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Artículo de método

Determinación de Biofilm Iniciación, el virus de las células infectadas por bacterias y hongos

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DOI:

10.3791/54162

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6 de julio de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Midwestern University

En este artículo

Resumen

En este documento se describe un método para la determinación de la asociación y competencia entre reinos (bacteriana y fúngica) por la adherencia a las monocapas de células HeLa infectadas por virus. Este protocolo puede extenderse a múltiples combinaciones de procariotas, eucariotas y virus.

Resumen

El estudio de las interacciones polimicrobianas a través de los reinos taxonómicos que incluyen hongos, bacterias y virus no se han examinado previamente con respecto a cómo los miembros virales de la microbioma afectan las interacciones microbio posteriores con estas células huésped infectadas por virus. La cohabitación de virus con bacterias y hongos es principalmente presente en las superficies de la mucosa de la cavidad oral y el tracto genital. células de la mucosa, particularmente aquellos con infecciones virales latentes crónicas o persistentes persistentes, podrían tener un impacto significativo en los miembros de la microbioma través de la alteración del virus en el número y tipo de receptores expresados. Modificación en la arquitectura de la membrana de la célula huésped se traduciría en la capacidad alterada de los miembros posteriores de la flora normal y patógenos oportunistas para iniciar el primer paso en la formación de biopelículas, es decir, la adhesión. Este estudio describe un método para la cuantificación y control visual del efecto de HSV en el inicio de biofilm formación (adherencia) de S. aureus y C. albicans.

Introducción

El microbioma humano incluye diversos organismos de varios reinos taxonómicos que comparten regiones geográficas en el cuerpo. La adherencia a las superficies celulares es un primer paso esencial en la formación de biopelículas, que es parte del proceso de colonización microbioma. Incluido en el microbioma puede haber virus que causan infecciones crónicas y persistentes. La infección de células crónica por estos virus puede causar una alteración en la disponibilidad del receptor putativo. 1,2 Además, la entrada de la célula por patógenos intracelulares también podría afectar a la fluidez de membrana host / hidrofobicidad que a su vez puede alterar la unión de otros miembros microbioma, incluyendo bacterias y hongos . Con el fin de entender las interacciones que pueden ocurrir entre estos múltiples patógenos que co-localizar en las mismas regiones geográficas del huésped humano, debemos ser capaces de estudiar la interacción de los agentes patógenos que representan el espectro de los reinos taxonómicos presentes en la superficie de la mucosa.

t "> El Herpesviridae son una familia de microbios presentes en el 100% de los seres humanos como miembros permanentes del microbioma 3,4. Además, pueden también ser derramada persistente tanto en presencia como en ausencia de síntomas. En concreto, el virus herpes simplex-1 y herpes simplex virus-2 (HSV-1 y HSV-2, respectivamente) son miembros permanentes del microbioma en el oronasopharynx y el tracto genital. en individuos inmunocompetentes, tanto HSV-1 y HSV-2 causa gingivoestomatitis, así como el herpes genital 5-8. en estos sitios, el VHS causa una infección latente, caracterizada por necrosis tumoral asintomática crónica persistente derramamiento viral 9. entrada del VHS en células da lugar a alteraciones en la expresión superficial de nectins, sulfato de heparán, balsas de lípidos y herpesvirus mediador de la entrada / receptor del factor de (HVEM / TNFr) 10-25. Estos receptores representan potencialmente compartidos para algunas bacterias y hongos, por ejemplo, S. aureus y C. albicans, que mientras que los patógenos oportunistas,También puede residir en calidad de miembros de la mucosa del microbioma oronasopharynx 26,27. Dentro de la oronasopharynx S. aureus y C. albicans ocupan dos sitios distintos de la colonización. En los anfitriones con los dientes naturales, la mucosa oral es compartida por HSV-1 y C. albicans, mientras que los orificios nasales nasal anterior están ocupados por S. aureus 28. Sin embargo, a pesar de los hallazgos in vitro que S. aureus se adhiere a las células epiteliales de la boca, 29,30 S. aureus es poca frecuencia aisladas de muestras orales cuando está presente el tejido normal 29,30. Poco se sabe en relación con nichos tracto genital co-colonización más allá de los hallazgos clínicos que S. aureus se asocia con la vaginitis aerobia, que se caracteriza por la inflamación genital, la descarga y la dispareunia, mientras que C. albicans produce lesiones de la mucosa similar a la observada en la cavidad oral 31-35. Por lo tanto, aunque estos miembros de la microbi oral y genitalome reinos taxonómicos transversales poco se conoce acerca de su interacción ya que afecta a su capacidad para iniciar la formación de biopelículas mediante la adhesión a la superficie de la célula huésped 5. Este protocolo se ha aplicado de manera efectiva para determinar las consecuencias funcionales de co-colonización / infección.

