Artículo de método

Un alto contenido In Vitro Islotes pancreáticos de células β plataforma de descubrimiento de replicación

DOI:

10.3791/54298

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16 de julio de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Stanford University School of Medicine

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

retos críticos para el campo de investigación de la diabetes son comprender los mecanismos moleculares que regulan la replicación de las células β de los islotes y desarrollar métodos para estimular la regeneración de las células β. En este documento un método de alto contenido de cribado para identificar y evaluar se presenta la actividad de replicación promotoras de células β de moléculas pequeñas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La pérdida de células β productoras de insulina es una característica central de la diabetes. Si bien se está explorando una variedad de posibles terapias de reemplazo, la expansión de las células β de los islotes pancreáticos productores de insulina endógena sigue siendo una estrategia atractiva. β células tienen una actividad regenerativa espontánea limitada; En consecuencia, un esfuerzo de investigación crucial es desarrollar una comprensión precisa de las vías moleculares que restringen el crecimiento de las células β e identificar fármacos capaces de superar estas restricciones. En este trabajo se presenta un método automatizado de cribado de células primarias basado en imágenes de alto contenido para identificar moléculas pequeñas promotoras de la replicación celular β. Se superan varias limitaciones de las metodologías anteriores. En primer lugar, el uso de células de islotes primarios en lugar de una línea celular inmortalizada maximiza la retención de restricciones de crecimiento in vivo. En segundo lugar, el uso de cultivos de células de islotes de composición mixta en lugar de una línea celular β permite la identificación de estimuladores de crecimiento generales y restringidos por linaje. En tercer lugar, la técnica hace práctico el uso de islotes primarios, un recurso limitante, mediante el uso de un formato de 384 pocillos. En cuarto lugar, la variabilidad experimental perjudicial asociada con la calidad errática del cultivo de los islotes se supera mediante la optimización de los parámetros de aislamiento, dispersión, siembra y cultivo. En quinto lugar, las dificultades de medir de manera precisa y consistente la baja tasa de replicación basal de las células endocrinas de los islotes se superan con parámetros de inmunotinción optimizados, adquisición y análisis de datos automatizados; La automatización mejora simultáneamente el rendimiento y limita el sesgo del experimentador. Las limitaciones notables de este ensayo son el uso de cultivos de islotes dispersos que altera la arquitectura de los islotes, el uso de islotes de roedores en lugar de islotes humanos y las limitaciones inherentes de rendimiento y costo asociados con el uso de células primarias. Es importante destacar que la estrategia se adapta fácilmente para los estudios de replicación de islotes humanos. Este ensayo es muy adecuado para investigar el efecto mitogénico de las sustancias en las células β y los mecanismos moleculares que regulan el crecimiento de las células β.

Introducción

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Diabetes abarca un conjunto de trastornos que comparten el punto final de la homeostasis de la glucosa alterado común. Aunque los mecanismos patogénicos de los subtipos de diabetes son distintos, comparten la consecuencia de una disminución de la masa de células β, es decir, la pérdida de la capacidad de producción de insulina 1,2. Actualmente, las estrategias de tratamiento de la diabetes dependen de la administración crónica de insulina exógena, la estimulación farmacológica de la producción de insulina o mejora de la sensibilidad a la insulina, y rara vez, el trasplante de islotes pancreáticos o todo el páncreas 3,4. Lamentablemente, el éxito de estas estrategias es de corta duración y / o falla de recapitular suficientemente la función de producción de insulina endógena. A pesar de la utilidad de desarrollar un método para estimular la regeneración de las células β, no existe tal enfoque. En consecuencia, un importante objetivo de la investigación de la diabetes es el desarrollo de métodos para generar nuevas células ß o para ampliar la masa de células β endógena-5 . A pesar de que la regeneración de las células β a partir de fuentes renovables, como las células madre embrionarias está avanzando, las preocupaciones de seguridad y eficiencia hacen que la búsqueda de estrategias alternativas, incluyendo la expansión de las células beta maduras, una prioridad 6,7. Es importante destacar que la fuente predominante de nuevas células beta in vivo es preexistentes células beta en lugar de células progenitoras especializados 8,9. Aunque las células beta parecen tener la capacidad de replicación limitado, un pequeño aumento en la masa de células β (~ 30%) puede ser suficiente para restaurar la homeostasis de la glucosa en muchos diabéticos. Además, en la estimulación farmacológica in situ de la masa de células β es una estrategia de tratamiento potencialmente barata y escalable. En este documento se presenta un método de cribado de alto contenido para identificar y caracterizar moléculas pequeñas que estimulan el crecimiento de las células β.

