Introduction
拴在玻璃或珠表面大DNA分子可视化的已被用于研究DNA底物，1,2-和高分子物理上DNA-蛋白质相互作用，蛋白质的动态。3,4-一种单-拴系的大的DNA分子平台有几个不同的相对于其他的DNA固定化方法的优点。5首先，拴表面上的大的DNA分子具有无剪切流，这是一种DNA结合蛋白识别其结合位点至关重要的自然随机卷曲构象。第二，这是很容易改变的周围的DNA分子的化学环境中的一系列流室酶反应。第三，微流体剪切流动诱导DNA分子伸展到全轮廓长度，这是非常困难的使用替代的DNA伸长达到100％的方法，如表面固定6和纳通道禁闭。7的充分stretcheD核酸分子也可提供一种可用于基因组图谱上监测酶促运动有用的位置信息。
然而，该DNA束缚方法在该嵌入染料的一个关键缺点如YOYO-1通常会导致拴系的DNA分子，以通过荧光激励光可容易地断裂。一般地，大DNA分子必须与用于可视化在荧光显微镜下的荧光染料染色。为了这个目的，YOYO-1或其它TOTO系染料主要使用，因为当它们相互插入双链DNA这些染料仅发出荧光。8然而，这是众所周知的，双-嵌入染导致光诱导的DNA光裂解因为荧光的嵌入。9。此外，拴在表面上的荧光染色的DNA分子更脆弱，因为剪切流动能发挥上自由移动的DNA分子破坏的力量。因此，我们开发的FP-DBP作为一种新颖的ðNA-染色染料蛋白成像拴在表面上大DNA分子。使用FP-DBP的优点是，它不会导致其所结合的DNA分子的光裂解。10此外，FP-DBP不增加DNA的轮廓长度，而双-嵌入染料增加轮廓长度由约33％。
此视频方法引入了对拴系大DNA分子的PEG生物素表面的实验方法。 图1示出了具有平端和粘性末端圈养的DNA的不同方法。因此，这种染色方法可以适用于任何类型的DNA分子： 图2示出了流室组件，其可通过注射泵来控制，以产生剪切流伸展的DNA分子以及加载的化学和酶的示意图的解决方案。 图3显示拴在PEGylat完全拉伸的DNA分子的显微照片ED表面11和FP-DBP染色。
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Protocol
1. DNA生物素
- 使用终端转移钝端DNA的生物素化（TDT）
注意：使用T 4 DNA（166千碱基），它是一个平端的DNA。- 添加2.5mM的5微升氯化钴，5微升10×反应缓冲液，0.5微升10毫摩尔生物素11-dUTP的的，末端转移0.5微升（10单位）和0.5微升的T4 DNA（0.5微克/微升）到反应混合物中。通过加入38.5微升的水使至50微升的最终体积。
- 孵育在37℃下将反应混合物1小时。
注：扩展反应时间可以得到两端-拴系的DNA， 即 ，它是可能的生物素的标签的两端。 - 停止加入5微升的0.5M EDTA，pH为8的反应。
- 保持管在4℃下。
- 粘端的DNA的生物素化利用DNA连接酶
注意：使用λ的DNA（48.5 kbp的），这是一种粘性末端的DNA。 <OL> - 加入1μlT4 DNA连接酶，5微升10×连接缓冲液，1μl的25纳克/微升λ噬菌体DNA，并加入43微升的水，使50微升的最终体积。
- 保持管在4℃下。
2.功能化表面衍生
注意：为了系绳在玻璃表面的DNA分子的末端，伯胺基团上的盖玻片随后生物素PEG涂层硅烷化， 如图1该PEG化过程是对单分子的DNA成像重要的，因为它可以显著减少通过在表面上不希望的分子的附着产生的随机噪声。
- 食人鱼清洗
注：食人鱼解决方案有机材料剧烈反应，因此应小心处理，遵循正确的安全准则。- 地方盖玻片上的聚四氟乙烯（PTFE）架，并把它们býPTFE螺纹密封带纵向，一半的表面的边缘和半机架上。包装后，留下带长片（约5厘米）的清洁过程中搬运机架。
- 填充1升的玻璃烧杯用350ml的H 2 SO 4和150ml 的 H 2 O 2，使在通风橱食人鱼溶液。放置在食人鱼溶液机架2小时。
- 从烧杯中空食人鱼溶液，并冲洗盖玻片用去离子水彻底直至烧杯中的pH值的水达到中性。使用pH试纸条。
- 超声处理盖玻片的齿条中的含烧杯水，30分钟。空水从烧杯中刚氨基硅烷化之前。使用75瓦超声功率的清洁和衍生的玻璃基板。
- Aminosilanization在玻璃表面
- 加的N 2毫升- [3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基]乙二胺和10毫升冰醋酸的200毫升在制备aminosilanization溶液清洁聚丙烯容器甲醇。
- 放置清洗盖玻片在聚丙烯容器中。在100rpm和室温下搅拌30分钟，摇动它们。
- 超声处理以衍生盖玻片烧杯15分钟，在75 W·摇动它们在100rpm和室温下至少30分钟。
- 用乙醇清空从烧杯中的溶液，并用甲醇小心冲洗盖玻片，一次，两次。在乙醇商店盖玻片并用它们在两周内。
- 盖玻片的PEG化
- 打10毫升0.1N 1M碳酸氢钠的（ 碳酸氢钠 ）。筛选具有0.22μm的注射器过滤该溶液。
