La visualización de atado-gran superficie moléculas de ADN con un ADN Fluorescent Protein unión del péptido

Resumen

Presentamos un enfoque para visualizar grandes moléculas de ADN teñidas con péptido de unión al ADN de proteínas fluorescentes (FP-DBP) atadas a la superficie de vidrio recubierta de polietilenglicol (PEG) y avidina y estiradas con flujos de cizallamiento microfluídicos.

Resumen

Las grandes moléculas de ADN atadas a la superficie de vidrio funcionalizada se han utilizado en física y bioquímica de polímeros, particularmente para investigar las interacciones entre el ADN y sus proteínas de unión. Aquí, reportamos un método que utiliza microscopía fluorescente para visualizar grandes moléculas de ADN atadas en la superficie. En primer lugar, los cubreobjetos de vidrio se biotinilan y pasivan mediante un recubrimiento con polietilenglicol biotinilado, que se une específicamente al ADN biotinilado a través de enlazadores de proteínas avidina y reduce significativamente la unión indeseable de interacciones no específicas de proteínas o moléculas de ADN en la superficie. En segundo lugar, las moléculas de ADN se biotinilan mediante dos métodos diferentes en función de sus terminales. El ADN de extremo romo se marca con dUTP biotinilado en su extremo hidroxilo 3', por transferasa terminal, mientras que el ADN de extremo pegajoso se hibrida con oligonucleótidos complementarios biotinilados por ADN ligasa. Finalmente, un flujo de cizallamiento microfluídico hace que las moléculas individuales de ADN se estiren a sus longitudes de contorno completas después de ser teñidas con péptido fluorescente de unión proteína-ADN (FP-DBP).

Introducción

La visualización de grandes moléculas de ADN atados en superficies de vidrio o de talón se ha utilizado para la investigación de las interacciones ADN-proteína, la dinámica de proteínas sobre un sustrato de ADN, ^1,2 y física de polímeros. ^3,4 Una plataforma para grandes moléculas de ADN de una sola atados tiene unos pocos distinta ventajas en comparación con otros métodos de inmovilización de ADN. ⁵ en primer lugar, una molécula de ADN grande atado en la superficie tiene una conformación aleatoria bobina natural sin un flujo de cizallamiento, que es de importancia crítica para una proteína de unión a ADN de reconocer su sitio de unión....

Protocolo

1. ADN biotinilación

1. La biotinilación de ADN de extremos romos usando transferasa terminal (TdT)
   Nota: El uso de ADN T4 (166 kpb), que es un ADN de extremos romos.
   1. Añadir 5 l de 2,5 mM CoCl _2, 5 l de 10 x tampón de reacción, 0,5 l de 10 mM de biotina-11-dUTP, 0,5 l de transferasa terminal (10 unidades), y 0,5 l de ADN T4 (0,5 g / l) a la mezcla de reacción. Hacer a un volumen final de 50 l mediante la adición de 38,5 l de agua.
   2. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 1 hr.
      Nota: el tiempo de reacción extendido puede producir ADN de doble atado, es decir, es posible que biotinas et....

Resultados

La figura 1 muestra dos métodos de inmovilización de ADN diferentes en función de las estructuras terminales de la molécula de ADN. La Figura 1a ilustra cómo las moléculas de ADN de extremos pegajosos se hibridan con oligonucleótidos biotinilados complementarios, que están inmovilizados en la superficie PEG avidina-revestido. La Figura 1B muestra la adición de biotinilado ddNTP o dNTP para el grupo hidroxilo 3 'de un ADN de extremos romo.......

Discusión

Aquí presentamos una plataforma para la visualización de moléculas largas de ADN con biotina para el anclaje en las superficies. Hemos informado un enfoque para moléculas de ADN atados en una superficie recubierta de proteína de avidina con albúmina de suero bovino biotinilada. ⁶ En el enfoque anterior, se encontró una cuestión crucial de ADN foto-escisión causado por colorantes bis-de intercalación que manchan moléculas de ADN atado en el superficie. A medida que estos fluoróforos excitados continuamente tie.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1. Biotinilación de ADN
1.1) Biotinilación de ADN de extremo romo utilizando Transferasa Terminal (TdT)
	Nueva Inglaterra Biolabs	M0315S	Provisto de tampón de reacción 10x, 2,5 mM de cloruro de cobalto
Biotina-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotina-ddNTP También está disponible
T4GT7 Fago: ADN	Nippon Gen	318-03971
Ácido etilendiaminotetraacético	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) Biotinilación de ADN de extremo pegajoso Usando ADN ligasa
T4 ADN ligasa	New England Biolabs	M0202S	Provisto de tampón de reacción 10x
Lambda Phage DNA	Bioneer	D-2510	También disponible en New England Biolabs
2. Derivatización de superficie funcionalizada
2.1) Limpieza de pirañas
	Marienfeld-Superior 0101050		22 mm x 22 mm, espesor n.º 1
Bastidor			Fabricación personalizada Cinta
sellado de rosca de PTFE	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Teflon™
cinta Ácido sulfúrico	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4,
peróxido de hidrógeno de	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2, 35% en agua
Sonicator	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	Limpiador
2.2) Aminosilanización en superficie de vidrio
N-[3-(Trimetoxisilil)propil] etilendiamina	Sigma-Aldrich	104884
Ácido acético glacial	Duksan Chemicals	414	pureza del 99%
	Jin Chemical Co. Ltd.	M300318	pureza del 99,9%
	Qorpak	PLC-04907
Alcohol etílico	Jin Chemical Co., Ltd.	A300202	99.9% Pureza
2.3) PEGilación del cubreobjetos
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich	S5761
Filtro de jeringa	Sartorius	16534----------
Biotina-PEG-SC	Laysan Bio	Biotina-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
Acetona	Jin Chemical Co., Ltd.	A300129
Portaobjetos de microscopio	Marienfeld-Superior	1000612	~76 mm x 26 mm x 1  mm
3. Montaje de una cámara de flujo
		acrílico	Fabricación personalizada
Cinta de doble cara	3M		Tipo transparente
Epoxi de secado rápido	3M
Tubo de polietileno	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µ l Jeringa	Hamilton	81165
Bomba de jeringa New	Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. Carga de muestras en la cámara de flujo
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	Trizma
base Microscopio	Olympus	IX70
EMCCD	Camera Q Imaging	Rolera EM-C2
Láser de estado sólido (488  nm)	Oxxius	LBX488
Alconox	Alconox Inc.