Una variedad de métodos experimentales in vitro se puede utilizar para identificar productos génicos y / o moléculas that Promover la replicación de las células β primaria. Los primeros esfuerzos para medir la inducción de la replicación de las células β utilizan cultura roedor páncreas fetal o cultivos aislados de los islotes intactos para medir [3 H] timidina, incorporación de BrdU o cuerpos mitóticas dentro de la aldehído-tionina o población manchado insulina en respuesta a las condiciones de tratamiento específicas 10, 11. Estos enfoques in vitro y las ligeras variaciones de los mismos tienen varias limitaciones. Deficiencias prominentes incluyen (1) el uso de células fetales que, a diferencia de las células ß maduros, muestran una alta tasa de replicación de células β basal y son el crecimiento regulado de una manera distinta 12; (2) la naturaleza subjetiva de la adjudicación experimentador dependiente de los eventos de replicación de las células β; (3) la mano de obra y la naturaleza intensiva tiempo de conteo experimentador dependiente de los eventos de replicación de las células β retarda rendimiento experimental; (4) el uso de la incorporación / mancha / apariencia nuclear para identificar la replicación inclusots y una mancha citoplasmática que no se superponen para identificar las células beta conduce a la atribución errónea de los eventos de replicación no de células β próximas a las células beta.

Más recientemente, las células beta primarias maduras se han utilizado para evaluar el impacto de los transgenes sobre-expresión, así como el tratamiento de productos de genes o compuesto sobre la replicación de las células β 13-16. Sin embargo, estos estudios también se han basado en el conteo subjetiva de los eventos de replicación, staining- citoplasmática o no específicos métodos para la identificación de células β y / o pasos de trabajo intensivo que limitan el rendimiento, por ejemplo, placas individuales deslizable pocillo de células o islotes intactos inclusión en parafina y procesamiento 17. En particular, una metodología de selección replicación de las células β humano basado en imágenes, similar a la presentada en el presente documento, se ha publicado 18; Sin embargo, el uso con éxito de este ensayo no se ha demostrado y el uso de islotes humanos para el cribado primario puede no ser ampliamente FEAsible.

Una estrategia alternativa para la identificación de sustancias que promueven la replicación es evaluar la inducción de crecimiento de líneas de células β. Los esfuerzos iniciales se utilizan transformadas beta líneas celulares tales como células o MIN6 INS 832/13-células 14,19-21. Sin embargo, estas líneas celulares demuestran un crecimiento incontrolado y se parecen poco a las células ß bien diferenciados 22. En consecuencia, la capacidad de crecimiento de la inducción es mínima, de relevancia claro ya veces difícil de recapitular. Una estrategia mejorada para la detección basada en la línea celular utiliza "reversible transformado" células que son el crecimiento detenido en ausencia de tetraciclina (doxiciclina) la expresión del antígeno SV40 T dependiente de 23,24. Sin embargo, no está claro si estas células vuelven a un estado de células β-como "normal" tras la eliminación de doxiciclina. Desafortunadamente, el uso de estas células ha producido compuestos que promueven el crecimiento generalizadas que no parecen tener utilidad inmediata24. En general, el uso de líneas celulares para estudiar la regulación del crecimiento de un tipo de célula que muestra la actividad de replicación espontánea mínimo puede tener una aplicabilidad limitada.