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Protocolo

1. HSV Cepas y Manipulación

Nota: Recombinante la no propagación de HSV-1 (KOS) gL86 y HSV-2 (KOS) 333gJ - con el reportero de la actividad de beta-galactosidasa utilizado fueron proporcionados por V. Twiari 36,37.

  1. Utilice virus de un solo lote y se almacena a -80 ° C, a una proporción de 1: 1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 20% (FBS) y leche descremada hasta su uso. Antes del almacenamiento mucho viral, determinar la concentración de virus por o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-Gal) ensayo.
  2. Determinar la viabilidad del virus y la multiplicidad de infección (MOI) por tinción con X-Gal para cada ensayo experimental usando el ensayo de la entrada del virus reportero, tal como se describe anteriormente (figura 1) 14.
  3. Diluir el virus (Opt-MEM) para MOI deseada. Fijar monocapas (paraformaldehído; 0,5 ml / pocillo) antes de la tinción. Coloque los controles de la viabilidad del virus en un microti separadater placa en paralelo con placas de ensayo polimicrobiana.

Manejo células HeLa 2. 299

  1. Crecer a 37 ° C, 5% de CO 2 en DMEM con 4,5 g / l de glucosa, 10% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), gentamicina (50 mg / ml) y L-glutamina. células de paso a 80% de confluencia con una solución de tripsina (ácido etilendiaminotetraacético, EDTA 0,53 M; 0,05% de tripsina; 5 ml / frasco).

3. C. Manipulación albicans

Nota: C. albicans obtenidos a partir de una fuente de laboratorio clínico se almacena a -80 ° C en Remmel leche descremada 2x medio.

  1. Cultura congelado Stock en Sabouraud Dextrosa Medio (37 ° C). Después de 24 horas la subcultura C. albicans sobre medio Fungisel (37 ° C; 48 hr) para su uso.
  2. Generar tubo germinal (GT) (formas recoger colonias representativas, 3 ml de FBS; 3 h; 37 ° C; Abs 600, 0,3). Después de la incubación, lavar GT (HBSS; 2x; 4.000 xg). Añadir GT lavado para HBSS calentado (37 y# 176; C; 0,32 Abs 600). formas GT debería ser el 99% de las células observadas según lo determinado por conteo de hemocitómetro.
  3. Hacer suspensiones forma de levadura (FA) de acciones por recoger colonias representativas Fungisel (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Contar el número de formas de YF / ml al microscopio utilizando un hemocitómetro. formas de fiebre amarilla deben ser del 99% de las células observadas según lo determinado por conteo de hemocitómetro.
  4. Hacer trabajo stock fúngica (250 l de GT o YF social en 25 ml de HBSS; 37 ° C; 10 5 UFC / ml)

4. S. Manipulación aureus

  1. Tienda S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel descremada leche 2x). Cultura en agar sangre de carnero (5%; 37 ° C; 24 h). Recoger colonias y traslado al manitol sales de medio plazo de 2 días para la acción (37 ° C; 18 h).
  2. Hacer S. aureus suspensión de acciones (3 ml de HBSS; 1,32 Abs 600; 10 8 UFC / ml)
    1. Hacer trabajar S. aureus acciones (100 lde las acciones en 25 ml de HBSS; 10 5 CFU / ml).

