Abstract
Este estudo foi desenhado para avaliar o efeito protetor da estirpe Bacillus subtilis contra as complicações relacionadas ao estresse térmico. Trinta e dois ratos Sprague-Dawley foram usadas neste estudo. Os animais foram tratados por via oral duas vezes por dia durante dois dias com B. subtilis estirpe BSB3 ou PBS. No dia seguinte, após o último tratamento, cada grupo foi dividido e dois grupos experimentais (tratados com um PBS e tratadas com um B. subtilis) foram colocados a 45 ° C durante 25 min. Dois grupos de controlo permaneceu por 25 min à temperatura ambiente. Todos os ratos foram sacrificados e diferentes parâmetros foram analisados em todos os grupos. Os efeitos adversos do estresse por calor são registrados pela diminuição da altura das vilosidades e espessura total da mucosa do epitélio intestinal; translocação de bactérias a partir do lúmen; vesiculação aumento de eritrócitos e elevação dos lipopolissacáridos (LPS) de nível no sangue. A eficácia protectora do tratamento é avaliada por prévenção destes efeitos secundários. O protocolo foi definido acima para o tratamento oral de ratos com bactérias para a prevenção de complicações de stress de calor, mas este protocolo pode ser modificado e utilizado para outras vias de administração e para a análise de compostos diferentes.
Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo IACUC da Universidade de Auburn, Auburn, Alabama.
1. Preparação de Meios de Cultura, pratos e Cultura bacteriana
- Inocular 10 ml de caldo nutriente num frasco com uma única colónia de cultura BSB3 Bacillus subtilis, cultivadas durante a noite numa placa de agar nutriente.
- Adicione 500 ml de meio de esporulação 19 (por litro: Bacto Caldo Nutriente, 8 g; 10% (w / v) de KCl, 10 mL; 1,2% (w / v), MgSO 4 x 7H 2 O, 10 mL; agar, 15 g) e autoclave a 121 ° C durante 20 min. Deixar arrefecer até 50 ° C e adicione as seguintes soluções estéreis: 1 M Ca (NO3) 2, 1 ml; 0,01 M de MnCl2, 1 ml; 1 mM de FeSO4, 1 ml.
- Arrefecer meio preparado a 40 ° C durante 20 min à temperatura ambiente e verter em 25 ml de cada uma das 20 placas de Petri estéreis no gabinete estéril. Deixe o meio solidificar durante a noite.
- Espalhe 0,5 ml da cultura durante a noite de Bacillus subtilis BSB3 sobre a superfície do meio em placas de Petri. Incubar a cultura a 37 ° C durante 5 dias até 90% a esporulação. Revelar esporos fase brilhante por microscopia de alta resolução.
- bactérias colheita por adição de 1 ml de fosfato estéril tamponado salino (PBS) para a placa de raspagem e bactérias a partir de uma superfície usando um espalhador de células estéril. Conserve a suspensão na geladeira até ser necessário.
- Confirmar viabilidade das bactérias por plaqueamento de 0,1 ml de uma diluição adequada (10 -5 a 10 -6) de uma suspensão de bactérias em placas de meio de esporulação seguido de incubação durante 18 - 24 h a 37 o C.
- Contagem das colónias bacterianas das placas utilizando um contador de colónias e calcular a título de bactérias na suspensão testado. Prepare suspensão bacteriana com a concentração final de 1 x 10 8 UFC / ml em PBS.
2. Os animais
- Usar 32 ratazanas macho Sprague-Dawley (250-300 g). Manter animais sob condições específicas isentos de agentes patogénicos com livre acesso a comida pellet padrão e água. Estabelecer uma temperatura média (21 ± 1 ° C), humidade (50 ± 5%) e um ciclo de luz-escuro de 12 h.
3. Design Experimental
- Iniciar o tratamento dos animais por sondagem oral de 11, após 2 dias de aclimatização. Use seringa com a agulha de gavagem oral. Trate 16 ratos com B. suspensão subtilis BSB3 (1 ml por ratazana) duas vezes por dia durante dois dias (grupo de B. subtilis). Tratar 16 ratos com PBS (1 ml por ratazana) duas vezes por dia durante dois dias (grupo PBS) (Figura 1).