La replicación de plataforma de cribado de células β presentada en este documento utiliza células beta de rata primaria maduros para retener en la regulación del crecimiento in vivo en la medida posible, los cultivos de células de los islotes de la composición de tipo de células mixtas para permitir la identificación de las actividades promotoras del crecimiento de linaje restringido, multi -bien formato a maximizar el rendimiento y análisis automatizado para eliminar los prejuicios y facilitar el rendimiento. El uso exitoso de esta plataforma ha permitido la identificación de varios compuestos que promueven la replicación de las células β 25,26. Además, el ensayo se ha utilizado para los estudios de relación estructura-actividad y experimentos de epistasis químicos para proporcionar información mecanicistas sobre la regulación molecular de la replicación de las células β. La plataforma presentada fue adaptado con éxito foinvestigación basada en RNAi r lentiviral de replicación de las células β vías 25. Limitaciones de la de ensayo incluyen escalabilidad restringida (uso de células primarias), el uso de roedores en lugar de los islotes células humanos (aunque el ensayo puede ser adaptado para estudios de los islotes humanos), los gastos asociados con la formación de imágenes basada en anticuerpos y la utilización de los islotes primaria, el uso de islotes dispersos (arquitectura islote interrumpido) para facilitar la adquisición de imágenes automatizado y la dependencia de la disponibilidad de un microscopio automatizado con adquisición de la imagen y la capacidad de análisis. Aunque un fácil en metodología de selección in vivo para la identificación de productos génicos o compuestos que estimulan la regeneración de las células β in situ sería ideal, una plataforma de este tipo todavía no está disponible 27. En consecuencia, la plataforma se ha descrito es apropiado para el investigador interesado en la investigación de la mayoría de los aspectos de la replicación de las células β.

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Protocolo

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Este protocolo se llevó a cabo de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. El protocolo descrito se escala para el aislamiento de los islotes de seis 250-300 g (8 - 9 semanas de edad) ratas macho Sprague Dawley, que es suficiente para generar 228 pocillos de una placa de 384 pocillos para la evaluación de la replicación de células de los islotes.

1. Preparación de materiales

  1. Preparar los medios de recubrimiento antes de iniciar el aislamiento de islotes mediante la recopilación de los medios condicionados de células de carcinoma de vejiga de rata 804G mantenidas en confluencia durante 3 días (20 ml de RPMI1640) en un 15 cm placa de cultivo tisular 28. Filtro estéril y almacenar (-20 ° C) los medios acondicionados para su uso posterior.
  2. Esterilizar instrumentos quirúrgicos (de 12 cm tissue forceps dentadas, uno de 11,5 cm tijeras finas, uno de 14,5 cm tijeras quirúrgicas, dos de 16 cm pinzas curvas, uno de 12 cm hemostato curvado, un mango de bisturí 12 cm) y un tamiz de tejido de malla 30 antes de initiating aislamiento de islotes.
  3. Preparar la solución de la digestión pancreática mediante la disolución de un 60%: mezcla de 40% de la clase I purificada: Clase de colagenasas II (actividad colagenasa total de 300.000 - 400.000 unidades) en 60 ml de solución salina equilibrada de 1x Hanks (HBSS), complementado con calcio y magnesio. Cargar 10 ml de tampón de digestión pancreática en jeringas de 10 ml (seis) con un 1 "22 G aguja y el lugar en el hielo.
    Nota: se inyecta 10 ml de solución de digestión por rata. Escalar en consecuencia.
  4. Preparar 4,5 ml de cóctel anestésico en una campana ventilada mediante la mezcla de 1,3 ml de ketamina (100 mg / ml), 0,2 ml de xilazina (100 mg / ml) y 3 ml de PBS. Preparar el cóctel anestésico dentro de 1 hora de iniciar el aislamiento de islotes.
  5. Preparar el tampón de lavado mediante la adición de 25 ml de suero de ternero recién nacido a 500 ml de HBSS. Coloque tampón de lavado en hielo para su uso posterior.
  6. Preparar 1 botella de medio de islotes que está a 500 ml de glucosa baja de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 50 ml de suero bovino fetal (FBS), 5.000 unidades / ml de penicilina y 5.000 g / ml de estreptomicina.
  7. Preparar medio función de los islotes a partir de solución funcionalidad / viabilidad (500 ml) con 2% de FBS, glutamina 2 mM, glucosa 5 mM, 5.000 unidades / ml de penicilina y 5.000 g / ml de estreptomicina. Almacenar los medios función de los islotes (4 ° C) para su uso posterior.
  8. Preparar 40 ml de tampón de bloqueo mediante la adición de 2,5 ml de suero de burro y 0,12 ml de Triton X-100 a 37,38 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS). memoria intermedia de almacenamiento de bloqueo (4 ° C) para su uso posterior.
  9. Obtener los anticuerpos necesarios antes de iniciar el protocolo.
    Nota: PDX-1 (TRITC) y Ki-67 (FITC) co-tinción se utiliza para el cribado primario replicación de las células β. Para el análisis de la replicación del linaje específico, lleve a cabo la tinción de inmunofluorescencia de marcadores adicionales de identidad celular (insulina, glucagón, somatostatina o vimentina; TRITC), junto con nuclear (DAPI), PDX (Cy5) y Ki-67 (FITC) tinción. representante alternativamarcadores publica-, por ejemplo, PCNA, también se pueden utilizar.
  10. Preparar un plan de tratamiento 228 pocillos con cada condición de tratamiento realizado por cuadruplicado. Incluir (5-iodotubercidin [1 M] o dipiridamol [15 mM]) y el vehículo de control por chispa (DMSO 1: 666 dilución) pozos.

