La visualización de atado-gran superficie moléculas de ADN con un ADN Fluorescent Protein unión del péptido

Resumen

Presentamos un enfoque para visualizar grandes moléculas de ADN teñidas con péptido de unión al ADN de proteínas fluorescentes (FP-DBP) atadas a la superficie de vidrio recubierta de polietilenglicol (PEG) y avidina y estiradas con flujos de cizallamiento microfluídicos.

Resumen

Las grandes moléculas de ADN atadas a la superficie de vidrio funcionalizada se han utilizado en física y bioquímica de polímeros, particularmente para investigar las interacciones entre el ADN y sus proteínas de unión. Aquí, reportamos un método que utiliza microscopía fluorescente para visualizar grandes moléculas de ADN atadas en la superficie. En primer lugar, los cubreobjetos de vidrio se biotinilan y pasivan mediante un recubrimiento con polietilenglicol biotinilado, que se une específicamente al ADN biotinilado a través de enlazadores de proteínas avidina y reduce significativamente la unión indeseable de interacciones no específicas de proteínas o moléculas de ADN en la superficie. En segundo lugar, las moléculas de ADN se biotinilan mediante dos métodos diferentes en función de sus terminales. El ADN de extremo romo se marca con dUTP biotinilado en su extremo hidroxilo 3', por transferasa terminal, mientras que el ADN de extremo pegajoso se hibrida con oligonucleótidos complementarios biotinilados por ADN ligasa. Finalmente, un flujo de cizallamiento microfluídico hace que las moléculas individuales de ADN se estiren a sus longitudes de contorno completas después de ser teñidas con péptido fluorescente de unión proteína-ADN (FP-DBP).

Introducción

La visualización de grandes moléculas de ADN atados en superficies de vidrio o de talón se ha utilizado para la investigación de las interacciones ADN-proteína, la dinámica de proteínas sobre un sustrato de ADN, ^1,2 y física de polímeros. ^3,4 Una plataforma para grandes moléculas de ADN de una sola atados tiene unos pocos distinta ventajas en comparación con otros métodos de inmovilización de ADN. ⁵ en primer lugar, una molécula de ADN grande atado en la superficie tiene una conformación aleatoria bobina natural sin un flujo de cizallamiento, que es de importancia crítica para una proteína de unión a ADN de reconocer su sitio de unión. En segundo lugar, es muy fácil cambiar el entorno químico alrededor de moléculas de ADN para una serie de reacciones enzimáticas en una cámara de flujo. En tercer lugar, un flujo de cizallamiento de microfluidos induce ADN molecular de estiramiento hasta 100% de la longitud del contorno completo, lo cual es muy difícil de lograr con la elongación del ADN enfoques alternativos como la inmovilización superficie ⁶ y el confinamiento nanochannel. ⁷ A completamente stretched molécula de ADN también proporciona información de posición que puede ser útil para el seguimiento de los movimientos enzimáticas en el mapa genómico.

Sin embargo, el procedimiento de anclaje del ADN tiene un defecto crítico en que el colorante de intercalación tales como el YOYO-1 por lo general hace que las moléculas de ADN atados a ser fácilmente rotas por la luz de excitación de fluorescencia. En general, las grandes moléculas de ADN tienen que ser teñido con un tinte fluorescente para la visualización en un microscopio fluorescente. Para este fin, otros colorantes de la serie TOTO YOYO-1 o son principalmente usados ​​debido a que estos tintes son fluorescentes solamente cuando se intercalan DNA de doble cadena. ⁸ Sin embargo, es bien sabido que los bis-intercalantes colorante hace DNA inducida por la luz de foto-escisión porque de la intercalación de fluoróforos. ⁹ Además, las moléculas de ADN fluorescente manchadas atados en la superficie son más frágiles puesto que los flujos de cizallamiento pueden ejercer fuerzas de rotura en mover libremente moléculas de ADN. Por lo tanto, hemos desarrollado FP-PAD como una novela DNA-tinción de colorante de proteínas para obtener imágenes de grandes moléculas de ADN atados en la superficie. La ventaja de usar FP-DBP es que no causa foto-escisión de las moléculas de ADN al que se une. ¹⁰ Además, FP-DBP no aumenta la longitud de contorno de ADN, mientras que los colorantes bis-intercalantes aumentan la longitud de contorno en aproximadamente 33%.

