Abstract
В этом протоколе, мы демонстрируем метод синтеза 2'-алкине модифицированный дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), прядей с помощью автоматизированного твердофазного синтеза с использованием стандартной химии фосфорамидитов. Олигонуклеотиды после синтетически помечены двумя новыми фотостабильных красителей цианиновыми с использованием медно-катализируемой щелчка химии. Синтез обоих донора и акцептора красителя описывается и выполняется в ходе трех последовательных стадий. С помощью ДНК в качестве окружающей архитектуры, эти две краски претерпевают передача энергии, когда они приводятся в непосредственной близости от гибридизации. Таким образом, отжиг двух одноцепочечных цепей ДНК визуализируют с помощью изменения цвета флуоресценции. Это изменение цвета характеризуется флуоресцентной спектроскопии, но можно также наблюдать непосредственно с помощью портативных ультрафиолетового (УФ) лампы. Концепция двойной флуоресценции цвета считывания делает эти олигонуклеотидных зондов отличные инструменты для молекулярной визуализации, особенно когда описывается фоиспользуются tostable красители. Таким образом, фотообесцвечивание зондов изображений предотвращается, и можно наблюдать биологические процессы в режиме реального времени, в течение более длительного периода времени.
Introduction
Молекулярная визуализация представляет собой фундаментальный метод для понимания биологических процессов в живых клетках. 1-3 Развитие флуоресцентных зондов нуклеиновых кислот , основанных на таких химико-биологических приложений стало расширение полевых исследований. Эти флуоресцентные зонды должны соответствовать ряду требований, чтобы стать подходящими инструментами для визуализации клеток. Во - первых, применяемые красители должны проявлять флуоресценцию с высоким квантовым выходом, сдвиги больших Стокса и, самое главное, высокие photostabilities , чтобы в долгосрочной перспективе в естественных изображений. А во-вторых, они должны показать надежную флуоресцентного считывания. Обычные хромофор-гасителем-системы основаны на считывании одного цвета флуоресценции простыми изменениями в интенсивности флуоресценции. 4 Этот подход несет риск ложных положительных или ложных отрицательных результатов вследствие автофлюоресценции внутриклеточных компонентов или низким отношением сигнал-шум из-за нежелательного тушения другой комненты. 4
Недавно мы сообщали о концепции "светофоров ДНК" , которые показывают двойной флуоресценции цвета отсчеты с помощью двух различных хромофоров. 5-6 Концепция основана на передаче энергии (ET) от донора красителя к акцепторной краситель , который изменяет флуоресценции цвет (рисунок 1). Это позволяет более надежное считывание и тем самым обеспечивает мощный инструмент для визуализации флуоресцентных зондов. Этикетировочное олигонуклеотидов с флуоресцентных красителей может быть достигнуто с помощью двух различных подходов. Красители могут быть включены во время химического синтеза ДНК на твердой фазе , с использованием соответствующим образом модифицированных фосфорамидит строительных блоков. 7 Этот способ ограничен красители, которые стабильны в стандартных фосфорамидитных и удаления защитной группы условиях. В качестве альтернативы, после синтетические методики модификации были созданы в химии олигонуклеотида. Здесь мы демонстрируем синтез одного из наших новых фотографийТаблица энергии пар передачи 8,9 и пост-синтетической маркировки ДНК с использованием медно-катализируемой 1,3-циклоприсоединения между азидов и алкинов (CuAAC). 10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Внимание: Пожалуйста, обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала (MSDS) перед использованием. Некоторые из химических веществ, используемых в этих синтезах являются токсичными и канцерогенными свойствами. Пожалуйста, используйте все надлежащие практики в области безопасности, которые обычно требуются в органических лабораториях химии, таких как носить лабораторный халат, защитные очки и перчатки.
1. Синтез Красители
Примечание: Оба красители могут быть синтезированы с помощью одних и тех же типов реакции 2 приведен обзор этих реакций..
- Синтез 1- (3-азидопропил) -4- (2- (1-метил-1H-индол-3-ил) винил) йодид пиридин-1-иум (краситель 1)
- Синтез иодида -4-метилпиридин-1-кашированная 1- (3-иодпропил) (рис 2А, стадия а)
- Растворить 466 мг 4-пиколина и 5,91 г 1,3-diiodopropane в 10 мл ацетонитрила в пробирке парофазного 20 мл и уплотнение плотно перегородкой крышкой.
- Нагревают до 85 ° С в течение 16 ч.
- Дают остыть до комнатной температуры, затем растворитель удаляют при пониженном давлении с использованием роторном испарителе.
- Добавьте 20 мл этилацетата до остаточного масла и обработать смеси в 120 Вт ультразвуковой ванне в течение 3 мин.
- Собирают образовавшийся осадок путем фильтрации и промывали пять раз этилацетатом. Сушат твердый продукт под вакуумом O / N.
- Синтез 1- (3-азидопропил) -4-метилпиридин-1-фрама (рис 2А, стадия б)
- Растворить 900 мг 1- (3-иодпропил) йодистого -4-метилпиридин-1-дович в 12 мл ацетонитрила в ампуле парофазного 20 мл, добавляют 376 мг азида натрия, и уплотнение плотно перегородкой крышкой.
- Нагревают до 85 ° С в течение 16 ч.
- Дают остыть до комнатной температуры, затем растворитель удаляют при пониженном давлении с использованием роторного испарителя.
- Добавить 15 мл дихлорметана к остатку.
- Отфильтровывают и отбрасывать полученный осадок.
- Растворитель удаляют при пониженном давлении с использованием гнильичных испаритель, с получением продукта в виде коричневого масла.
- Синтез 1-метил-1H-индол-3-карбальдегид (рис 2А, стадия с)
- В атмосфере инертного газа (аргон), растворяют 1,45 г индол-3-карбальдегида, 1,52 г карбоната калия и 2,70 г диметилкарбоната в 10 мл абсолютного диметилформамида в 50 мл круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником.
- Смесь перемешивают при 130 ° С в течение 19 часов.
- Дают остыть до комнатной температуры, затем выливают смесь на лед.
- Экстрагируют водный слой трижды по 150 мл этилацетата.
- Органические слои объединяют, промойте их водой, сушат их над сульфатом натрия и растворитель удаляют при температуре 50 ° С при пониженном давлении с использованием роторного испарителя.
- Сцепление с 1- (3-азидопропил) -4- (2- (1-метил-1H-индол-3-ил) винил) пиридин-1-кашированная йодида (краситель 1) (Фигура 2А, стадия г)
- Работа в атмосфере аргона и при исключении влаги. Dissolве 90 мг 1- (3-азидопропил) -4-метилпиридин-1-IUM и 48 мг 1-метил-1H-индол-3-карбальдегида в 4 мл этанола в 20-мл круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником.
- Добавить 0,07 мл пиперидина и высокую температуру до 80 ° С в течение 4 часов.
- Дают остыть до комнатной температуры.
- Собирают полученный осадок путем фильтрации и промывали три раза диэтиловым эфиром.
- Добавить диэтиловый эфир к надосадочной жидкости, и собирают полученный осадок фильтрованием. Промыть три раза диэтиловым эфиром.
- Объединяют преципитаты.
- Синтез иодида -4-метилпиридин-1-кашированная 1- (3-иодпропил) (рис 2А, стадия а)
- Синтез 1- (3-азидопропил) -4- (2- (1-метил-2-фенил-1H-индол-3-ил) винил) йодид хинолин-1-иум (краситель 2)
- Синтез иодида -4-метилхинолин-1-кашированная 1- (3-иодпропил) (Фигура 2В, стадия а)
- Растворить 715 мг 4-метилхинолина и 5,91 г 1,3-diiodopropane в 10 мл ацетонитрила в пробирке парофазного 20 мл и уплотнение плотно перегородкой крышкой.