- Após o tratamento, subdivisão de cada grupo (8 ratos por grupo): Grupo 1- controle (PBS / sem estresse), Grupo 2- B. subtilis (B. subtilis / sem estresse), Grupo 3 tensão (PBS / estresse por calor) e Grupo B. 4- subtilis + estresse (B. subtilis estresse / calor).
- Medir a temperatura rectal de cada rato usando um electronic termômetro digital. Manter os ratos dos grupos 1 e 2 à temperatura ambiente durante 25 min. Animais Local de grupos 3 e 4 em uma câmara climática a 45 o C e umidade relativa de 55% durante 25 min.
- Em seguida, medir a temperatura rectal de cada rato em todos os grupos usando um termômetro digital eletrônico. Coloque todos os animais à temperatura ambiente durante 4 h.
- Anestesiar ratos com isoflurano (2-4%) em um frasco selável anestesia e observar até os ratos são anestesiados profundamente (ausência de resposta ao aperto do dedo do pé). Euthanize ratos por decapitação rápida com uma guilhotina.
- Recolha de sangue do tronco de cada rato 20 (15 - 16 ml) com as pipetas apirogénica apirogénica em tubos para se obter soro imediatamente e recolher amostras de sangue (7 ul) de cada rato com uma pipeta para exame microscópico.
- Colocar os tubos com o sangue no frigorífico durante pelo menos 30 min para permitir a coagulação. Tubos de centrifugação a 20 ° C, 7,000 xg durante 10 min e rapidamenteremover o soro com uma pipeta. Soro alíquota obtidos a partir de cada rato em 50 volumes ul e armazenar a -20 ° C até ao ensaio.
4. Procedimento Cirúrgico
- Cut / aparar todas as peles do abdômen e tórax do lado de baixo da carcaça com tesouras elétricas. Coloque a carcaça em um armário estéril e tratar a superfície raspada da carcaça com álcool a 70%.
- Use um bisturi estéril para criar uma incisão na linha média do abdome. Remover fígado, nódulos linfáticos mesentéricos, baço e intestino delgado de cada rato usando uma pinça estéreis.
5. Análise de translocação bacteriana
- Coloque cada amostra de fígado, linfonodos mesentéricos e baço em tubos estéreis pré-pesado e pesar. Calcule o peso da amostra, tal como uma diferença entre o peso de um tubo com uma amostra e o peso de um tubo vazio.
- Adicionar PBS estéril ao tubo para se obter uma diluição de 1:10 (w / v) da amostra e homogenhecer cada amostra com um homogeneizador de tecidos de vidro estéril para se obter uma suspensão homogénea de 21.
- Fazer diluições em série (10 -1 a 10 -4) de cada amostra em PBS estéril. Placa de 0,1 ml de todas as diluições de todos os tecidos sobre a superfície de MacConkey e de 5% de agar de sangue e de agar de sangue de Brucella com hemina (0,005 g / L) e vitamina K1 (0,01 g / L) placas.
- Incubar MacConkey de e 5% ágar sangue aerobicamente e Brucella placas de agar de sangue em condições anaeróbias a 37 o C 22.
- Contagem das colónias de bactérias aeróbias, após 24 horas, e as colónias de bactérias anaeróbicas após 48 horas de incubação utilizando um contador de colónias. Expressar os resultados como o número de unidades formadoras de colónias (CFU) em um grama de tecido.
6. Análise histológica
- Retirar amostras do intestino delgado de cada rato pelo procedimento cirúrgico (passos 4,1-4,2). Fix amostras em fixador de Bouin, incorporar em parafina,preparar 6 mm seções e seções mancha com hematoxilina e eosina utilizando procedimentos padrão 23.
- Use um sistema de microscópio de alta resolução para medição da altura das vilosidades intestinais e espessura total da mucosa em cada amostra (ampliação 100X) 24. Analise 4 amostras de cada rato e fazer pelo menos vinte medições em cada amostra. Expressar os resultados em micrômetros.
