Anastasis es técnicamente difícil de detectar en vivo porque las células que se han invertido el proceso de muerte celular pueden ser morfológicamente indistinguibles de las células sanas normales. Aquí se describen los protocolos para la detección y seguimiento de las células que se someten a la anastasis en animales vivos mediante nuestro sistema de biosensor desarrollado recientemente en vivo CaspaseTracker.
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Artículo de método
Detección de Anastasis en Vivo por CaspaseTracker Biosensor
En este artículo
Resumen
Resumen
Anastasis (griego para "elevar a la vida") es un fenómeno de recuperación celular recientemente descubierto por el que mueren las células puede revertir procesos de muerte celular de fase que se asumen generalmente para ser intrínsecamente irreversible. Promoción de anastasis podría en principio rescate o preservación lesionado las células que son difíciles de reemplazar como cardiomiocitos o neuronas, facilitando la recuperación del tejido. Por el contrario, supresión de la anastasis en células de cáncer, que experimenta apoptosis después de terapias contra el cáncer, puede asegurar la muerte de la célula de cáncer y reducir las posibilidades de recurrencia. Sin embargo, estos estudios se han visto obstaculizados por la falta de herramientas para el seguimiento del destino de las células que experimentan la anastasis en animales vivos. El desafío es identificar las células que se han invertido el proceso de muerte celular a pesar de su aspecto morfológico normal después de la recuperación. Para superar esta dificultad, hemos desarrollado Drosophila y mamíferos CaspaseTracker sistemas de biosensores que pueden identificar y rastrear permanentemente anastática células in vitro o en vivo. Aquí, presentamos en vivo los protocolos para la generación y uso del sistema CaspaseTracker doble biosensor para detectar y rastrear anastasis en Drosophila melanogaster después de la exposición transitoria a los estímulos de la muerte de la célula. Si bien biosensores convencionales y protocolos pueden etiquetar las células activamente en la muerte celular apoptótica, el biosensor CaspaseTracker puede etiquetar permanentemente las células que se han recuperado después de la activación de la caspasa - un rasgo distintivo de la etapa tardía de apoptosis, y al mismo tiempo identificar procesos apoptóticos activo. Este biosensor también puede seguir la recuperación de las células que otras formas de muerte celular que directa o indirectamente afectadas actividad caspasa. Por lo tanto, este protocolo nos permite seguir continuamente el destino de estas células y su progenie, facilitar futuros estudios de las funciones biológicas, mecanismos moleculares, las consecuencias fisiológicas y patológicas e implicaciones terapéuticas de Anastasis. También discutimos los controles adecuados para distinguir las células que se someten a anastasis que mostrar no apoptótica caspasa actividad in vivo.
Introducción
Programan la muerte celular, como la apoptosis, juega un papel esencial en el desarrollo embrionario y la homeostasis normal al eliminar no deseadas, heridas o peligrosas células en organismos multicelulares1,2,3. La pérdida del equilibrio entre la muerte celular y la supervivencia puede conducir a consecuencias fatales como cáncer, insuficiencia cardíaca, autoinmunidad y degeneración4,5,6,7,8. Desencadena la activ....
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Protocolo
1) preparación del CaspaseTracker Biosensor vuela
- Anestesiar a moscas con CO2y utilizar un pincel para transferir hembras vírgenes de 7 a 10 caspase sensibles Gal4 (DQVD)19 y 7 a 10 G-Trace53 Gal4 reportero joven macho vuela (o viceversa) en la misma cubeta con mosca comida y pasta de levadura fresca.
Nota: Cruz de moscas Gal4 caspasa-sensible (DQVD) y G-Trace produce moscas de progenie de CaspaseTracker. Cruz de caspasa -ensensible (DQVA)19 Gal4 y moscas G rastro proporcionará control negativo vuela (ver discusión). Levadura fresca pasta sirve com....
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Resultados
Microscopía Celular en time-lapse es un método confiable para tracto anastasis en células cultivadas20, es difícil identificar que las células han sufrido anastasis en animales, porque las células recuperadas aparecen morfológicamente indistinguibles a las células sanas normales no han procurado la muerte celular. Por ejemplo, las células de cáncer de cérvix humano HeLa Mostrar características morfológicas de la apoptosis1,2,
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Discusión
El sistema de doble biosensor CaspaseTracker es una novedosa y exclusiva herramienta que permite la detección de los últimos o actividad caspasa continua y seguimiento de las células que se han invertido muerte celular procesan y sobrevivieron después de experimentar actividad caspasa en vivo. Mientras que la actividad de caspasas ha asumido tradicionalmente como una característica distintiva de la apoptosis, cada vez más estudios revelan que no apoptótica caspasa actividad juega.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Darren Obbard Drosophila imagen en Figura 3 y en manuscrito video; J. Marie Hardwick, Wade Gibson y Heather M. Lamb para la valiosa discusión de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright concede 007-2009 (H.L.T.), beca de la Fundación de investigación de Ciencias de la vida (H.L.T.) y NCI K22 otorga CA204458 (H.L.T.). Ho Tang Lam era un Shurl y Kay Curci Foundation Fellow de la Fundación de investigación de Ciencias de la vida (2014-2017).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| FUERTEMedio de | |||
| montaje Vectashield | Productos vectoriales | H-1000 | Medio de montaje antidecoloración Medio de montaje |
| Vectashield (con DAPI) | Productos | H-1200 | Medio de montaje antidecoloración con |
| pinzas | Ted Pella | #505 (110 mm, #5) | Grado de biología de pinzas Dumont, |
| acero inoxidable portaobjetos colgantes | Fisher Scientific | 12-565B | Portaobjetos de vidrio |
| Hoechst 33342 | Sondas moleculares | H1399 | Tinción de ADN |
| Mitotracker Red CMXRos | Sondas moleculares | M-7512 | Tinción de mitocondrias |
| Anticuerpo de caspasa-3 (Asp175) escindido | Tecnología de señalización celular | #9661 | Tinción para fragmento activo de caspasa-3 |
| Albúmina sérica bovina (BAS) | Sigma-Aldrich | A8806 | Agente bloqueante para la inmunotinción |
| Solución salina tamponada con fosfato | VWR | 114-056-101 | Medio para lavado e inmunotinción |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Detergente para permeabilización |
| Name | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| EQUIPMENT | |||
| LSM780 Microscopio confocal | Carl Zeiss | N/A | Imágenes |
| Carl Zeiss Microscopio estereoscópico Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A Disección | Drosophila |
| AmScope Fibra Óptica Iluminador de Microscopio de Doble Cuello de Cisne, 150W | AmScope | WBM99316 | Fuente de luz |
Referencias
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 26, 239-257 (1972).
- Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, ....
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Reimpresiones y permisos