Este método de vídeo introduce el enfoque experimental para la inmovilización de grandes moléculas de ADN a una superficie de PEG-biotina. La figura 1 ilustra los diferentes enfoques de la inmovilización de ADN con extremos romos y extremos pegajosos. Por lo tanto, este método de tinción se puede aplicar a cualquier tipo de molécula de ADN. La figura 2 muestra una representación esquemática del conjunto de cámara de flujo que puede ser controlado por una bomba de jeringa para generar flujos de cizallamiento para estirar las moléculas de ADN, así como para carga química y enzimática soluciones. la Figura 3 muestra micrografías de las moléculas de ADN completamente estirada atados en el PEGylated superficie ¹¹ y se tiñeron con FP-PAD.

Protocolo

1. ADN biotinilación

1. La biotinilación de ADN de extremos romos usando transferasa terminal (TdT)
   Nota: El uso de ADN T4 (166 kpb), que es un ADN de extremos romos.
   1. Añadir 5 l de 2,5 mM CoCl _2, 5 l de 10 x tampón de reacción, 0,5 l de 10 mM de biotina-11-dUTP, 0,5 l de transferasa terminal (10 unidades), y 0,5 l de ADN T4 (0,5 g / l) a la mezcla de reacción. Hacer a un volumen final de 50 l mediante la adición de 38,5 l de agua.
   2. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 1 hr.
      Nota: el tiempo de reacción extendido puede producir ADN de doble atado, es decir, es posible que biotinas etiquetados en ambos extremos.
   3. Detener la reacción mediante la adición de 5 l de 0,5 M EDTA, pH 8.
   4. Mantenga el tubo a 4 ° C.
2. La biotinilación de DNA de composición pegajosa Uso de ADN ligasa
   Nota: El uso λ DNA (48,5 kpb), que es un ADN de extremo cohesivo.
   1. Añadir 1 l de ADN ligasa de T4, 5 l de 10 x tampón de ligación, 1 l de 25 ng / l de ADN de fago λ, y añadir 43 l de agua para hacer un volumen final de 50 l.
   2. Mantenga el tubo a 4 ° C.

2. La derivación de superficie funcionalizado

Nota:. Con el fin de atar un extremo de una molécula de ADN en la superficie de vidrio, un grupo amina primaria se silanizada en un cubreobjetos, seguido de recubrimiento con biotina PEG como se muestra en la Figura 1 Este proceso PEGilación es importante para la formación de imágenes de ADN de una sola molécula porque puede reducir significativamente el ruido aleatorio creado por la unión de moléculas no deseadas en la superficie.

1. Piranha limpieza
   Nota: Las soluciones Piranha reaccionan violentamente con materiales orgánicos, por lo que debe ser manejado con cuidado, siguiendo las directrices de seguridad adecuadas.
   1. Lugar cubreobjetos sobre una rejilla de politetrafluoroetileno (PTFE), y los mantienen by cinta de PTFE sello de rosca a lo largo, la mitad en el borde de las superficies y la otra mitad en el estante. Después de envolver, deje una pieza larga (~ 5 cm) de cinta para el manejo del soporte durante el procedimiento de limpieza.
   2. Llenar un vaso de vidrio de 1 litro con 350 ml de H ₂ SO ₄ y 150 ml de H ₂ O ₂ para hacer la solución piraña en una campana de humos. Coloque la parrilla en solución Piranha durante 2 horas.
   3. solución vacío piraña del vaso de precipitados, y cubreobjetos de enjuague a fondo con agua desionizada hasta que el pH del agua en el vaso alcanza neutro. Utilice tiras de papel de pH.
   4. Sonicar los bastidores de cubierta se desliza en el agua vaso de precipitados que contiene, por 30 min. Vaciar el agua del vaso justo antes de amino silanización. Utilice 75 W de potencia de ultrasonidos para limpiar y derivar los sustratos de vidrio.
2. Aminosilanization sobre la superficie de cristal
   1. Añadir 2 ml de N - [3- (trimetoxisilil) propil] etilendiamina y 10 ml de ácido acético glacial a 200 mlde alcohol metílico en un recipiente de polipropileno limpio para la preparación de la solución aminosilanization.
   2. Colocar cubreobjetos limpios en el recipiente de polipropileno. Agitar ellos en 100 rpm y la temperatura ambiente durante 30 min.
   3. Someter a ultrasonidos el vaso con cubreobjetos derivatizados durante 15 min a 75 W. los agita a 100 rpm y la temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.
   4. Vaciar la solución del vaso de precipitados, y enjuague cubreobjetos con cuidado, una vez con alcohol metílico, y dos veces con alcohol etílico. cubreobjetos de las tiendas en alcohol etílico y los utilizan dentro de dos semanas.
3. PEGilación del cubreobjetos
   1. Hacer 10 ml de bicarbonato de sodio 0,1 M (NaHCO _3). Se filtra la solución con un filtro de jeringa de 0,22-micras.
   2. Disolver 2 mg de carbonato de biotina-PEG-succinimidilo (biotina-PEG-SC) y 80 mg de valerato de PEG-succinimidilo (mPEG-SVG) en 350 l de _NaHCO3. Use un tubo de protección de la luz.
   3. Vortex el tubo vigorosamente durante 10 seg, y se centrifuga al 10.000 × g durante 1 min para eliminar las burbujas.
   4. Enjuague un portaobjetos de vidrio con acetona, seguido de un enjuague con alcohol etílico. Deje que el portaobjetos se seque al aire completamente.
   5. Coloque una gota (50 l) de la solución de PEG en el portaobjetos de vidrio limpio. Cubrir la gotita suavemente con una hoja de la cubierta amino silanizada, sin generar burbujas.
   6. Colocar los portaobjetos durante 3 horas hasta toda la noche en un lugar oscuro, bien nivelados cámara húmeda a temperatura ambiente. Utilice un soporte de la punta de la pipeta vacía como la cámara, con agua en la parte inferior. Sellar solución de PEG residual en el tubo y se mantiene a 4 ° C.
   7. Enjuague el portaobjetos pegilado a fondo con agua desionizada. Almacenarlo en un lugar oscuro y seco hasta su uso.