5. Candida y S. aureus Suspensiones

  1. Hacer mixta C. albicans y S. suspensión aureus (250 YF l o GT de valores y 100 l de S. aureus de valores en 25 ml de HBSS).

6. Ensayo polimicrobiana Biofilm

  1. Y placas de semillas 96 con 200 l de 2 x 10 5 HeLa células / ml (85% de nivel de confluencia). Placas de roca (30 - 45 min; 37 ° C) antes de la incubación (37 ° C; 5% de CO2; 18 h). Lavar las monocapas (1x; Opt-MEM) a continuación de la semilla con el HSV (HSV-1 (KOS) gL86 o HSV-2 (KOS) 33 GJ - en 100 l Opt-MEM; MOI 50 y 10). Incubar las placas (3 hr; 37 ° C; 5% de CO 2). Utilice sólo una cepa viral por día.
  2. Lavar monocapas infectadas (1x; salina tamponada con fosfato (PBS) con Mg 2 y Ca 2; 100 l). Reemplazar PBS con HBSS caliente dejando 25 & #181; l en cada pocillo.
    1. Añadir YF, GT y / o S. aureus suspensiones de trabajo (100 l; diana a células ratio = 5: 1; n = 16). tal como se indica en la Tabla 1 (Incubar las placas estáticas; 30 min; 37 ° C; 5% de CO 2).
  3. Después de la incubación, aspirar una columna en un momento inmediatamente rellenado con 300 l de PBS con Mg + 2 y Ca + 2. Repita este paso dos veces y luego añadir tampón de lisis de ensayo de radio-inmunoprecipitación (RIPA, filtro esterilizado; 200 l de una dilución 1:50).
  4. Rápidamente Se tritura el lisado de células HeLa a continuación, colocar 50 l en sales de manitol (MS) y medios de comunicación / o Fungisel (F) (Figura 2). Extender el lisado utilizando una varilla de vidrio doblado en un ángulo de 90 °. Se incuban las placas (18 horas a 37 ° C). contar manualmente el número de colonias por placa. Los controles consisten de S. aureus y / o C. albicans adherencia a las células HeLa no infectadas por VHS.

7. Estudios de Imagen

  1. Lavar cada cubreobjetos circular de vidrio (12 mm; 50 ml de acetona en 100 ml vaso de precipitados). cubreobjetos secos y esterilizar (Kimwipes; placas de Petri de vidrio). Coloque cubreobjetos estériles secos en los pocillos de placas de 24 pocillos estériles con pinzas esterilizadas alcohol de llama.
  2. Añadir células HeLa (1 ml; volumen 5x utilizado para placas de 96 pocillos) a los pocillos de placas de 24 pocillos que contienen los cubreobjetos de vidrio redondos estériles lavados. Añadir los virus, bacterias y hongos de acuerdo con la plantilla (Tabla 2) en 5x el volumen utilizado para las placas de 96 pocillos, a continuación, se incuba y el proceso tal como se describe en los pasos 6.2.1 a 6.4 anteriormente.
  3. Después del lavado final, fijar las células para microscopía inundando la corredera con metanol y permitiendo que se evapore. Almacenar las placas a temperatura ambiente hasta que la tinción.
  4. Para la microscopía de campo brillante (1,000x aumento original final) llenar los pocillos que contienen cubreobjetos fijados con metanol con agua desionizada. Inmediatamente aspirar agua. Cubra cada cubreobjetos con Gramos violeta cristal. Lave cubreobjetos libre de mancha no ligada (agua desionizada). Cubreobjetos secos in situ a continuación, se adhieren con medio a una diapositiva de marcado de montaje conjunto duro (Figura 3).
  5. Para la microscopía (objetivo 100x; 1,000x definitiva inicial de aumento) fluorescente de lavado cubreobjetos libre de metanol esencialmente como se describe en el paso 7.4. Seque los cubreobjetos en los pocillos.
    1. Después del secado, retire la cubierta se desliza y colocarlos en portaobjetos etiquetados. A continuación, añadir una cantidad suficiente de 1:20 dilución de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado con virus herpes simplex tipo 1 + 2 anticuerpo gD para cubrir el cubreobjetos (1-5 l).
    2. Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda a 37 ° C durante 30 minutos. Después de la incubación, lavar los cubreobjetos en 4 cambios de PBS.
    3. Después del lavado final, devuelva el cubreobjetos al portaobjetos etiquetados. Manchar con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI; cámara de humedad, 37 ° C durante 30 minutos). Después de incubación, lavar los cubreobjetos en 4 Changes de PBS, a continuación, adhiera a la diapositiva etiquetados con juego duro medio de montaje.
    4. Dejar que el medio de montaje para curar durante 24 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Examinar los cubreobjetos bajo petróleo objetivo ya sea en un microscopio de campo claro o microscopio de fluorescencia con filtros de corte FITC y DAPI. Examinar imágenes de al menos 50 campos (100 células por mínima organismo) para la co-localización (Figura 4).

