Introduction
وينظم التعبير الجيني في مرحلة ما بعد النسخي على وجه التحديد، بدءا من النسخ الحمض النووي في النواة. التي يسيطر عليها الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية)، مرنا نشوء حيوي والتمثيل الغذائي تحدث في جزيئات بروتين نووي ريبوزي ديناميكية للغاية (RNPs)، التي الزميلة وفصل مع مرنا الركيزة السلائف خلال تطور من الحمض النووي الريبي الأيض 1-3. التغيرات الديناميكية في الأداء الملاحي المطلوب مكونات تؤثر على مصير ما بعد النسخي من مرنا وتوفير ضمان الجودة أثناء معالجة النصوص الأساسية، والاتجار النووي والترجمة، ونشاطهم كقوالب مرنا للترجمة، ودوران في نهاية المطاف من mRNAs ناضجة.
وتتم تسمية العديد من البروتينات كما الممارسات التجارية التقييدية بحكم مجالاتهم الأحماض الأمينية الحفظ، بما في ذلك فكرة الاعتراف RNA (RRM) والحمض النووي الريبي RNA المزدوج نطاق ملزم (RBD)، وتمتد من مخلفات الأساسية (على سبيل المثال، أرجينين، ليسين، والجلايسين) 4. الممارسات التجارية التقييدية بشكل روتينيعزل باستراتيجيات مناعي ويتم فحص لتحديد الرنا الخاصة وما شابه ذلك. بعض الممارسات التجارية التقييدية شارك في تنظيم مسبقا من mRNAs التي ترتبط وظيفيا، تسمى regulons RNA 5-8. هذه الممارسات التجارية التقييدية، من mRNAs المشابهة لها، وأحيانا غير الترميز الحمض النووي الريبي، تشكل RNPs الحفازة التي تختلف في تكوينها. طابعها الفريد ويرجع ذلك إلى مجموعات مختلفة من العوامل المرتبطة بها، وكذلك لالزمنية تسلسل، والموقع، ومدة تفاعلاتها 9.
RNA مناعي (رض) هي تقنية قوية لعزل RNPs من الخلايا والتعرف على النصوص المرتبطة باستخدام تحليل تسلسل 10-13. الانتقال من مرشح لالجينوم على نطاق الفحص ممكنا من خلال RIP جنبا إلى جنب مع تحليل ميكروأري 14 أو التسلسل الإنتاجية العالية (RNAseq) 15. وبالمثل، يمكن تحديد البروتينات عجل شارك الطيف الكتلي، وإذا كانت وفيرة بما فيه الكفاية وفصل من-عجل شارك الأجسام المضادة 16،17. هنا، نحن معالجة منهجية لعزل مكونات الأداء الملاحي المطلوب من الحمض النووي الريبي وما شابه ذلك محدد من الخلايا البشرية المستزرعة، على الرغم من أن هذا النهج هو قابل للتغيير للست] القابلة للذوبان من خلايا النبات والفطريات والفيروسات والبكتيريا. وتشمل التحليلات التحويلية للمواد تحديد مرشح والتحقق من طخة مناعية، مطياف الكتلة، والكيمياء الحيوية فحص الأنزيمية، RT-QPCR، ميكروأري، وRNAseq، كما هي ملخصة في الشكل 1.
ونظرا للدور الأساسي للRNPs في السيطرة على التعبير الجيني في مرحلة ما بعد النسخي، وتعديلات في التعبير عن الممارسات التجارية التقييدية المكونة أو إتاحتها للالمشابهة الرنا يمكن أن يكون ضارا للخلية وترتبط مع عدة أنواع من الاضطرابات، بما في ذلك مرض عصبي 18. DHX9 / RNA هيليكاز ألف (رحه) ضروري لترجمة من mRNAs مختارة من أصول الخلوية وفيروسات 6. هذه الرنا وما شابه ذلك يحمل عناصر رابطة الدول المستقلة المفعول ذات الصلة هيكليا داخل بهم5 'UTR، التي اعتبرت بمثابة عنصر تحكم ما بعد النسخي (PCE) 19. النشاط رحه-PCE ضروري لكفاءة الترجمة التي تعتمد على الحد الأقصى من العديد من الفيروسات، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية-1، والجينات التنظيمية النمو، بما في ذلك جند 6،20،21. المشفرة بواسطة الجينات الأساسية (dhx9)، رحه أمر ضروري لتكاثر الخلايا والتنظيم وصولا ليقضي على بقاء الخلية 22. التحليل الجزيئي للرحه-PCE RNPs هو خطوة أساسية لفهم لماذا النشاط رحه-PCE ضروري للسيطرة على انتشار الخلايا.
