Un protocolo desplegable ARN se optimiza aquí para la detección de interacciones entre proteínas de unión a ARN (prácticas comerciales restrictivas) y no codificante, así como los ARN de codificación. Un fragmento de ARN de receptor de andrógenos (AR) se utilizó como un ejemplo para demostrar cómo recuperar su RBP de lystate de adipocitos marrones primarios.
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Artículo de método
La detección de las proteínas de unión a ARN por
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Resumen
Resumen
proteínas de unión a ARN (prácticas comerciales restrictivas) están emergiendo como una capa de regulación en el desarrollo y la función del tejido adiposo. Prácticas comerciales restrictivas juegan un papel clave en la regulación de la expresión génica a nivel posttranscriptional al afectar la eficiencia de la estabilidad y de la traducción de ARNm diana. técnica desplegable RNA ha sido ampliamente utilizado para estudiar la interacción de ARN-proteína, que es necesaria para dilucidar el mecanismo de la función de las prácticas comerciales restrictivas ", así como largos ARN no codificante" (lncRNAs) subyacente. Sin embargo, la alta abundancia de lípidos en los adipocitos plantea un desafío técnico en la realización de este experimento. Aquí un protocolo desplegable ARN detallada está optimizado para el cultivo de adipocitos primaria. Un fragmento de ARN a partir de (AR) 3 'no traducida del receptor de andrógenos (3'UTR) que contiene un elementwas adenilato-uridylate ricos utilizados como un ejemplo para demostrar cómo recuperar su socio RBP, proteínas Hur, de lystate adipocito. El método descrito aquí se puede aplicar para detectar las interacciones entrePrácticas comerciales restrictivas y ARN no codificantes, así como entre las prácticas comerciales restrictivas y ARN de codificación.
Introducción
Prácticas comerciales restrictivas son proteínas que se unen al ARN de doble o de cadena sencilla en las células y participan en la formación de complejos de ARN-proteína. Las prácticas comerciales restrictivas pueden unir una variedad de especies de ARN, incluyendo ARN no codificantes de ARNm y largos (lncRNAs), y ejercer su influencia a nivel post-transcripcional. Ambas prácticas comerciales restrictivas y lncRNAs están surgiendo como nuevos reguladores en el desarrollo adiposo y funcionan 1,2,3. Para entender el mecanismo de RBP- y regulación lncRNA mediada de vías celulares, a menudo es necesario para detectar la interacción entre una molécula de ARN e....
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Protocolo
NOTA: El ARN de interés en el contexto de este estudio es un fragmento de AR 3'UTR.
1. Preparación de ARN marcado con biotina
- Para obtener el ARN, amplificar T7-AR-oligo por PCR, seguido por la transcripción in vitro utilizando un kit comercial y siguiendo las instrucciones del fabricante 11.
NOTA: Los cebadores para PCR se enumeran en la Tabla 4: T7-AR-F y T7-AR-R. - Para el control de la unión no específica, amplificar una secuencia parcial del ADN de luciferasa de luciérnaga (FL) mediante PCR a partir psiCHECK-2 plásmido, seguido por la transcripción <....
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Resultados
En este experimento de demostración, un fragmento de ARN AR se utilizó como cebo para capturar su proteína de unión Hur. Tanto un ARN cebo FL que no es relevante para la proteína Hur, y una alícuota de perlas de estreptavidina en blanco no conjugados sirvieron como controles negativos. interacciones ARN-proteína puede ocurrir ya sea en el núcleo o citoplasma, y este protocolo desplegable se puede aplicar a total o fraccionado lisados celulares (citoplásmicos o nuclear). Análisis de p.......
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Discusión
lncRNAs y las prácticas comerciales restrictivas tienen un papel vital en la salud y la enfermedad, sin embargo los mecanismos moleculares de estas moléculas son poco conocidos. Identificación de proteínas que interactúan con moléculas lncRNA es un paso clave para dilucidar los mecanismos de regulación. El enriquecimiento de las prácticas comerciales restrictivas por el sistema de ensayo desplegable ARN se basa en la captura en solución de interactuar complejo de manera que las proteínas de un lisado de células se puede.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por Singapur NRF comunión (NRF-2011NRF-NRFF001-025), así como CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Principales materiales utilizados en este estudio. | |||
| MEGAscript kit | Ambion | ||
| Biotina-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway columnas de centrifugación | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 Estreptavidina | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Cabra anti-ratón IgG-HRP (sc-2005) | Cruz Biotechnology | ||
| (sin nucleasas) | HyClone | ||
| solución salina (1&veces; PBS) | Inhibidor | ||
| Inhibidor | |||
| Sigma | |||
| Pfu Turbo ADN polimerasa | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| Name | Company | >Número de catálogo | Comentarios |
| Equipo principal utilizado en este estudio. | |||
| Centrífuga Sorvall Legend Micro 21R | Centrífuga Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R | Termociclador Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Rotor Thermo Scientific | ||
| BOECO Multi Bio RS-24 | BOECO,Alemania | ||
| Aparato de electroforesis y transferencia de gel de proteínas | Imán Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 | Tecnologías de la Vida |
Referencias
- Huot, M. É, et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
- Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 8/20/2016. Citeable Link.
A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally
