Se describen dos ensayos para el cribado de alto rendimiento basado en microscopía de los factores del huésped implicados en la infección por Brucella. El ensayo de entrada detecta los factores del huésped necesarios para la entrada de Brucella y el ensayo de punto final los necesarios para la replicación intracelular. Si bien es aplicable para enfoques alternativos, el cribado de siRNA en células HeLa se utiliza para ilustrar los protocolos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Los ensayos basados en la microscopía para la selección de alto rendimiento de los factores del huésped que participan en
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Las especies de Brucella son patógenos intracelulares facultativos que infectan a los animales como sus huéspedes naturales. La transmisión al hombre es más comúnmente causada por el contacto directo con animales infectados o por la ingestión de alimentos contaminados y puede conducir a infecciones crónicas graves.
Brucella puede invadir las células fagocíticas profesionales y no profesionales y replica dentro del retículo endoplasmático (ER) -derivado vacuolas. Los factores del huésped requeridos para entrar en las células huésped Brucella, la evitación de la degradación lisosomal, y la replicación en el compartimiento ER-como siguen siendo en gran parte desconocido. A continuación se describen dos ensayos para identificar los factores del huésped implicados en la entrada de Brucella y replicación en células HeLa. Los protocolos describen el uso de ARN de interferencia, mientras que los métodos de detección alternativos se podrían aplicar. Los ensayos se basan en la detección de bacterias marcadas con fluorescencia en la etiqueta fluorescente células huésped utilizando automatizadoLa microscopía de campo amplio. Las imágenes fluorescentes se analizaron mediante un análisis de tuberías imagen normalizada en CellProfiler que permite solo de puntuación infección basado en células.
En el ensayo de punto final, la replicación intracelular se mide dos días después de la infección. Esto permite que las bacterias tráfico a su nicho replicativo en que se inicia la proliferación alrededor de 12 horas después de la entrada de bacterias. Brucella que se han establecido con éxito un nicho intracelular se hace un enérgico han proliferado en el interior de las células huésped. Puesto que las bacterias intracelulares serán más numerosos que en gran medida las bacterias no replicativos extracelulares o intracelulares individuales, una cepa que expresa constitutivamente GFP se puede utilizar. La señal de GFP fuerte se utiliza entonces para identificar las células infectadas.
Por el contrario, para el ensayo de entrada es esencial diferenciar entre intracelular y las bacterias extracelulares. Aquí, se utiliza una codificación de cepa para una GFP inducible por tetraciclina. Inducciónde GFP con la inactivación simultánea de bacterias extracelulares por gentamicina permite la diferenciación entre intracelular y bacterias extracelulares en base a la señal de GFP, con sólo las bacterias intracelulares ser capaz de expresar GFP. Esto permite la detección robusta de bacterias intracelulares individuales antes de que se inicie la proliferación intracelular.
Introducción
Las especies de Brucella son gram-negativos, patógenos intracelulares facultativos pertenecientes a la clase de α-proteobacterias. Causan abortos e infertilidad en sus huéspedes naturales tales como vacas, cabras, ovejas o que resulta en graves pérdidas económicas en las zonas endémicas. La brucelosis es una de las enfermedades zoonóticas más importantes en todo el mundo que causan más de medio millón de nuevos casos de infección humana por año 1. La transmisión a humanos es causada generalmente por el contacto directo con animales infectados o por la ingestión de alimentos contaminados, tales como la leche no pasteurizada. Los síntomas d....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Nota: Todo el trabajo con cepas de Brucella abortus en vivo debe ser realizado dentro de un laboratorio de bioseguridad de nivel 3 (NBS3) teniendo en cuenta todas las normas requeridas y las precauciones de seguridad.