- 溶解2mg的生物素的PEG琥珀酰亚胺基碳酸酯（生物素PEG-SC）和在350微升的NaHCO 3的80毫克聚乙二醇琥珀酰亚胺基戊酸（MPEG-SVG）的。使用光保护管。
- 涡管大力为10秒，和离心机它以10,000×g的1分钟以除去气泡。
- 冲洗用丙酮载玻片，随后用乙醇漂洗。允许幻灯片空气完全干燥。
- 将PEG溶液对干净的载玻片上滴（50微升）。与氨基硅烷化盖玻片轻轻盖上液滴，而不会产生任何气泡。
- 3小时到位幻灯片一夜之间在一个黑暗的，在室温下以及层次湿热试验箱。在底部用空枪头保持具腔室，用水。密封在管的残余PEG溶液，并保持它在4℃下。
- 用去离子水彻底冲洗PEG化盖玻片。在阴暗干燥处，直至使用存储。
3.组装流室
- 制造冲孔丙烯酸支架，如在图2中 。确保油管刀片的直径是0.762毫米，并指定一个孔是入口，而另一个是的出口（ 图2）。
- 放置双面胶带条上的丙烯酸类保持器（宽5-6毫米）（ 图2），垂直对准的入口和出口孔，不扰乱任何通道的孔。使用这些条带多通道的墙壁作室。磨砂使用吸管尖磁带。
- 放置在顶部的PEG化的盖玻片，使流动室，用PEG化面朝下放置。
- 为了防止任何溶液泄漏，按一个盖玻片在何处双面胶带被放置的区域的顶部。添加快干环氧树脂胶的顶部和底部（黄色图2），以关闭该室的边缘。
- 管（外径，OD，0.042“）的一段短（2.5厘米）连接到气密注射器和密封用环氧树脂胶关节。
- 长柔性管（外径：0.03“）连接到连接于注射器管和密封用环氧树脂胶关节。
- 填写TUBI纳克挂用DI水注射器。确保有没有气泡。
- 插入管子与环氧胶密封流动室的孔中。
- 放置一个黄色尖端（200微升尖端）上的另一孔作为贮存器。
4.样品装载到流动腔
注意：中性亲可以与其它抗生物素蛋白的蛋白质，如链霉抗代替。所有的反应可在室温下进行，除非它被提及。取在一黄色尖端样品溶液，并安装与溶液的前端到丙烯酸类保持器（ 图2b）的孔中。
- 以50μl/分钟设定的注射泵的流速。负载20微升抗生物素蛋白（在T50溶液25微克/毫升，三的10mM，氯化钠的50mM，pH8）中，并保持10分钟。
- 负载20微升生物素化寡核苷酸（100微米1×TE），并保持10分钟。如果使用终端转移，跳过加载寡核苷酸的。
- 负载20微升以10微升/分钟的流速从第1步到流动室DNA溶液，并保持30分钟。
- 用1×TE洗净流室，然后装入40微升FP-10 DBP（〜80纳米）。
- 在1×TE染色分子的连续流上的60X物镜的荧光显微镜下观察DNA。使用488纳米固态激光器FP（EGFP）-DBP的激励。对DNA分子的充分伸展，根据使用的DNA长度应用不同的流速。例如，应用50微升/分钟为48.5千碱基λ的DNA，和100微升/分钟的T4 DNA的166千碱基。
- 对于丙烯酸架 回收，浸泡组装流室在家用洗涤剂溶液12。取出胶带和环氧用刀片擦用手完全把他们赶走。疏通与注射器针头孔。保持在去离子水中保持器，直到进一步使用。
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Representative Results
图1示出了两个不同的DNA束缚方法依赖于DNA分子的末端结构。 图1a示出了粘端的DNA分子是如何与互补的生物素化的寡核苷酸，其被固定在亲和素包被的PEG表面上进行杂交。 图1b，示出了另外的生物素化的ddNTP或的dNTP的3'羟基通过末端转移酶钝端DNA的基团。我们增加了DNA分子和生物素之间的柔性连接体。这增加了结扎和抗生物素蛋白-生物素结合效率，以提供反应足够的空间。 图1C演示了抗生物素蛋白涂覆的PEG表面上的DNA束缚的整体示意图。
图2描绘了用丙烯酸支架沿流室的组装。相比GLAS秒/石英载玻片，一个特制的丙烯酸类保持器简化了流动室供外延荧光显微镜的制备。12流动室使酶反应，6和伸展的DNA分子的缓冲液条件的即时变化。
图3显示单拴系的DNA和T4的λDNA用FP-DBP染色。微流体剪切流动起来拉长单个DNA分子全轮廓长度如16.5微米（48.5 kb的DNAλ0.34点¯x纳米）和56.4微米（166 KB T4 DNA点¯x0.34纳米）。我们能够在延长的期间（ 例如，半小时）重复DNA的拉伸和放松多次，因为我们采用的FP-DBP不引起光裂解。
图1的DNA束缚的示意图。 A）A Sticky端DNA杂交用生物素化的互补寡核苷酸。三甘醇是寡核苷酸和生物素。 二 ）生物素化的dNTP被添加到双链DNA的钝端，由末端转移酶之间的柔性接头。聚碳间隔物（11-原子）是的dNTP和生物素。 三 ）生物素化的DNA之间的柔性接头锚定于抗生物素蛋白的蛋白质，这是与生物素化的PEG共价键合到玻璃表面。生物素化PEG的正常PEG比率为0.025（1:40）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.流室。一个 ）流动腔室选自由丙烯酸树脂保持器的，双面胶带和PEG化的条带覆盖滑。尺寸76毫米×26毫米×5毫米（长x宽x高）的丙烯酸持有人，与激光切割制造二 ）流室的侧视图：打孔是在其上安装了一个黄色尖的入口缓冲液储，并连接到一个注射器泵控制的管的出口。 请点击此处查看该图的放大版本。