7. citocinas Assay
- Use kits de rato comerciais ELISA para IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ, e IL-10 para medir os níveis de citocinas no soro de acordo com o protocolo do fabricante.
- Gerar curvas padrão para cada conjunto de amostras testadas usando padrões para o kit relevante. Definir o nível de citocinas em cada amostra por comparação dos dados experimentais com a curva padrão apropriada.
8. Lipopolissacarídeo Assay
- Analisar nível de LPS no soro utilizando um kit de rato de LPS de acordo com ELISAo protocolo do fabricante. Estimar a concentração de LPS em amostras por comparação dos valores obtidos com os valores da curva padrão.
9. alta resolução Microscopia de Luz de Sangue
- Usar o sistema de microscópio descrito anteriormente 25,26. Use uma plataforma de isolamento de vibração como uma base para o sistema de microscópio e câmera de vídeo e de computador 25 para gravar as imagens ao vivo. Calibrar imagens de teste usando uma lâmina de Richardson como descrito anteriormente 27.
- Coloque 7 l de sangue recentemente retirada de cada rato em uma lâmina de vidro, lamela, fotografar e gravar dez quadros de imagem de 72 × 53,3 mm 2 em cada amostra (ampliação 1,700X).
- Medir a concentração de vesículas usando software que fornece imagens ópticas com vista directa de alta resolução em tempo real. Examine um mínimo de 20 quadros de imagem para cada condição experimental 28.
10. Statistiques
- Expresso de todos os valores como média e desvio padrão. Realizar a análise estatística e plotagem gráfico. Analisar os resultados obtidos com o teste t de duas amostras, definir o nível de significância de 0,05 para definir significância estatística.
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Representative Results
A temperatura corporal médio dos animais antes e imediatamente após o estresse térmico foi de 36,7 ± 0,07 o C e 40,3 ± 0,17 o C, respectivamente (P <0,05). A exposição de ratos a calor (grupo 3), resultou na inibição significativa da altura das vilosidades da mucosa e espessura total (Figuras 2, 3). A administração oral de tensão BSB3 antes protegidos estresse intestino do efeito nocivo do calor.
A translocação de bactérias a partir do intestino foi determinado por análise bacteriológica de nódulos linfáticos mesentéricos (MLN), fígado e baço de cada rato. As culturas de bactérias numa concentração de 1,7 x 10 3 ± 4,6 x 10 2 ufc / g de tecido (Figura 4) foram isoladas apenas a partir de MLN e fígado de ratos pré-tratados com PBS e expostos a calor (grupo 3). Todas as amostras testadas de ratos controle (grupos 1, 2) e de animais estressados pelo calorrecebeu uma estirpe BSB3 (grupo 4) eram estéreis. Sem bactérias foram isoladas a partir de amostras de baço.
Nenhuma mudança de IL-1β; IL-6, TNF-α, IFN-y níveis de citocinas foram registradas em ratos estressados pelo calor. No soro de animais tratados com PBS antes da exposição ao calor elevação significativa dos níveis de IL-10 e LPS foi encontrado (grupo 3) - (Figuras 5, 6). Pré-tratamento com B. subtilis BSB3 (grupo 4) impediu o aumento de IL-10 e LPS no soro de animais stressados por calor.
Um aumento significativo da concentração de vesículas livre a partir de (1,4 ± 0,2) x 10 6 de (3,8 ± 0,3) x 10 6 uL vesículas -1 (p <0,001) foi encontrado no sangue de ratos que receberam PBS antes de stress de calor (Figuras 7 , 8). Em um grupo de animais pré-tratados com BSB3 nenhuma mudança no número de vesículas livres foi encontrado réer exposição ao calor (Figura 7).