- Высокая температурадо 85 & deg; С в течение 16 ч.
- Дают остыть до комнатной температуры, затем растворитель удаляют при пониженном давлении с использованием роторного испарителя.
- Добавьте 20 мл этилацетата с оставшимся маслом и относиться к смеси в 120 Вт ультразвуковой ванне в течение 3 мин.
- Собирают образовавшийся осадок путем фильтрации и промывали пять раз этилацетатом. Сушат твердый продукт под вакуумом O / N.
- Синтез 1- (3-азидопропил) -4-метилхинолин-1-кашированная (Фигура 2В, стадия б)
- Растворить 900 мг 1- (3-иодпропил) йодистого -4-метилхинолин-1-дович в 12 мл ацетонитрила во флаконе парофазного 20 мл, добавляют 333 мг азида натрия, и уплотнение плотно перегородкой крышкой.
- Нагревают до 85 ° С в течение 16 ч.
- Дают остыть до комнатной температуры, затем растворитель удаляют при пониженном давлении с использованием роторного испарителя.
- Добавить 15 мл дихлорметана к остатку.
- Отфильтровывают и отбрасывать полученный осадок.
- Удалите U растворительNDER при пониженном давлении с использованием роторного испарителя с получением продукта в виде коричневого масла.
- Синтез 1-метил-2-фенил-1H-индол-3-карбальдегид (Фиг.2В, стадия с)
- В атмосфере инертного газа (аргона), растворяют 1,45 г 2-фенил-1H-индол-3-карбальдегида, 0,996 г карбоната калия и 1,77 г диметилкарбоната в 10 мл абсолютного диметилформамида в 50 мл круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником.
- Смесь перемешивают при 130 ° С в течение 19 часов.
- Дают остыть до комнатной температуры, затем выливают смесь на лед.
- Экстрагируют водный слой трижды по 150 мл этилацетата.
- Объединяют органические слои, промойте их водой, высушить их над сульфатом натрия и растворитель удаляют при пониженном давлении с использованием роторного испарителя.
- Сцепление с 1- (3-азидопропил) -4- (2- (1-метил-2-Phe Nyl-1H-индол-3-ил) винил) йодид хинолин-1-ия (Фигура 2В, стадия г)
- Работа в рамках аргна и при исключении влаги. Растворите 90 мг 1- (3-азидопропил) -4-метилхинолин-1-IUM и 59,7 мг 1-метил-2-фенил-1H-индол-3-карбальдегида в 4 мл этанола в 20-мл круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником.
- Добавить 0,06 мл пиперидина и высокую температуру до 80 ° С в течение 4 часов.
- Дают остыть до комнатной температуры.
- Собирают полученный осадок фильтрованием и промывают диэтиловым эфиром три раза.
- Добавить диэтиловый эфир к надосадочной жидкости, и собирают полученный осадок фильтрованием. Промыть три раза диэтиловым эфиром.
- Объединяют преципитаты.
- Синтез иодида -4-метилхинолин-1-кашированная 1- (3-иодпропил) (Фигура 2В, стадия а)
2. Синтез цепей ДНК
Примечание: Синтез цепей ДНК осуществляется с использованием метода фосфорамидитную на твердой фазе, как описано М. Caruthers 11 на ДНК - синтезаторе. Функционирование синтезатора испытан перед Методику синтеза, и реагенты, если обновляетсянеобходимо.
- Prearrangements
- Растворить коммерчески доступный 2'-O-пропаргил-deoxyuridinephosphoramidite (Сu) в 1,2 мл амидита разбавителя (экстра сухого ацетонитрила). Перемещение раствора во флаконе в ампулу синтезатор и винт в синтезаторе.