توصيف دقيق لمكونات الأداء الملاحي المطلوب رحه-نفقات الاستهلاك الشخصي في حالة مستقرة أو عند اضطراب الفسيولوجية للخلية يتطلب تخصيب انتقائية والقبض على RNPs رحه-PCE في وفرة كافية لتحليل المصب. هنا، كانت المعلمة فيروسات PCEgag RNA مع 6 نسخ من الموقع RNA رابطة الدول المستقلة المفعول ملزم للبروتين معطف MS2 (CP) في إطار القراءة المفتوح. البروتين معطف MS2 كان إكسوgenously المشارك أعرب مع PCEgag الحمض النووي الريبي ترنسفكأيشن البلازميد لتسهيل تجميع الأداء الملاحي المطلوب في نمو الخلايا. تم immunoprecipitated RNPs التي تحتوي على البروتين معطف MS2 مع المعلمة MS2-وما شابه ذلك PCEgag الحمض النووي الريبي من استخراج الخلايا والقبض على حبات مغناطيسية (الشكل 2A). لالتقاط انتقائي مكونات الأداء الملاحي المطلوب منضمة إلى نفقات الاستهلاك الشخصي، والمحتضنة في الأداء الملاحي المطلوب ثبتوا مع قليل النوكليوتيد مكملة لتسلسل البعيدة لنفقات الاستهلاك الشخصي، وتشكيل الهجين RNA-DNA الذي هو الركيزة للنشاط ريبونوكلياز H. منذ يتم وضع نفقات الاستهلاك الشخصي في "محطة من 5 '5 المنطقة غير المترجمة، وكان قليل النوكليوتيد مكملة لتسلسل الحمض النووي الريبي المتاخمة للفيروسات الموقع ترجمة البدء (أسكت بداية كودون). ريبونوكلياز H انشقاق قرب بدء هفوة كودون صدر مجمع UTR 5 'من الأداء الملاحي المطلوب يجمد، والتي تم جمعها كما شاطف. بعد ذلك، تم تقييم العينة RT-PCR لتأكيد القبض على PCEgag وSDS PAGE وطخة مناعية لتأكيد captuإعادة البروتين معطف MS2 الهدف. والتحقق من الحمض النووي الريبي ملزمة البروتين المرتبط نفقات الاستهلاك الشخصي، DHX9 / RNA هيليكاز A، ثم تم القيام بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
| عازلة التراكيب |
| غسل العازلة: |
| 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 |
| 150 مم كلوريد الصوديوم |
| 3 ملي MgCl2 |
| منخفض الملح العازلة: |
| 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5 |
| 10 ملي كلوريد الصوديوم |
| 3 ملي MgCl2 |
| 2 ملي DTT |
| 1X مثبط البروتياز كوكتيل خالية من EDTA |
| ريبونوكلياز خارج 5 ميكرولتر / مل (ريبونوكلياز المانع) |
| حشوية الاحتياطي تحلل: |
| 0.2 M السكروز |
| 1.2٪ تريتون X-100 |
| NETN-150 مخزن اغسل: |
| 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 |
| 150 ممكلوريد الصوديوم |
| 0.5٪ NP-40 |
| 3 ملي MgCl2 |
| 10٪ الجلسرين |
| ملزمة العازلة: |
| 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.6 |
| 40 ملي بوكل |
| 3 ملي MgCl2 |
| 2 ملي DTT |
| 5٪ الجلسرين |
الجدول 2: التراكيب العازلة.