图与FP-DBP染色拉伸DNA分子的荧光3.显微图像。一个 ）λ噬菌体DNA（48.5 kbp的）与生物素化的互补寡核苷酸结扎后的表面上栓。 二 ）噬菌体T4 DNA（166千碱基）与末端转移加入生物素后拴的表面上。指示箭头显示DNA moleculES向上伸展自己的全轮廓长度如16.5微米的λDNA和56.4微米的T4 DNA。比例尺：10微米请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这里，我们提出了一个可视化的生物素锚定在表面上长的DNA分子的平台。我们已经报道了拴亲和素蛋白涂层表面与生物素牛血清白蛋白对DNA分子的方法。6在前面的方法，我们发现拴在造成染污DNA分子双插染料DNA光裂解的关键问题表面。由于这些不断激发荧光团有很高的概率攻击DNA磷酸骨架，9激发光功率必须最小化，以避免光裂解。
为了克服这种不便，我们开发了遗传工程与染色的DNA的DNA结合能力（FP-DBP）荧光蛋白，而不光裂解。10我们在抗生物素蛋白包被的蛋白表面观察可靠DNA染色。尽管如此，该平台对荧光蛋白的不希望的聚合的另一问题蛋白质表面，导致增加的背景噪声。以减少造成单分子DNA分析该随机噪声来增强DNA和蛋白质的从背景的对比度是必需的。因此，使用FP-DBP的需要表面钝化，以防止荧光蛋白被吸附在表面上。 PEG可以是用于此目的的有力候选。12因此，我们使用生物素化的PEG，这大大增强了信噪比为拴的表面上成像的FP-DBP染色的DNA分子。
有这种方法更高的产量几个关键步骤和注意事项。为了系绳在玻璃表面上的DNA分子的末端， 如图1的伯胺基团上的盖玻片随后生物素PEG涂层硅烷化。这种表面的钝化处理是对单分子的DNA成像关键的，因为它可以显著降低表面上产生噪声的随机吸附作用。因此，强烈建议在一夜之间aminosilanization和聚乙二醇化。此外，清洗载玻片以及玻璃盖用食人鱼溶液可以进一步降低背景噪音。
生物素化的寡核苷酸必须有5磷酸基团'端，以便将其链接到3'羟基的大DNA分子。生物素化的寡核苷酸的序列是5'-P-GGGCGGCGACCT-TEG生物素-3'为λ的DNA的束缚。的λ的DNA溶液具有λ的DNA溶液（在1.1中描述）的制备后不久加载，因为λ的DNA经常形成连环体与储存时间长。对于钝端DNA，如T4 DNA，末端转移酶可以在DNA两端添加生物素化dUTPs无任何特异性。因此，末端转移酶反应时间有一个小时左右仔细调整，否则延长反应可产生双标记的DNA（ 即 ，两端用生物素标记）。在加银行足球比赛到病毒DNA如λ和T4中，任何类型的DNA可以在这个平台上被利用。然而，建议由稀土切割限制酶如SwaI位或NotI位消化后使用从巨大的基因组DNA片段。
不同的流速施加用于DNA的不同的长度。通常情况下，更长的DNA分子要求更快的流速，充分伸展的DNA分子，以匹配精确的轮廓长度。例如，λ的DNA可以伸展到16.5微米，其对应于0.34纳米的点¯x48,502 bp的计算值。
以刚准备好所有材料，特别是所有的蛋白质和的PEG是非常重要的。例如，中性容易失去其的，如果它被存储作为稀释溶液结合生物素的功能。对于PEG溶液，pH值是至关重要的缀合的伯胺和正 - 羟基琥珀酰亚胺官能团。因此，建议在至少每周新鲜制备的所有材料。
拴在表面上大DNA分子可视化是要应用于各种应用，如基因组学，表观基因组，对于DNA和蛋白质相互作用的生化研究，和聚合物物理学研究一个通用平台。然而，该方法是目前只限于使用相对简单的和公知的DNA分子系统建模如病毒基因组。要延伸到人类基因组和表观基因组，它建立了坚固的，可靠的，简单的平台，对实际使用是非常重要的。通过克服光诱导的DNA光裂解，并防止荧光蛋白的随机吸附的表面上，该平台因此提供了与剪切流动细长的DNA清晰和高对比度的图像。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. DNA Biotinylation | |||
| 1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT) | |||
| Terminal Transferase | New England Biolabs | M0315S | Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride |
| Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP is also available |
| T4GT7 Phage DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| 1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | Provided with 10x reaction buffer |