- Выполните "тест на утечку" (в соответствии с инструкциями производителя), чтобы убедиться, что не существует никакой утечки газа аргона. Если "утечка тест" терпит неудачу, винт во флаконе более плотно.
- Премьер-решение cü путем заполнения трубки, которая подключается к синтезу в твердой фазе камеры.
- Промыть все линии ацетонитрила.
- Синтез цепей ДНК
- С помощью компьютера, подключенного к ввести метод ДНК-последовательность и муфты, следуя подсказкам из протокола производителя. Стадию муфта строительного блока cü занимает 168 сек с 7 импульсами (каждый импульс в 16 мкл) по сравнению с 40 сек с 7 импульсами для обычногофосфорамидит в качестве строительных блоков.
- Установите колонку, содержащую CPG (стекло с порами) в виде твердой фазы, который модифицирован с 1 мкмоль первого основания (синтез ДНК осуществляется от 3 'к 5') в синтезатор.
- Запустите синтез на синтезаторе ДНК 11.
- Обрабатывают синтезированных нитей ДНК
- Сухие колонны с синтезированной нити ДНК под вакуумом O / N.
- С помощью пинцета, чтобы открыть колонку и отпустить CPG в реакционную пробирку. Добавьте 700 мкл концентрированного водного раствора аммиака с целью снятия защиты олигонуклеотида и освободить нить ДНК от CPG.
- Закройте флакон и нанесите крышку безопасности на реакционный сосуд, чтобы предотвратить его от разрыва, и нагревают до 50 ° С в течение 18 часов.
- Удаления аммиака путем центрифугирования при пониженном давлении (100 мбар) при 30 ° С в течение 30 мин.
- Начать фильтрацию от CPG: Центрифуга судна в 11,000 XG Foг 3 мин. Возьмите супернатант и перенести его в центробежном устройстве с размером пор 0,45 мкм. Центрифуга при 1000 мкг в течение 4 мин.
- В то же время добавляют 300 мкл дважды дистиллированной воды в CPG, вихря на 20 сек и центрифугировать при 11000 х г в течение 3 мин. Передача супернатант в центробежном устройстве и центрифуге при 1000 х г в течение 4 мин. Повторите эту процедуру промывки дважды.
- Удалите воду из объединенных водных растворов центрифугированием при 0,1 мбар и 25 ° CO / N.
3. "Нажатие кнопки" Процедура
- Добавляют 50 мкл бидистиллированной воды, 25 мкл раствора аскорбата натрия (0,4 М в воде), 34 мкл трис - [(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил) метил] амин (0,1 М в ДМСО / tBuOH 3: 1), 114 мкл азид (0,01 М раствор в ДМСО / tBuOH 3: 1) и 17 мкл тетракис (ацетонитрил) медь (I), гексафторфосфат раствор (0,1 М в ДМСО / tBuOH 3: 1) в лиофилизированном образце ДНК алкинов модифицированными. Инкубируйте образца при температуре 60 ° С в течение 1,5 ч.
- Охладить до комнатной температуры.
- Добавить 150 мкл Na 2 EDTA (0,05 М раствор в воде) и 450 мкл ацетата натрия (0,3 М в воде) к образцу ДНК и переноса в 10 мл пробирку.
- Добавляют 10 мл этанола (100%) и хранить при -32 ° C в течение 16 часов.
- Центрифуга судно в течение 15 мин при 1000 XG и удалить супернатант.
- Промыть ДНК-осадок с 2 мл холодного этанола (80%).
- Сухой осадок при пониженном давлении.
4. Очистка ВЭЖХ
Примечание: Перед тем, отделяющих нити ДНК убедитесь, что ВЭЖХ работает должным образом, достаточно растворителя доступен и столбец чист. Промыть колонку с исходной концентрацией буфера / ацетонитрила.
- Растворите сырой ДНК-осадок в 250 мкл бидистиллированной воды и переноса в ВЭЖХ емкость.
- Запуск ЖХВД 45 мин с градиентом от 0% ацетонитрила до 15% ацетонитрила в течение 1 красителя и GRADI лор 0% от ацетонитрила до 17% ацетонитрила для красителя 2. Контролировать прогон путем проверки 260 нм (поглощение ДНК) и 459 нм (краситель 1) или 542 нм (краситель 2). Собирают те фракции, которые показывают поглощение в обеих длин волн каналов.
- Проверка собранных фракций для правой массы с помощью матричной лазерной десорбцией ионизации (MALDI) масс-спектрометрии с использованием матрицы, состоящей из 3-hydroxypicolinic кислоты (3HPA) и diammoniumhydrogencitrate.
- Готовят матрицу путем смешивания 900 мкл насыщенного раствора 3-HPA в соотношении 1: 1 смеси ацетонитрила и воды с 100 мкл раствора diammoniumhydrogencitrate (100 г / л) в воде.
- Пипетировать 1-2 мкл ДНК-зонда на мишени и дайте ему высохнуть на воздухе.
- Добавить 0,2 мкл матрицы 3-НРА / diammoniumhydrogencitrate к образцу и перемешать до тех пор, пока не кристаллизуется.
- Выполните MALDI масс-спектрометрии.
- Объединить эти ВЭЖХ фракции, которые демонстрируют правильную массу.
Примечание: Концентрация определяется путем измерения поглощения при 260 нм с использованием UV / VIS спектрофотометр, на основании коэффициента экстинкции (ε 260) оснований ДНК и красителя.
- Растворить ДНК в 100 - 200 мкл бидистиллированной воды.
- Применить 1 мкл раствора ДНК на УФ / Vis спектрофотометр.
- Измеряют поглощение при 260 нм. Повторите три раза.
- Возьмем среднее значение для расчета концентрации раствора. Для расчета коэффициентов экстинкции, используйте е 260nm из четырех природных оснований 12 и е 260nm купленного строительного блока Сu (считается как природный уридина) 12 , чтобы получить е 260nm всей цепи ДНК. Для красителя 1, использование ε 260nm = 10200 L * моль -1 * см -1 и краситель 2, использование ε = 260 нм 13100 L * М <SUP> -1 * см -1. Вычислить концентрацию раствора следующему закону Ламберта-Бирс "на основе коэффициентов экстинкции и измеренных значений спектральной поглощательной способности . 13
6. Подготовка проб и спектроскопии
- Подготовка единичных образцов прядей
- Готовят отдельно 1 мл 2,5 мкМ растворов каждого из модифицированного DNA1 и DNA2 в 200 мМ NaCl, 50 мМ NaP I - буфера, рН = 7.
- Приготовление образцов Двухцепочечное
- Готовят 1 мл раствора , содержащего 2,5 мкМ DNA1 и 2,5 мкМ DNA2 в 200 мМ NaCl, 50 мМ NaP I - буфера, рН = 7 в реакционном сосуде.
- Закрепить крышку с защитным колпачком и тепла до 90 ° С в течение 10 мин. Затем выключите нагрев и дайте остыть до комнатной температуры O / N.
- абсорбционная спектроскопия
Примечание: Для определения длины волны возбуждения флуоресценции спецификацииСпектры поглощения скопия записываются.- Одиночные измерения прядей
- Записать измерение бланка , содержащего только 200 мМ NaCl, 50 мМ дремоту я буфера, рН = 7.
- Перенести приготовленный раствор DNA1 в 1 см кварцевой кювете и регистрируют поглощение. Исправьте измерение против пустых данных. Определить максимальную величину поглощения красителя.
- Повторите эти действия для DNA2.
- Одиночные измерения прядей
- Флуоресцентная спектроскопия
- Одиночные измерения прядей
- Записать измерение бланка , содержащего только 200 мМ NaCl, 50 мМ дремоту я буфер, рН = 7; с использованием длины волны возбуждения красителя 1.