2. La perfusión del páncreas

  1. Anestesiar las ratas por inyección intraperitoneal de solución cóctel anestésico diluido (0,30 ml / 100 g de peso corporal). Una vez que la rata es totalmente anestesiado y no responde a los estímulos nocivos, realice dislocación cervical.
  2. Coloque la rata sacrificados en la posición (orientación cráneo-caudal) en posición supina sobre una pila de toallas de papel y rociar la zona abdominal con un 70% de etanol.
  3. Abra la cavidad abdominal con una incisión en U (base en la región púbica) y retraer la piel en la dirección rostral sobre el pecho para exponer la cavidad abdominal.
  4. agarrar con cuidado el duodeno mediante dos pares de pinzas curvas, busque la entrada del duodeno b comunesile conducto (esfínter de Oddi) y la abrazadera de la abertura en la papila duodenal con una pinza hemostática curva.
  5. Levante la pinza hemostática curva utilizado para sujetar el conducto biliar común papila y agarrar el conducto biliar cerca de hígado usando un fórceps curvos. Utilice una disección roma con las pinzas curvas para aislar y exponer el conducto biliar.
  6. Cambiar la posición de la rata con los extremos proximal cabeza y los pies distal.
  7. Cannulate el conducto biliar común (CDB) en o justo distal a la unión de los conductos hepáticos y quísticas comunes con una solución de digestión pancreática RESORTE jeringa de 10 ml y se inyecte lentamente 10 ml de la solución de digestión pancreática. Mientras se inyecta, apoyar la CDB con un mango de bisturí. Cambiar la posición de la aguja si el conducto y el páncreas no pueden inflarse.
  8. Retire el páncreas inflados utilizando las pinzas curvas y tijeras finas para separarlo del colon descendente, los intestinos, el estómago y el bazo. Coloque el páncreas inflados en hielo en un tubo de 50 ml que contiene 5 ml de solución de digestión pancreática.
    Nota: Para obtener el máximo rendimiento de los islotes, recoger todos los páncreas a los 30 minutos y el lugar sólo 1 o 2 páncreas en cada tubo de 50 ml digestión.

