Aquí presentamos un protocolo para la conversión directa de fibroblastos embrionarios murinos en células madre trofoblásticas completamente funcionales y estables mediante la sobreexpresión de diez días de Tfap2c, Gata3, Eomes y Ets2.
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Artículo de método
Protocolo para la conversión directa de murinos fibroblastos embrionarios en células madre Trofoblasto
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células madre trofoblasto (TSC) surgen como consecuencia de la primera decisión del destino celular en el desarrollo de los mamíferos. Ellos pueden ser cultivadas in vitro, que conserva la capacidad de auto-renovación y de diferenciarse en todos los subtipos del linaje trofoblasto, equivalente a la in vivo población celular que da lugar a la parte fetal de la placenta madre. Por lo tanto, TSC ofrecen un modelo único para estudiar el desarrollo placentario y embrionario frente a la decisión del destino celular extraembrionario in vitro. Desde la etapa de blastocisto en adelante, una barrera epigenética distinta que consiste en la metilación del ADN y las histonas modificaciones separa herméticamente ambos linajes. A continuación, se describe un protocolo para superar esta barrera totalmente por linaje transitoria sobre-expresión de trofoblasto reguladores clave TFAP2C, GATA3, Eomes y Ets2 en fibroblastos embrionarios murinos. Las células madre trofoblásticas inducidas son capaces de auto-renovarse y son casi idénticos a blastocisto células madre derivadas i trofoblaston términos de la morfología, la expresión del gen marcador y el patrón de metilación. Funcional in vitro y en ensayos in vivo confirman que estas células son capaces de diferenciarse a lo largo del linaje trofoblasto generación de células gigantes trofoblasto poliploides y chimerizing la placenta cuando se inyecta en blastocistos. La inducción de células madre trofoblasto de tejido somático abre nuevas vías para estudiar las características genéticas y epigenéticas de este linaje extraembrionario y ofrece la posibilidad de generar líneas de células madre trofoblasto sin destruir el embrión respectiva.
Introducción
Recientemente, un estudio comparativo de varios enfoques de células madre embrionarias de ratón para trofoblasto conversión de las células madre se ha puesto de manifiesto que en todos los sistemas analizados, la conversión linaje quedó incompleta. En lugar de células madre trofoblasto inducidas (iTSCs) llamados vástago trofoblasto se han generado las células similares a células retener una memoria del destino de la célula de origen 1. Aquí, hemos seguido un enfoque diferente de la generación de ITSC. Similar a la inducción directa de las células madre pluripotentes a partir de fibroblastos embrionarios murinos (MEFs) 2, iTSCs se han convertido ....
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Protocolo
Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con la ley alemana de protección de los animales y de acuerdo con la aprobación de los comités institucionales de cuidado de animales locales (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Renania del Norte-Westfalia [número de identificación de aprobación: AZ 84-02.04.2013 .A428]).
1. Preparación de Medios
- Preparar medio 293T: de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) FBS, L-glutamina (2 mM), piruvato de sodio (1 mM), penicilina / estreptomicina (1x).
- Preparar medio MEF: DMEM, 10% (v / v) FBS, L-glutamina (2 mM), aminoácidos no esencial....
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Resultados
En el plato donde se activa la expresión del transgen de la 4F, las células cambian rápidamente morfología (comparar Figura 2A y B). Alrededor del día 14 - 21 áreas distintas transdiferenciadas emergen (dos ejemplos se dan en la Figura 2B y C). Estas colonias primarias carecen de morfología típica TSC; Sin embargo, una vez que se subcultivan, morfología característica del epitelio con bordes estrechos límites y brillantes que recuerda mucho a los TSC bue.......
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Discusión
El protocolo basado transdiferenciación 4 factores (TFAP2C, Gata3, Eomes, Ets2) que aquí se presenta ofrece un método fiable para generar fidelidad convertido iTSCs de fibroblastos de embriones de ratón. Además, el método es también aplicable para los fibroblastos de la cola post-natales, aunque con una caída en la eficiencia en comparación con fibroblastos de embriones de 3. En general, la calidad de fibroblastos primarios es un factor crítico de resultado transdiferenciación y se debe tener cuidado de usar .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Hicalato de doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Disolver en PBS estéril, preparar 2 mg/ml de solución madre. Almacene las alícuotas a -20 ° C |
| Sal de difosfato de cloroquina | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare una solución madre de 25 mM en agua estéril de grado de cultivo celular. Almacene las alícuotas a -20 ° C |
| Polybrene (bromuro de hexadimetrina) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare una solución madre de 8 mg/ml en agua estéril de grado de cultivo celular. Almacene las alícuotas a -20 ° |
| C Factor de crecimiento de fibroblastos recombinante humano 4 | ReliaTech | 300-131L | Disolver en BSA estéril al 0,1% en PBS, preparar 25 y micro; g/ml de solución madre. Almacene las alícuotas a -80 ° C |
| Sal sódica de heparina | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml de solución madre disolviendo en PBS estéril. Almacene las alícuotas a -80 grados; C |
| ProFection Sistema de transfección de mamíferos | Promega | E1200 | |
| PBS, sin calcio, sin magnesio | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, sin glutamina | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Suero fetal bovino | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Filtro de membrana de acetato de celulosa sin tensioactivos | Corning | 431220 | |
| Aminoácidos | no esencialesThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicilina Estreptomicina | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Piruvato de sodio | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamina | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoetanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfóxido (DMSO), grado de cultivo celular | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Ratones B6. Cg-GT(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Ratones | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
Referencias
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538(2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent....
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Reimpresiones y permisos