| Lambda Phage DNA | Bioneer | D-2510 | Also available at New England Biolabs |
| 2. Functionalized Surface Derivatization | |||
| 2.1) Piranha Cleaning | |||
| Coverslip | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness |
| Teflon rack | Custom Fabrication | ||
| PTFE Thread Seal Tape | Han Yang Chemical Co. Ltd. | 3032292 | Teflon™ tape |
| Sulfuric acid | Jin Chemical Co. Ltd. | S280823 | H2SO4, 95% Purity |
| Hydrogen peroxide | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H2O2, 35% in water |
| Sonicator | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | Table-top Ultrasonic Cleaner |
| 2.2) Aminosilanization on Glass Surface | |||
| N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine |
Sigma-Aldrich | 104884 | |
| Glacial Acetic Acid | Duksan Chemicals | 414 | 99% Purity |
| Methyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | M300318 | 99.9% Purity |
| Polypropylene Container | Qorpak | PLC-04907 | |
| Ethyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | A300202 | 99.9% Purity |
| 2.3) PEGylation of the coverslip | |||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe Filter | Sartorius | 16534----------K | |
| Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| Acetone | Jin Chemical Co. Ltd. | A300129 | 99% Purity |
| Microscope Slides | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~76 mm x 26 mm x 1 mm |
| 3. Assembling a Flow Chamber | |||
| Acrylic Support | Custom Fabrication | ||
| Double-sided Tape | 3M | Transparent type | |
| Quick-dry Epoxy | 3M | ||
| Polyethylene Tubing | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
| Gas Tight 250 µl Syringe | Hamilton | 81165 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| 4. Sample Loading into Flow Chamber | |||
| Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma base |
| Microscope | Olympus | IX70 | |
| EMCCD Camera | Q Imaging | Rolera EM-C2 | |
| Solid-state Laser (488 nm) | Oxxius | LBX488 | |
| Alconox | Alconox Inc. | ||
References
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