3. Montaje de una cámara de flujo

1. Fabricar un soporte acrílico perforado, como en la Figura 2. Asegúrese de que el diámetro de la inserción de la tubería es 0,762 mm, y designar un agujero es una entrada y el otro esuna salida (Figura 2).
2. Coloque tiras adhesivas de doble cara de cinta (ancho 5-6 mm) en un soporte de acrílico (Figura 2), alineando perpendicularmente a un orificio de entrada y salida, no perturbar cualquier orificio del canal. Utilice estas tiras de cinta como las paredes de varios canales para hacer cámaras. Frote la cinta utilizando una punta de pipeta.
3. Colocar un cubreobjetos pegilado en la parte superior para hacer cámaras de flujo, con la cara hacia abajo pegilado.
4. Para evitar cualquier solución se produzcan fugas, presione la parte superior de un cubreobjetos sobre el área donde se colocan cintas de doble cara. Añadir pegamento de secado rápido epoxi para cerrar los bordes de la cámara en la parte superior y en la parte inferior (color amarillo en la Figura 2).
5. Conectar una pieza corta (2,5 cm) de tubo (diámetro externo, OD, 0,042 ") a una jeringa hermética a los gases y sellar la unión con pegamento de epoxi.
6. Conectar un tubo largo y flexible (OD: 0,03 ") a la tubería vinculada a la jeringa y sellar la unión con pegamento epoxi.
7. Llene el Tubing vinculada a la jeringa con agua DI. Asegúrese de que no hay burbujas de aire.
8. Introduzca el tubo en el orificio de la cámara de flujo sellado con pegamento de epoxi.
9. Coloque una punta amarilla (200 punta l) en el otro orificio como reservorio.

4. Carga de la muestra en la cámara de flujo

Nota: Neutravidina se puede sustituir con otras proteínas avidina como la estreptavidina. Todas las reacciones pueden realizarse a temperatura ambiente, a menos que se menciona. Tome la solución de la muestra en una punta amarilla, e instalar la punta con la solución sobre el agujero del soporte de acrílico (Figura 2b).

1. Ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 50 l / min. Carga de 20 l de proteína de avidina (25 mg / ml en solución T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), y mantenerla durante 10 minutos.
2. Carga de 20 l de oligodesoxinucleótidos con biotina (100 micras en 1 x TE), y mantenerla durante 10 minutos. Si se utiliza transferasa terminal, no realice la cargade oligodesoxinucleótidos.
3. Carga de 20 l de solución de ADN a partir del paso 1 en la cámara de flujo a un caudal de 10 l / min, y mantenerla durante 30 minutos.
4. Se lava la cámara de flujo con 1 x TE, y la carga de 40 l de FP-PAD ¹⁰ (~ 80 nm).
5. Observe ADN bajo un microscopio de fluorescencia con flujo continuo de moléculas de tinción en 1 x TE en una lente de objetivo 60X. Utilice 488 nm láser de estado sólido para la excitación de FP -DBP (EGFP). Para estiramiento completo de moléculas de ADN, aplicar diferentes velocidades de flujo de acuerdo con las longitudes de ADN utilizados. Por ejemplo, se aplican 50 l / min durante 48,5 kpb de ADN λ, y 100 l / min durante 166 kpb de ADN T4.
   1. Para el reciclaje del soporte de acrílico, remojo cámaras de flujo montados en una solución de detergente doméstico ^12. Retire las cintas y epoxi con una hoja de afeitar y frotar con las manos para tomar completamente apagado. Destapar los agujeros con agujas de jeringas. Mantener a los titulares en agua desionizada hasta su uso posterior.

Resultados

La figura 1 muestra dos métodos de inmovilización de ADN diferentes en función de las estructuras terminales de la molécula de ADN. La Figura 1a ilustra cómo las moléculas de ADN de extremos pegajosos se hibridan con oligonucleótidos biotinilados complementarios, que están inmovilizados en la superficie PEG avidina-revestido. La Figura 1B muestra la adición de biotinilado ddNTP o dNTP para el grupo hidroxilo 3 'de un ADN de extremos romo...

Discusión

Aquí presentamos una plataforma para la visualización de moléculas largas de ADN con biotina para el anclaje en las superficies. Hemos informado un enfoque para moléculas de ADN atados en una superficie recubierta de proteína de avidina con albúmina de suero bovino biotinilada. ⁶ En el enfoque anterior, se encontró una cuestión crucial de ADN foto-escisión causado por colorantes bis-de intercalación que manchan moléculas de ADN atado en el superficie. A medida que estos fluoróforos excitados continuamente tie...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1. Biotinilación de ADN
1.1) Biotinilación de ADN de extremo romo utilizando Transferasa Terminal (TdT)
	Nueva Inglaterra Biolabs	M0315S	Provisto de tampón de reacción 10x, 2,5 mM de cloruro de cobalto
Biotina-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotina-ddNTP También está disponible
T4GT7 Fago: ADN	Nippon Gen	318-03971
Ácido etilendiaminotetraacético	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) Biotinilación de ADN de extremo pegajoso Usando ADN ligasa
T4 ADN ligasa	New England Biolabs	M0202S	Provisto de tampón de reacción 10x
Lambda Phage DNA	Bioneer	D-2510	También disponible en New England Biolabs
2. Derivatización de superficie funcionalizada
2.1) Limpieza de pirañas
	Marienfeld-Superior 0101050		22 mm x 22 mm, espesor n.º 1
Bastidor			Fabricación personalizada Cinta
sellado de rosca de PTFE	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Teflon™
cinta Ácido sulfúrico	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4,
peróxido de hidrógeno de	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2, 35% en agua
Sonicator	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	Limpiador
2.2) Aminosilanización en superficie de vidrio
N-[3-(Trimetoxisilil)propil] etilendiamina	Sigma-Aldrich	104884
Ácido acético glacial	Duksan Chemicals	414	pureza del 99%
	Jin Chemical Co. Ltd.	M300318	pureza del 99,9%
	Qorpak	PLC-04907
Alcohol etílico	Jin Chemical Co., Ltd.	A300202	99.9% Pureza
2.3) PEGilación del cubreobjetos
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich	S5761
Filtro de jeringa	Sartorius	16534----------
Biotina-PEG-SC	Laysan Bio	Biotina-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
Acetona	Jin Chemical Co., Ltd.	A300129
Portaobjetos de microscopio	Marienfeld-Superior	1000612	~76 mm x 26 mm x 1  mm
3. Montaje de una cámara de flujo
		acrílico	Fabricación personalizada
Cinta de doble cara	3M		Tipo transparente
Epoxi de secado rápido	3M
Tubo de polietileno	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µ l Jeringa	Hamilton	81165
Bomba de jeringa New	Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. Carga de muestras en la cámara de flujo
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	Trizma
base Microscopio	Olympus	IX70
EMCCD	Camera Q Imaging	Rolera EM-C2
Láser de estado sólido (488  nm)	Oxxius	LBX488
Alconox	Alconox Inc.