El protocolo descrito aquí detalla la inducción de un programa hemogénico en fibroblastos embrionarios de ratón a través de la sobreexpresión de un conjunto mínimo de factores de transcripción. Esta tecnología puede trasladarse al sistema humano para proporcionar plataformas para futuros estudios de la hematopoyesis, la enfermedad hematológica y el trasplante de células madre hematopoyéticas.
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Artículo de método
La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo detalla la inducción de un programa hemogénico en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) a través de la sobreexpresión de factores de transcripción (TFs). Primero diseñamos una pantalla reportera utilizando MEFs de ratones transgénicos dobles CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) humanos. Las células CD34+ de estos ratones marcan las histonas H2B con GFP y dejan de marcarse tras la adición de doxiciclina (DOX). Las MEFS se transducieron con TFs candidatas y luego se observaron para detectar la aparición de células GFP+ que indicarían la adquisición de un destino de células hematopoyéticas o endoteliales. A partir de 18 TFs candidatos, y a través de un proceso de eliminación combinatoria, obtuvimos un conjunto mínimo de factores que inducirían el mayor porcentaje de células GFP+. Descubrimos que Gata2, Gfi1b y cFos eran necesarios y que la adición de Etv6 proporcionó la inducción óptima. Una serie de análisis de expresión génica realizados en diferentes momentos durante el proceso de reprogramación revelaron que estas células parecían pasar por una célula precursora que experimentó una transición endotelial a hematopoyética (EHT). Como tal, este proceso de reprogramación imita la hematopoyesis del desarrollo "en un plato", lo que permite el estudio de la hematopoyesis in vitro y una plataforma para identificar los mecanismos que subyacen a esta especificación. Esta metodología también proporciona un marco para la traducción de este trabajo al sistema humano con la esperanza de generar una fuente alternativa de células madre hematopoyéticas (HSC) específicas del paciente para una serie de aplicaciones en el tratamiento y estudio de enfermedades hematológicas.
Introducción
La hematopoyesis es un proceso de desarrollo complejo en el que las células madre hematopoyéticas (HSC) brote fuera endotelio hemogenic presente en una variedad de sitios hematopoyéticas embrionarias tales como la aorta-gónada-Mesonefros y la placenta 1,2. La incapacidad de la cultura HSCs in vitro impide el análisis en profundidad de este proceso, así como la aplicación clínica de estos estudios. Para evitar esta limitación, los estudios anteriores han intentado derivar HSCs de novo ya sea a través de la diferenciación de células pluripotentes madre (PSC) 3, o plasticidad inducida en las células somáticas y diferenciación diri....
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Protocolo
declaración de la ética: líneas celulares de ratón se derivan siguiendo las pautas de cuidado de animales de la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí, y debe hacerse de acuerdo con cualquier institución de destino.
1. fibroblastos de embriones de ratón (MEF) Aislamiento de C57BL / 6 ratones
- Configurar el apareamiento cronometrado 13. Una vez que se visualiza un tapón vaginal, considere este Día 0,5.
- Se separan las hembras enchufados en la fecha enchufe y comprobar en ellos el día 10-11 para confirmar el embarazo.
- En el Día 13,5-14,5 eutanasia a los ratones hembras embarazadas mediante inhalación de CO 2<....
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Resultados
La hematopoyesis es un proceso complejo del desarrollo que se inicia en varios sitios embrionarias. Células endoteliales Hemogenic residen en estos sitios y dan lugar a través de las CMH de células en ciernes 23. Este proceso actualmente no puede ser reproducido mediante la colocación de HSCs o precursores hematopoyéticos en cultivo, lo que exige una metodología para obtener de alguna manera estas células in vitro, ya sea por HSPC expansión ex vivo o la gener.......
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Discusión
Generación de HSPCs de novo a partir de células somáticas fácilmente alcanzables ofrece un método único para estudiar la hematopoyesis in vitro, y la oportunidad de aplicar esta tecnología potencialmente para el sistema humano. Esta traducción generaría una nueva herramienta para estudiar la enfermedad hematológica humano en un plato, así como proporcionar las plataformas de pruebas de drogas y la orientación de genes oportunidades para tratar numerosos trastornos con nuevas terapias o transplantes de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una subvención del NHLBI a K.M. e I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira recibió una beca Revson Senior Biomedical Fellowship. Agradecemos al Centro de Recursos Compartidos de Mount Sinai hESC / iPSC y a S. D'Souza por su asistencia con materiales y protocolos. También agradecemos a las instalaciones de citometría de flujo, genómica y ratones de Mount Sinai.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45 μ Filtros M | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra | Millipore | UFC900324 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamina | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Agujas de 18 G | BD | 305195 | |
| Agujas de 20 G | BD | 305175 | |
| Agujas de 25 G | BD | 305125 | |
| Colagenasa Tipo I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Medios Myelocult | Tecnologías de células madre | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & Sistemas | D 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxiciclina | Sigma | D9891-1G | |
| Polibreno (bromuro de hexadimetrina) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65 μ Filtros de membrana M | Millipore | DVPP14250 | |
| medios de metilcelulosa | Tecnologías de células madre | Methocult M3434 | |
| Hidrocortisona | Tecnologías de células madre 07904 | ||
| C57BL/6 ratones | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatina | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | plásmido #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Plásmido Addgene #12260 | ||
| pMD2.G | Plásmido Addgene #12259 | ||
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Plásmido Addgene #20342 | ||
| 35 mm x 10 mm cultivo platos | Thermo Scientific | 171099 |
Referencias
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. ....
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Reimpresiones y permisos
