 min, 95 ° C
40 ciclos 15 seg, 95 ° C
1 min, 60 ° C

Tabla perfil térmico 2. RT-PCR cuantitativa

5. La inmunotinción

  1. Fijar el cultivo en monocapa en 2,5 ml recién preparada de paraformaldehído al 4% / PBS a temperatura ambiente durante 10 min.
  2. Permeabilizar las muestras en 2,5 ml 0,1% de Triton X-100 / PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
  3. Transferir las muestras a una cámara humidificada. Bloquear las muestras en 2,5 ml de tampón (tensioactivo no iónico 0,1% / PBS, 10% de suero normal de cabra) de bloqueo durante 30 min a 37 ° C.
  4. Desechar el tampón de bloqueo y aplicar 800 l de anticuerpo primario contra la miosina de cadena pesada diluido en tampón de bloqueo (1: 100). Incubar durante la noche en una cámara humidificada a temperatura ambiente.
  5. Lavar la placa 3 timES (10 min cada una) con 2,5 ml de tampón de lavado (0,1% de polisorbato 20 / PBS) el día 2.
  6. Eliminar el tampón de lavado y aplicar anticuerpo secundario 800 l (de cabra anti-IgG de ratón, 1: 500 diluido en PBS). Incubar en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 1 hr.
  7. Lavado dos veces (10 min cada una) con tampón de lavado de 2,5 ml.
  8. Incubar con 800 l DAPI (1 g / ml, diluido en agua destilada desionizada H 2 O) durante 5 min.
  9. Se lava con 2,5 ml de tampón de lavado de nuevo durante 10 minutos.
  10. Cambiar el tampón de lavado a 2,5 ml de PBS y el uso de un microscopio de fluorescencia para capturar imágenes.

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Resultados

C2C12 células fueron transfectadas con GFP-CUG5 o GFP-CUG200. Después de la selección de resistencia a fármacos, se establecieron piscinas estables, que puede ser visualizado por la expresión de GFP (Figura 1A). Formación de miotubos en los mioblastos diferenciadas fue detectado por la cadena pesada de la miosina inmunotinción 10 (Figura 1B). La cuantificación de la formación de miotubos demostró que los índices de fusión se redujeron de 35,4 ...

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Discusión

Línea celular C2C12 se ha utilizado como un modelo para estudiar la miogénesis 11-14. Estas células conservan un aspecto similar a fibroblastos, proliferan rápidamente en medios que contienen suero bovino fetal 20% y fácilmente diferencian en medios que contienen 2% de suero equino 15. El rápido crecimiento y la diferenciación son características ventajosas en un modelo celular miogénesis. Aquí, se demuestra el uso de plásmido, retroviral, y vectores lentivirales para introducir ADNc, 3'-UTR, y...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a los Dres. Tom Cooper del Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan de la Universidad de Wisconsin-Madison y Didier Trono de la Universidad de Ginebra por los reactivos. Este trabajo cuenta con el apoyo de un fondo inicial (YL) de la Universidad de Houston, una subvención de la Asociación Americana del Corazón (YL, 11SDG5260033) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (XP, 81460047).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM, alta glucosaLife Technologies11965-084para medio de cultivo
Suero fetal bovino - PremiumAtlanta BiologicalsS11150para medio de cultivo
Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100x)Life Technologies10378-016para medio
de cultivo Insulina de páncreas bovinoSigma AldrichI6634-100MGpara medio de diferenciación
suero equinoAtlanta BiologicalsS12150para medio de diferenciación
FuGENE  Reactivo de transfección HDPromegaE2311 para transfección
Sulfato G418  Biotecnología del Oro G-418-10para la selección
Dihidrocloruro de puromicinaSigma Aldrichsc-108071para la selección de resistencia a los medicamentos
NuPAGE Novex 4 - 12% Gel de proteína Bis-Tris, 1,0 mm, 15 pocillosLife TechnologiesNP0323BOXpara Western blot
Tampón de transferencia NuPAGE (20x)Life TechnologiesNP00061para Western blot
Búfer de ejecución NuPAGE MES SDS (20x)Life TechnologiesNP0002para Western blot
Amersham Protran soportado 0,2 NC, 300 mm x 4 mGE healthcare life science10600015para western blot
MF 20Banco de hibridomasdel desarrollo MF 20primario MF 20 para inmunotinción
anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra, conjugado Texas Red-XThermo Fisher ScientificT-862secundario Ab para inmunotinción
Un paso qRT-PCR MasterMixAnaSpec05-QPRT-032Xpara qRT-PCR
Reactivo de aislamiento TriPureRoche11667165001para el aislamiento de ARN
CUG-BP1 Anticuerpo (3B1)santa cruzsc-20003primario Ab western blot
Anticuerpo de actinasanta cruzsc-1615de cabra IgG policlonal para el control de carga
293T Ecopackde 631507Clontechpara la preparación de retrovirus
pMSCV-puroClontech634401vector retroviral vacío para la preparación de retrovirus
pMSCV-Celf1Flag-purocasano disponiblevector retroviral que codifica Celf1Flag, utilizado en la preparación de retrovirus
psPAX2regalo de Didier Tronono disponiblepara la preparación de lentivirus
Regalo pMD2.Gde Didier Tronono disponiblepara la preparación de lentivirus
Regalo GFP-CUG5de M.S. Mahadevanno disponibledetalles en la referencia 10 
GFP- CUG200regalo de M.S. Mahadevanno disponibledetalles en la referencia 10 
Tritón   X-100Sigma AldrichX100para inmunotinción
con paraformaldehídoSigma AldrichP6148para inmunotinción
TWEEN  20Sigma AldrichP9416para inmunotinción
DAPISigma AldrichD9542para inmunotinción
de resistencia a los medicamentos Ab Células construido en

Referencias

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