3. La disociación de la Páncreas

  1. Una vez recogidos todos los páncreas, coloque los tubos de digestión en un baño de agua a 37 ° durante 15 minutos. Hacer girar suavemente los tubos de cada 3 min.
  2. Después de 15 minutos, agitar vigorosamente (verticalmente) los tubos 10 veces y añadir 10 ml de tampón de lavado en frío. Agite vigorosamente los tubos de un adicional de 5 veces y colocar en hielo.
  3. Llenar los tubos de digestión a 50 ml con tampón de lavado frío y mezclar invirtiendo los tubos 5 veces.
  4. Centrifugar los tubos a 97 xga 4 ° C durante 1 min y se vierte el sobrenadante. Tenga cuidado de no desplazar el tejido granulado.
  5. Añadir 25 ml de tampón de lavado y resuspender el tejido mediante agitación suave. Repita los pasos 3.4 y 3.5 dos veces más.
  6. Colocar un tamiz de tejido de malla 30 sobre un sterile 250 ml vaso de precipitados y se vierte la suspensión de tejido en el tamiz. Enjuague el tubo de digestión con un adicional de 20 ml de tampón de lavado y se vierte sobre la malla. Los tejidos pancreáticos y grasa no digerida se eliminan en este paso.
  7. Verter el material filtrado en dos frescos tubos de 50 ml y sedimentar el tejido centrifugando a 97 xg durante 1 min a 4 ° C. sobrenadante e invierta los tubos de decantación para drenar el exceso de tampón.

4. Purificación de islotes

  1. Añadir 20 ml de solución de diatrizoato frío polisucrosa / de sodio (1,119 g / ml de densidad) para el tejido pancreático se sedimentaron. Homogéneamente volver a suspender el contenido de cada tubo pipeteando suavemente arriba y abajo cinco veces.
  2. superponer suavemente la solución de diatrizoato polisucrosa / sodio con 10 ml de HBSS. Mantener una interfaz líquida aguda añadiendo poco a poco el HBSS a lo largo de la pared del tubo.
  3. Centrifugar los páncreas digeridos en 560 xg durante 15 min (4 ° C) con una aceleración lenta y no freno.
  4. Collect la capa islote de la interfaz mediante una pipeta 10 ml islotes y en lugar fresco tubos de 50 ml. No aunar islotes en esta etapa.
  5. Añadir 40 ml de tampón de lavado a cada tubo de 50 ml y centrifugado durante 1 min a 140 xga 4 ° C.
  6. Verter el sobrenadante y volver a suspender los islotes agrupados en 50 ml de tampón de lavado por inversión de los tubos varias veces. Centrifugar los tubos durante 1 min a 97 xg a 4 ° C para recoger islotes en un pellet.
  7. Retirar el tampón de lavado y repetir el lavado. Llevar islotes en la campana de cultivo de tejido y aspirar el sobrenadante.
  8. Vuelva a suspender cada tubo de islotes en 6 ml de medio de los islotes.
  9. La transferencia de los islotes de cada tubo de 50 ml en un pozo de seis pocillos placa de cultivo tisular. Agitar el plato de 6 pocillos para recolectar los islotes en el medio de la así y observar la calidad de los islotes y la pureza bajo un microscopio.
  10. recolectar manualmente islotes utilizando una pipeta de 1 ml y transferir los islotes recogidos en el adyacenteasí que contiene 6 ml de medio de los islotes. se consigue Repita remolino islote y recoger hasta> 90% de pureza.
  11. La transferencia de los islotes purificados a un 10 cm placa de cultivo tisular que contiene 20 ml de medio de los islotes.
  12. Coloque los islotes en un incubador de cultivo de tejidos (37 ° C, 5% de CO 2) durante la noche (Figura 1A).
  13. En la preparación de placas células de los islotes, capa los pocillos de una placa de 384 pocillos con 40 l de 804G medio acondicionado por pocillo. Incubar toda la noche en una incubadora de cultivo de tejidos.