1. Preparación de las placas de detección y cultivo de bacterias y células
- Preparación de Brucella abortus cultivos iniciadores
- Racha de Brucella abortus 2308 (B. abortus) de -80 ° C leche stock en una placa de agar tripticasa de soja (TSA) que contiene 50 mg / ml de kanamicina (TSA / Km). Incubar la placa durante 3-4 días a 37 ° C. Utilice Brucella abortus cep....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La Figura 1A muestra un ejemplo de análisis de imágenes se utiliza para identificar automáticamente las células infectadas en el ensayo de punto final. se identificaron núcleos de las células HeLa teñidas con DAPI, se calcularon una peri-núcleo de anchura 8 píxeles que rodea el núcleo, y un cuerpo celular Voronoi por extensión del núcleo por 25 píxeles. Puesto que las bacterias proliferan principalmente en el espacio peri-nuclear, la intensidad de GFP en este área de la .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Los patógenos bacterianos han desarrollado numerosas estrategias para manipular las células huésped eucariotas en su beneficio. Los patógenos que causan infecciones agudas a menudo muestran una rápida proliferación que se acompaña de una alarma significativa del sistema inmunológico y pérdida de viabilidad de las células infectadas. Por el contrario, Brucella y otros patógenos que causan infecciones crónicas logran establecer interacciones duraderas dentro de las células huésped. Por lo tanto, las bacterias nece.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones 51RT 0_126008 y 51RTP0_151029 para los proyectos de Investigación y Desarrollo Tecnológico (IDT) InfectX y TargetInfectX, respectivamente, en el marco de SystemsX.ch, la Iniciativa Suiza para la Biología de Sistemas. Agradecemos las 310030B_149886 de subvenciones de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (SNSF). El trabajo de S.H.L y A.C. fue apoyado por el Programa Internacional de Doctorado "Fellowships for Excellence" del Biozentrum. Simone Muntwiler es reconocida por su asistencia técnica. Nos gustaría agradecer a Dirk Bumann por proporcionar pNF106 y a Jean Celli por pJC43 y pJC44.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar de soja tríptico (TSA) | BD | 236950 | |
| Caldo de soja tríptico (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Sulfato de kanamicina | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Leche | |||
| Frasco de 250 ml con tapón | de rosca Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Suero de ternera (FCS) | Gibco | 10270 | inactivada por calor |
| (0,5%) | Gibco | 15400-054 | 10x solución madre, diluida 1:10 en PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Se pueden utilizar dispositivos de recuento de células alternativos |
| Greiner CELLSTAR Placa de 384 pocillos | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Papel de aluminio pelable | Costar | 6570 | |
| Dispensador de reactivos: "Multidrop 384 Recomponent Dispenser" | puede utilizar el dispensador de reactivos | Thermo Scientific | 5840150 |
| Reactivo de transfección: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Lavadora de placas automatizada: "Lavadora de placas ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | Esta lavadora de placas contiene un colector de 16 canales adecuado para placas de 384 pocillos. Cabe en un armario de bioseguridad y tiene una tapa que cubre la placa durante el lavado, lo que reduce el riesgo de producción de aerosoles. Se pueden utilizar arandelas de placas alternativas con características similares. |
| gentamicina | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| clorhidrato de anhidrotetraciclina | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 μ La solución de g/ml en etanol al 100% se mantiene a -20 °C; C protegido de la luz en papel de aluminio |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | P6148 | Disolver en tampón HEPES de 0,2 M, pH 7,4. Almacenar a -20 ° C y descongele fresco el día antes de usar. Atención, el PFA es tóxico por inhalación, en contacto con la piel y si se ingiere. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| SiRNA Codificado | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP) | Construcción: pJC44 4 fue digerida con EcoRI seguida de la generación de extremos romos con enzima Klenov y posterior digestión con SalI. TetR-GFP se amplificó a partir de pNF106 utilizando los cebadores prAC090 y prAC092. Después de la digestión con SalI, el producto TetR-GFP se ligó al vector pJC44 digerido. | ||
| Imprimación prAC090 | Sigma-Aldrich | TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA | |
| ACC Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT | |
| TC HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress | Micro Molecular Devices | Microscopio | automatizado de imágenes celulares equipado con una etapa Z motorizada de precisión. Se pueden emplear sistemas alternativos para la microscopía automatizada y componentes alternativos para el hardware y el software que se especifican a continuación. |
| de enfoque automático láser de alta velocidad | 1-2300-1037 | ||
| CFI Super Fluor 10X objetivo | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20 mm, Prisma DIC: 10X, Fotometría con resorte |
| Cámara CCD monocromática CoolSNAP HQ | Dispositivos moleculares | 1-2300-1060 | 1.392 x 1.040 píxeles de imagen, 6,45 x 6,45 y micro; m píxeles, digitalización de 12 bits |
| Software MetaXpress | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X, V-XXX-YZ | , Motor ligero. Se utilizan las siguientes fuentes de luz: violeta (DAPI), cian (GFP), verde/amarillo (RFP) |
| Excitador de banda única para DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Emisor de banda única para DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| dicroico de banda única para DAPI | Semrock | FF409-DI03-25x36 | |
| Excitador de banda única para GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Emisor de banda única para GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| dicroico de banda única para GFP | Semrock | FF495-DI03-25x36 | |
| Excitador de banda única para RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Emisor de banda única para RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| dicroico de banda única para RFP | Semrock | FF593-DI03-25x36 |
Referencias
- Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
- Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