Figura 1. Desenho do Estudo. Dois grupos de ratos (16 ratos em cada grupo) foram tratados por cânula oral com B. subtilis BSB3 (B. subtilis grupo) ou com PBS (grupo PBS) duas vezes por dia. No dia 3, cada grupo foi subdividido por 8 ratos em cada grupo. Os ratos do Grupo 3 e 4 foram colocados a 45 ° C durante 25 min. Os animais de controlo (grupos 1 e 2) foram mantidos à temperatura ambiente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Medição das vilosidades intestinais Altura (A) e de mucosa Espessura (B) em ratos. Os ratos pré-tratados com PBS ouB. subtilis BSB3 foram expostos a 45 ° C (stress) ou à temperatura ambiente (controlo). Cada grupo consistiu em 8 ratos. Vinte e foram tomadas medidas de cada parâmetro em cada amostra. Os valores são apresentados como a média eo desvio-padrão. Os resultados foram analisados com o teste t de duas amostras com nível de significância de 0,05 para definir significância estatística. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imagens histológicas de Mucosa Intestinal corados com hematoxilina e eosina. Os ratos foram pré-tratados com PBS ou B. subtilis BSB3 e expostos a 45 o C (stress) ou à temperatura ambiente (Control) A. PBS / sem estresse;. B. PBS / estresse de calor; C. B. subtilis / sem estresse; D. B. subtilis estresse / calor. altura das vilosidades intestinais é indicada por setas. Bar 200 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Número total de bactérias em tecidos de ratos. Os ratos pré-tratados com PBS ou B. subtilis BSB3 foram expostos a 45 ° C (stress) ou à temperatura ambiente (controlo). Cada grupo consistiu em 8 ratos. linfonodos mesentéricos, fígado e baço foram removidos assepticamente a partir de cada rato, homogeneizou-se e plaqueadas em meio de ágar para recuperar as bactérias aeróbias e anaeróbias. A contagem total de bactérias translocados (aeróbicos e anaeróbicos) é apresentado como unidades formadoras de colónias (CFU) por grama de tecido. Os valores são apresentados como a média eo desvio-padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. O nível de IL-10 no soro dos ratos. Os ratos pré-tratados com PBS ou B. subtilis BSB3 foram expostos a 45 ° C (stress) ou à temperatura ambiente (controlo). Cada grupo consistiu em 8 ratos. O sangue foi obtido soro de cada rato e analisadas com um estojo de ELISA comercial de rato. Os valores são apresentados como a média eo desvio-padrão. Os resultados foram analisados com o teste t de duas amostras com nível de significância de 0,05 para definir significância estatística. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. LPS em soro de ratos. Os ratos pré-tratados com PBS ou B. subtilis BSB3 foram expostos a 45 ° C (stress) ou à temperatura ambiente (controlo). Cada grupo consistiu em 8 ratos. O sangue foi obtido soro de cada rato e analisadas com um estojo de ELISA comercial de rato. Os valores são apresentados como a média eo desvio-padrão. Os resultados foram analisados com o teste t de duas amostras com nível de significância de 0,05 para definir significância estatística. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. número de vesículas no sangue de ratos. Os ratos pré-tratadoscom PBS ou B. subtilis BSB3 foram expostos a 45 ° C (stress) ou à temperatura ambiente (controlo). Uma pequena gota (7 uL) de sangue recentemente tirado foi colocada numa lâmina de vidro, lamínulas, fotografado e registados dez quadros de imagem em cada amostra (ampliação 1,700X). Concentração de vesículas foi medida utilizando software que fornece imagens ópticas com vista directa de alta resolução em tempo real. Vinte quadros de imagem foram examinados para cada condição experimental. Os valores são apresentados como a média eo desvio-padrão. Os resultados foram analisados com o teste t de duas amostras com nível de significância de 0,05 para definir significância estatística. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Aumento do Vesicles concentração no sangue após o estresse de calor. image Vídeo de sangue de ratos pré-tratados com PBS antes da exposição à temperatura ambiente (A) ou a 45 o C (B). Uma pequena gota (7 uL) de sangue recentemente tirado foi colocada numa lâmina de vidro, lamínulas, fotografado e registados dez quadros de imagem em cada amostra (ampliação 1,700X). A vesícula é indicado como V. Bar 6 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A exposição a resultados de alta temperatura em condições graves de saúde 29. Prevenção e detecção precoce de complicações relacionadas ao estresse por calor são de importância vital 30. O protocolo apresentado pode ser usado para avaliar a eficácia de várias abordagens para a prevenção do stress térmico efeitos adversos.