- Передача DNA1 раствора в 1 см кварцевой кювете.
- Запись спектра флуоресценции.
- Двойное измерение нитка
- Передача двойного раствора нити в кювете из кварцевого стекла. Запись спектра флуоресценции с использованием длины волны возбуждения красителя 1.
- Одиночные измерения прядей
- эксперименты по визуализации
Внимание: Соответствующие средства защиты глаз следует носить, чтобы избежать УФ повреждения глаз!- Для того, чтобы получить лучшее представление о том, что записанные спектры показывают, облучать кюветах с ручным УФ-лампами (рисунок 5). Обратите внимание на изменение цвета флуоресценции от одного к двухцепочечной ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Спектры поглощения и флуоресценции одиночной и двухцепочечной ДНК записаны , как показано на рисунке 4.
Записанный спектры поглощения (рис 4 справа) показывают максимумы поглощения λ макс при 465 нм для одноцепочечной DNA1 (краситель 1) и 546 нм для одноцепочечной DNA2 (краситель 2). Отжигают DNA1_2 (краситель 1 & краситель 2) показывает максимумы на обоих 469 нм и 567 нм. Оба максимумы поглощения показывают батохромный сдвиг, 4 нм для красителя 1 и 21 нм для красителя 2. Эти небольшие изменения спектроскопические являются результатом экситонных взаимодействий между красителями в архитектуре биспиральной ДНК.
Соответствующие спектры флуоресценции (рис 4 слева) демонстрируют максимумы λ макс, при 537 нм для одноцепочечной DNA1 (краситель 1, возбуждение при 435 нм), при 607 нм для одного-stranded DNA2 (краситель 2, возбуждение при 535 нм) и при 615 нм для отожженных DNA1_2 (краситель 1 & краситель 2, возбуждение при 435 нм). DNA1_2 показывает только максимум излучения красителя 2, хотя краситель 1 селективно возбуждается что свидетельствует о том, что перенос энергии происходит эффективно от красителя 1 окрасить 2. Это дает коэффициент контрастности выбросов в 1:57.
Разница между одинарной и двойной нити очевидно путем сравнения цвета излучения в кювете при возбуждении со стандартным УФ-лампой , как показано на рисунке 5.
Рисунок 1. Базовая концепция переноса энергии в ДНК. Донором модифицированная цепь ДНК (зеленый) показывает флуоресценции при 535 нм при облучении при 435 нм. Если гибридизуют с акцепторной модифицированного счетчика нити (красного цвета) в результате двойной нити амитолько хау красной флуоресценции акцептора красителя при 610 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Синтез Обзор краситель 1 и краситель 2. синтез двух цианиновых красителей 1 (A) и 2 (В) осуществляется в ходе трех последовательных стадий. 9 (а)) 1,3-diiodopropane, СН 3 CN, 85 ° С, 16 ч, 94%; б) NaN 3, CH 3 CN, 85 ° С, 16 ч, 87%; в) К 2 СО 3, диметилкарбонат, ДМФ, 130 & deg ; С, 19 ч, 89%; г) пиперидина, этанол, 80 ° С, 4 ч, 80%. (Б) а) 1,3-diiodopropane, CH 3 CN, 85 ° С, 16 ч, 49%; б) NaN 3, CH 3 CN, 85 ° С, 16 ч, 93%; с) K 2 CO 3, диметилкарбонат, ДМФ, 130 & deg ; С, 19 ч, 98%; d) пиперидин, этанол, 80 ° С, 4 ч, 44%. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Структура Сu-строительного блока, красители 1 и 2 и последовательности DNA1 и DNA2. Красители 1 и 2 связаны с позицией 2 'рибозы с помощью триазола линкера в пределах заданных последовательностей DNA1 и DNA2. 9 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Fluoценция одиночных и двойных нитей скрученных ДНК (слева) и поглощения одиночных и двойных нитей скрученных ДНК (справа). Спектры излучения DNA1 (черный) возбуждается на 464 нм, DNA2 (красный), возбужденных при 535 нм и 435 нм (розовый ), и DNA1_DNA2 гибрид (синий), возбужденные на 435 нм показаны. Спектры поглощения одноцепочечной DNA1 (черный), DNA2 (красный), и гибридизированными двойной нити DNA1_DNA2 (синий) показаны на правой стороне шоу. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Цвет свечения из одноцепочечной ДНК с помощью красителя - донора (слева) и двухцепочечной ДНК с донором и акцептором красителя (справа) при возбуждении УФ-лампой. Изображение кювету с одноцепочечной DNA1 (ЛЕФт сторона) показывает ярко - зеленую флуоресценцию, и образ двухцепочечной DNA1_DNA2 (правая сторона) показывает красную флуоресценцию при возбуждении портативного УФ-лампы при длине волны 366 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол показывает полную процедуру маркировать ДНК после синтетически с помощью CuAAC азидом модифицированного флуоресцентных красителей. Это включает в себя синтез красителей и ДНК алкинов-модифицированный, а также процедуры маркировки.