5. Dispersión y Chapado de células de los islotes

  1. El día siguiente, separar suavemente islotes de la placa de 10 cm con un rascador de células y la transferencia de los islotes en un tubo de 50 ml.
  2. Se precipitan los islotes por centrifugación durante 1 min a 22 xg a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante.
  3. Lavar los islotes con 20 ml de PBS caliente y decantar como anteriormente.
  4. Vuelva a suspender los islotes en tripsina al 0,25% (150 l por páncreas de rata) Y se incuba a 37 ° C durante 10 min. Pipeta islotes arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta 1 ml al cabo de 5 y 10 minutos de incubación.
  5. Después de 10 min, evaluar una muestra de 20 l de los islotes tratadas con tripsina bajo el microscopio para asegurar la digestión completa y para contar las células de los islotes usando un hemocitómetro. Si no digeridos permanecen islotes, continuar la incubación durante otros 3 - 5 min y la pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces más. Repetir si es necesario.
    Nota: El rendimiento típico es de ~ 125.000 - 150.000 islotes células por rata.
  6. Retire 804G acondicionado placa de 384 pocillos recubiertas de los medios de comunicación de la incubadora y retirar el medio utilizando un aspirador de 12 pocillos múltiples.
  7. Suspender las células de los islotes a una densidad de 45.000 células por ml en medio de función de los islotes y la placa 70 l (3.150 células) por pocillo con una pipeta multicanal (Figura 1B).
    Nota: Puesto que las células ß, situados en los pocillos exteriores tienden a migrar hacia el perímetro de la placa de uso de filas C a N y columnas 4a 21 a la placa 228 pocillos con las células de los islotes aislados de 6 ratas.
  8. Colocar la placa en la incubadora de cultivo de tejidos durante 48 horas para permitir la adhesión celular.

6. Cultura-El tratamiento de células insulares, fijación y la tinción

  1. Preparar 200 l de vehículo y compuestos (condiciones de tratamiento se realizan por cuadruplicado) a una concentración 2x en medio función de los islotes. Organizar compuestos en una placa de 96 pocillos estéril para facilitar el pipeteado de múltiples pocillos.
  2. Retirar con cuidado medio islote con un aspirador de 12 pocillos múltiples y reemplazar con medio función de los islotes (35 l / pocillo) usando una pipeta de 12 pocillos. Quitar y reemplazar los medios de comunicación de una fila a la hora de limitar el riesgo de secado (Figura 1C).
  3. Iniciar el tratamiento mediante la transferencia de 35 l / pocillo de las soluciones de compuesto 2X. Volver placa a la incubadora durante la duración del tratamiento 48 hr.
  4. Después de 48 horas de tratamiento, se decanta el medio de tratamiento invirtiendo la placa.
  5. Lave suavemente las células de los islotes con 50 l por pocillo de PBS 1x (1 min). Añadir la PBS usando una pipeta multicanal.
  6. Decantar el PBS y fijar las células mediante la adición de 50 l por pocillo de frío 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en PBS 1x. Se incuban las células durante 15 min a 4 ° C.
  7. Se lavan las células tres veces (5 minutos cada uno) invirtiendo la placa para quitar el PFA y añadiendo con cuidado 60 l de PBS por pocillo como anteriormente.
  8. Preparar la solución de recuperación de 15 ml de antígeno mediante la mezcla de 14,25 ml de formamida y 0,75 ml 0,15 M de citrato de sodio (pH 6). Hacer que la solución de recuperación de antígeno inmediatamente antes de su uso.
  9. Retirar PBS de los pozos invirtiendo la placa y añadir solución de recuperación de antígeno 60 l a cada pocillo. Calentar la placa de 70 ° C baño de agua durante 45 minutos. Colocar un bloque de calentamiento en la parte superior de la placa durante la incubación para evitar deformaciones de la placa de múltiples pocillos.
    Nota: El agua debe estar a media altura del faldón placa; la placa no debe ser sumergido.
  10. Retirar la placa de baño de agua y deje que se enfríe durante 20 minutos a temperatura ambiente. Asegúrese de que la placa no está deformado por inspección visual.
  11. Se lavan las células con 60 l por pocillo de PBS 1x tres veces (5 minutos cada uno). Añadir PBS con una pipeta multicanal y decantar PBS invirtiendo la placa.
  12. Utilizar una pipeta multicanal para añadir 40 l por pocillo de tampón de bloqueo y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente. Retire el tampón de bloqueo por inversión de la placa y decantación.
  13. Añadir 40 l de ratón anti-humano Ki-67 (1: 200) y de cabra anti-humano PDX-1 (1: 100) anticuerpos diluidos en tampón de bloqueo a cada pocillo y se incuba a 4 ° C durante la noche.
  14. El día siguiente, se decanta la solución anti-cuerpo y lavar las células con PBS 1x tres veces (5 minutos cada uno) como se describe anteriormente. Decantar el PBS.
  15. Añadir 40 l por pocillo de diluido (1: 200) burro biotinilado anti-IgG de ratón y de burro conjugado con rodamina IgG anti-cabra en tampón de bloqueo. Incubar durante 1 horaa temperatura ambiente.
  16. Se lavan las células con PBS 1x tres veces, 5 minutos cada uno. Añadir 40 l de diluido (1: 400 en tampón de bloqueo) conjugado con fluoresceína estreptavidina a cada pocillo. Incubar 30 min a temperatura ambiente.
  17. Se lavan las células con PBS 1x tres veces, 5 minutos cada uno. Añadir 40 l por pocillo de DAPI (300 nM en tampón de bloqueo) y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
  18. Lavar las células con PBS 1x dos veces y dejar las células en 40 l de 1x PBS. La placa es ahora listo para ser analizado.