Passos críticos dentro deste protocolo incluem: o processo de tratamento de calor (45 ° C, 25 min); a utilização de materiais apirogênica durante a coleta e processamento de sangue para evitar a contaminação com enterotoxinas; mantendo alíquotas de soro a -20 ° C para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento; e seguindo o procedimento estéril durante a análise de translocação bacteriana. O protocolo foi criado para o tratamento oral de ratos com bactérias para a prevenção de efeitos colaterais de stress de calor. Para outras vias de administração e outros compostos, este protocolo pode ser modificado. Por exemplo, o tempo de trratamento antes estresse térmico pode ser estendido. A administração oral pode ser alterado para administração rectal. Bacillus subtilis bactérias foram utilizadas para a prevenção de complicações de stress de calor por meio de tratamento oral de animais antes da exposição a uma temperatura elevada. A fim de curar complicações de stress de calor, este protocolo pode ser modificado através da utilização de bactérias para o tratamento de animais após exposição ao calor.
Foi demonstrado que a elevação da temperatura do corpo causou um aumento de eritrócitos vesiculação, e este foi completamente prevenida pelo pré-tratamento com B. bactérias subtilis. Assim, o aumento da concentração de vesículas no sangue durante a exposição ao calor pode indicar o nível de stress de calor e fornece evidências de diagnóstico para a estabilidade de eritrócitos e a sua resistência ao calor. É também um teste muito útil e rápida para a avaliação da eficácia do tratamento preventivo contra as complicações de stress de calor. A indução óproteínas de choque térmico F como um marcador de stress térmico foi anteriormente discutido 30, mas esta aproximação é consumidora de tempo e não pode ser utilizado para o diagnóstico em tempo real de resposta a stress térmico.
A abordagem apresentada para a prevenção do estresse térmico efeitos adversos é simples, eficaz e não requer equipamento adicional ou instalações especiais. aplicação futura deste trabalho vai ajudar a compreender os mecanismos de proteção contra complicações de estresse de calor e caracterizar os novos procedimentos para essa proteção. Este método é de importância para os trabalhadores rodoviários, militares, atletas - grupos de pessoas que estão em risco de insolação durante atividade física intensa ao ar livre 29. A abordagem proposta permite examinar o nível de estresse de calor e avaliar vários métodos para proteger a saúde das pessoas que trabalham em condições extremas.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA | 64-17-5 | |
| Agar | VWR | 97064-334 | |
| MacConkey agar plates | VWR | 470180-742 | |
| 5% blood agar plates | VWR | 89405-024 | |
| Brucella blood agar plate with Hemin, and Vitamin K | VWR | 89405-032 | |
| Bouin’s Fixative | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 15990 | |
| IL-10 Rat ELISA kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0101 | |
| IL-1beta Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0011 | |
| IL-6 Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0061 | |
| INF-gamma Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC4021 | |
| TNF-alpha Rat ELISA Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC3011 | |
| Rat LPS ELISA Kit | NeoBioLab, MA, USA | RL0275 | |
| Environmental Chamber 6020-1 | Caron, Marietta, OH, USA | 6020-1 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Optima L-90K | |
| Ultra Centrifuge | |||
| Light microscope optical system | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| Colony counter | Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA | RE-3325 | |
| Freezer | Haier, Brooklyn, NY, USA | HCMO50LA | |
| Ultra microplate reader | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx 808 | |
| Auto Strip Washer | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx50 | |
| Pipettes | Gilson, Pipetman, France | P100, P200, P1000 | |
| C24 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA | Classic C24 | |
| Rocking Shaker | Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA | 55 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, Sanford, ME, USA | SG403 | |
| Culture Growing Flasks | Corning Incorporated, Corning, NY, USA | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks |
| Optical Spectrometer Genesys 20 | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA. | 4001 | |
| Sony DXC-33 Video camera | Sony | ||
| Richardson test slide | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA | 80303 | |
| Millipore water purification system | Millipore | Direct-Q | |
| Image-Pro Plus software | Media Cybernetics, MD, USA | ||
| Triple Beam Balance | OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA | ||
| Tissue Homogenizer, Dounce | VWR | 71000-518 |
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