Синтез красителей следует четыре шага. Все продукты могут быть получены с помощью достаточно простого осаждения из-за их положительного заряда и не требуется больших затрат времени хроматографии на колонке. Введение азида функциональных возможностей перед центральным стадий связывания укорачивает Синтезы красителей четырех вместо пяти последовательных стадий реакции. Применение 1,3-diiodopropane вместо 3-iodopropanol на стадии алкилирования, реакции Appel и следующие реакции Финкельштейн для преобразования гидроксильной функции в йодом функциональные возможности избегали. Эти изменения по сравнению с опубликованными процедурами позволяют синтезировать красители в больших масштабах и более короткие периоды времени.
DNA1 помечена краситель 1, донор красителя и DNA2 красителем 2, акцепторной красителя. Когда DNA1 и DNA2 отжигают как красители попадают в непосредственной близости. Эффективная передача энергии наблюдается, когда краситель 1 возбуждается. В принципе, Экситонный взаимодействие между обоими красителями может помешать эффективной передачи энергии, поскольку последний процесс требует отцеплен и возбуждаютd краситель 1 и отцепили краситель 2. Возбуждение связанных красителей будет инициировать различные фотофизические пути. 14 Наши предыдущие исследования показали , что 9,15 приложенное 3'-5'-диагональной расположение красителей обеспечивает структурную основу для только маленьких экситонных взаимодействий между красители и эффективная передача энергии.
Высокая эффективность демонстрируемой переноса энергии флуоресценции обеспечивает точное считывание в в пробирке и в естественных условиях экспериментов. Это предлагает широкий диапазон применений, в том числе визуализации ДНК-гибридизации в молекулярных маяков, связывание молекул-мишеней в кислых аптамеров нуклеиновых основе, а также визуализации целостности малых интерферирующих РНК (миРНК) внутри клеток. Основным ограничением является требование маркировать обе нити ДНК. В будущем мы намерены сосредоточить усилия на разработке двукратно меченых олигонуклеотидных зондов, несущих оба красителей в одной цепи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Финансовая поддержка со стороны Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), Научно-исследовательский Training Group ГРК 2039 (финансируется DFG) и KIT выражает искреннюю признательность.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure1 |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. | |||
References
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
- Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. Diversity-oriented optical imaging probe development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. #34;DNA Traffic Lights": Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor. ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).
- Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. DNA and RNA "Traffic Lights": Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging. J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).
- Berndl, S., Wagenknecht, H. A. Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).
- Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for "DNA Traffic Lights". Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).
- Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes. ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).
- Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA. Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support. J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).
- Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids. Fasman, G. D. , CRC Press. 589 (1975).
- Puglisi, J. D., Tinoco, J. I.
- Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes. J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).
- Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA "Traffic Lights", Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).