Análisis de replicación 7. β-Cell

Nota: Debe establecerse un protocolo de ensayo para el cribado de alto contenido de microscopio utilizado para medir la replicación de las células β. En su composición simple, este protocolo es un ensayo de dos colores, donde se utiliza un marcador de identidad para definir las células ß (PDX-1 + -Cells) y un marcador de la replicación (Ki-67) se utiliza para definir los eventos de división celular.

  1. Identificar objetos (células beta) en base a la average intensidad de fluorescencia de PDX-1 tinción (549 nm filtro) dentro de un círculo aproximado (longitud: anchura <1.6) dentro del área de píxeles esperado de un núcleo de células β (Figura 2A).
  2. A continuación, establezca la configuración para identificar los eventos de replicación (Ki-67-positividad) con base en la intensidad media de fluorescencia (485 nm filtro) dentro de la PDX-1 + área (Figura 2B).
    Nota: Los tiempos de exposición deben fijarse para permitir comparaciones de intensidad de pixel a través de imágenes. parámetros del protocolo de ensayo se ajustan de tal manera que las llamadas máquinas excluyen sistemáticamente las manchas, los desechos celulares y agregados no específicos que podrían afectar negativamente a la calidad de los datos.
  3. Analizar un mínimo de 500 células beta por pocillo para maximizar la precisión y el límite de variabilidad.
    Nota: Se espera que el índice de replicación de las células β basal en las culturas de los islotes de rata a ser de 0,5 - El 3%. Por lo general, 40 imágenes por así es más que suficiente para identificar a 500 células ß.
  4. Antes de analizar latoda la placa, analizar negativo- seleccionado (tratado con DMSO) y control positivo (5-iodotubercidin [1 M] o dipiridamol [15 mM]) tratados con pozos para evaluar la validez del protocolo de ensayo. Cuando el ensayo se establece correctamente, los compuestos de control positivo inducen al menos un aumento de dos veces en el porcentaje de la replicación de las células ß.
  5. Leer toda la placa una vez que el protocolo de ensayo se valida.

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Resultados

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Para evaluar las células β o la replicación de células α, se requiere un protocolo de ensayo de cuatro colores. En primer lugar, los objetos se identifican mediante tinción DAPI (Canal 1, 386 nm). A continuación, se cuentan las células beta (evento 1): objetos que co-expresar PDX-1 + (canal 2, 650 nm) y la insulina peri-nuclear (canal 3, 549 nm). Posteriormente, se cuentan replican las células beta (evento 2): (1 eventos) que co-expresan Ki-67 (canal 4, 485 nm) (Figura...

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Discusión

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Los métodos experimentales para el estudio de las vías moleculares que controlan el crecimiento de las células β y la regeneración son herramientas importantes para investigadores de la diabetes. En este documento, una plataforma de cribado basado en la rata de los islotes para identificar y caracterizar los estimuladores de molécula pequeña de la replicación de las células β se presenta.