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Resultados

El nivel de fiabilidad de los datos que se pueden obtener a partir sistema descrito en este informe se muestra en la Figura 2 af 38. Mediante el uso de este sistema de la modulación de la interacción de estafilococos y hongos con las células infectadas por virus y sus efectos en la adherencia de cada uno puede ser delineado. Estos tipos de estudios requieren el examen microscópico de la interacción tal como se muestra en las figuras 3 y

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Discusión

Actualmente no hay información disponible sobre las interacciones complejas entre permanente a los miembros semi-permanentes del microbioma de acogida que se cruzan múltiples dominios taxonómicos, es decir, procariotas, eucariotas y virales. Por lo tanto, hemos desarrollado un novedoso sistema de modelo in vitro para estudiar la iniciación del biofilm por S. aureus y C. albicans en HSV-1 o HSV-2 infectadas 229 células HeLa (HeLa) 38. El sistema modelo de células He...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este proyecto fue apoyado por la Oficina de Investigación y Programas Patrocinados (ORSP) de la Universidad del Medio Oeste, y la Facultad de Medicina Dental de la Universidad del Medio Oeste-Illinois (CDMI).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
C.albicans
BBL Sabouraud DextrosaBD211584
Agar Fungisel DotScientific7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar TroyBiologicals7143B
Agar sangre de ovejaTroy Biologicals221239
Hela cells
1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, con 4,5 g/L de glucosa y L-glutamina, sin piruvato de sodioCorning10-017-CM
Gentamicina 50 mg/mlSigma139750 µ concentración final g/ml en la solución completa DMEM
Trypsina EDTA (0,05% Trypsin, 0,53 M EDTA)Solution 1xCorning25-052-CI
Suero Fetal BovinoBiologicalsS11150Concentración final del 10% en el medio DMEM
fuerte>Otro completo y reactivos
ONPGThermo Scientific34055
Ultra-Pure X galInvitrogen15520-018
1x HBSS (Solución salina equilibrada de Hanks)Corning20-021-CV
1x PBSDot Scientific30042-500
RIPA LysisLife Technologies89901
Staining
MethanolFisher ScientificA433P-4
HSV 1& 2, específico para gDViroStat196
DAPISIGMAD8417-5MG
Gram Crystal VioletTroy Biologicals212527
Suministrosplaca de
Petri 100 x 15Dot Scientific 229693 
Placa de Petri 150 x 15Kord Valmark2902
Placas de 96 pocillosEvergreen Scientific222-8030-01F
Placas de 24 pocillosEvergreen Scientific222-8044-01F
Tubos de cultivo 100 x 13Thomas Scientific9187L61
Círculos deslizantes de cubierta, 12 mmDeckglaserCB00120RA1
Atlanta <

Referencias

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