Aunque la mayoría de los aspectos de este protocolo son fácilmente realizadas por los investigadores exp...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del NIDDK DK098143 y DK101530 de los NIH (JPA), el Instituto de Investigación de Salud Infantil Spectrum (CHRI) de Stanford y SPARK (UL1 TR001085, JPA).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
250 g macho Sprague Rata Dawly machoCharles RiverStain # 400
12 cm pinzas tisuue dientesFine Science Tools11021-12
11,5 cm tijeras finasFine Science Tools14058-11
tijeras quirúrgicas de 14,5 cmFine Science Tools14001-14
pinzas curvas de 16 cmFine Science Tools11003-16
Hepostat curvo de 12 cmFine Science Tools13011-12
Mango de bisturí de 12 cmFine Science Tools10003-12
Tamiz de tejidos-malla 30Bellco Glass1985-85000
Cizyme RI, 375.000 unidades CDAVitaCyte005-1030
Solución de sal equilibrada de Hanks (Ca++ y Mg++)Gibco24020-117
Ketamina HCl (200 mg / 20 ml)JHP PharmaceuticalsNDC # 42023-113-10para hacer cóctel anestésico 
Xilacina (5 g/50 ml)LLOYDNADA# 139-236para hacer cóctel anestésico 
Histopaque 1077SigmaH-1077para hacer histopaque 1100
Histopaque 1119SigmaH-1119para hacer histopaque 1100
Suero para terneros recién nacidos 500 mlHycloneSH30118.03
Hanks' Solución de sal equilibradaHycloneSH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Glucosa Media/Baja HycloneSH30021.01
Solución de Funcionalidad/Viabilidad Mediatech99-768-CV
RPMI1640 medios de comunicación HycloneSH30096.01para hacer una
línea celular de carcinoma de vejiga de rata con medio acondicionado 804GDisponible a pedidopara hacer medio acondicionado
Suero fetal bovino, calificadoGibco26160
GlutaMax-IGibco35050-061
Penicilina (5,000 UI / ml / Esttomiciina (5 mg / ml)  MP Biomedicals1670049
Formamida 500 mlFisher BioReagentsBP227-500
Solución de Desenmascaramiento de Antígenos 250 ml (pH 6.0)Vector LaboratoriesH-3300para hacer 0.15 M Solución de Sitrato de Sodio
Dextrosa, AnhidroEMD ChemicalsDX0145-1para hacer 1 M de solución de glucosa
Nomal Donkey Serum (Polvo)Jackson ImmunoResearch017-000-121
Triton X-100SigmaT8787-100ML
Ratón anti-humano Ki67 anticuerpoBD Biosciences556003
Cabra anti-humano anti-humano anticuerpo PDX-1R& D SystemsAF2419
Anticuerpo anti-insulina policlonal conejillo de indiasDako2016-08
Anticuerpo policlonal anti-glucagón de conejoDako2014-06
Anticuerpo policlonal anti-somatostatina de conejoDako2011-08
Anticuerpo anti-vimentina policlonal de polloabcamab24525
Biotina-SP-conjugado, Burro Anti-Ratón IgGJackson ImmunoResearch715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugado InvitrogenS32354
Burro anti-cabra conjugado con rodamina IgG Jackson ImmunoResearch705-025-147
Burro conjugado con rodamina Anti-conejillo de Indias IgG Jackson ImmunoResearch706-025-148
Burro conjugado con rodamina Anti-Conejo IgGJackson ImmunoResearch711-025-152
Cy 5-conjugado Burro Anti-Conejillo de Indias IgG Jackson ImmunoResearch706-175-148
Burro anti-Cabra conjugado Cy 5 IgGJackson ImmunoResearch705-175-147
Burro anti-Conejo conjugado Cy 5 IgGImmunoResearch711-175-152
Burro Conjugado Cy 5 Anti-Pollo IgGJackson ImmunoResearch703-175-155
DAPIMilliporeS7113
Depósito de reactivo desechable 25 mlSorenson BioScience39900
384 pocillos, negro/transparente, placa tratada para cultivo de tejidosBD Falcon353962
96 pocillos, negro/transparente, placa tratada para cultivo de tejidosCostar3603
Pipeta multicanalCostar4880
Aspirador de vacío de 12 canalesDrummond3-000-096
Raspador de celdasFalcon353085
Isotemp baño de agua modelo 2223 Fisher Scientific
Instrumento de cribado de alto contenido: ArrayScan VTIThermo Scientific
Jackson

Referencias

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