1. إعداد خلايا ومصفوفة الانجذاب
- ثقافة خط خلية من الاهتمام إلى التقاء الفرعي (80٪) في صحن 10 سم. استخدام 10 سم لوحات لimmunoprecipitations المستقلة (IP) لNLS-MS2 بروتين معطف الموسومة FLAG. أداء IP باستخدام أمصال مضادة لعلامة FLAG-حاتمة. عندما معربا عن MS2 بروتين معطف البلازميد الموسومة FLAG، transfect الخلايا 24-48 ساعة قبل الحصاد 20.
ملاحظة: الأداء الملاحي المطلوب معين قد يكون المخصب من الطاقة النووية أو السيتوبلازملست] جيم أو مستحضر كيميائي حيوي، مجزأة، مثل أجزاء من التدرج السكروز. فمن المستحسن لحصاد المحللة من خلايا غير transfected بالتوازي مع تأسيس عنصر تحكم سلبية إضافية. - نقل 60 ميكرولتر في الملكية الفكرية للبروتين G حبة المغناطيسي الطين إلى أنبوب 1.7 مل microcentrifuge ل.
- وضع أنبوب على رف جذب للأنابيب microcentrifuge لفصل حبات من حلول التخزين.
- إزالة حل التخزين عن طريق رسم بعناية حتى مع micropipette.
- إزالة أنبوب من رف المغناطيس.
- غسل وتتوازن حبات مع 600 ميكرولتر (10 مرات الحجم المستخدم من الخرز) من 1X غسل العازلة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 3 ملي MgCl 2، و 150 مم كلوريد الصوديوم) ونهاية الإفراط في نهاية التناوب لمدة 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- وضع أنبوب على الرف المغناطيس وإزالة غسل العازلة.
- إضافة 10 مجلدات (600 ميكرولتر) من العازلة 1X غسل وimmunoprecipitating الأجسام المضادة FLAG إلى العلاقات العامة معايرتهاotein G حبات مغناطيسية (وفقا لكمية الموصى به من قبل الشركة المصنعة للمناعي) وتناوب نهاية الإفراط في نهاية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل لتصريف الأجسام المضادة immunoprecipitating. استخدام مفتش نمط إسوي المقابلة كوسيلة لمراقبة سلبية الأجسام المضادة مناسبة.
- وضع أنبوب على الرف مغناطيس لجمع الخرز وإزالة طاف.
- إزالة أنبوب من رف المغناطيس وتغسل حبات الضد مترافق مع 10 مجلدات (600 ميكرولتر) من غسل العازلة 1X وتناوب لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة مرتين.
- وضع أنبوب على الرف المغناطيس وإزالة غسل العازلة.
2. حصاد وRNPs
ملاحظة: إعداد RNPs خلال فترة حضانة بعد خطوة 1.8.
- إزالة مستنبت من خلايا بواسطة الطموح وغسل الخلايا مرتين مع 1-5 مل من الجليد الباردة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). استخدام مكشطة الخلية إلى طرد الرطب،الخلايا الملتصقة قبل جمع بواسطة الطرد المركزي في 226 x ج لمدة 4 دقائق على 4 درجات مئوية.
- إضافة 375 ميكرولتر من الجليد الباردة العازلة المنخفض الملح (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 3 ملي MgCl 2 و 10 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي DTT، 1X البروتياز المانع الكوكتيل، خالية من EDTA و 5 ميكرولتر / مل ريبونوكلياز المانع) إلى بيليه الخلية والسماح تورم بوضعه على الجليد لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: خياط حجم عازلة قليل الملح حسب حجم بيليه الخلية. 1.2 × 10 6 خلايا من لوحة 10 سم، 375 ميكرولتر من العازلة كافية. - لجمع الخلايا المحللة حشوية، إضافة 125 ميكرولتر من تحلل العازلة الجليد الباردة (0.2 M السكروز / 1.2٪ تريتون X-100)، ثم قم بإجراء 10 السكتات الدماغية مع الخالط Dounce التي كانت قبل برود في دلو الجليد.
ملاحظة: لجمع مجموع استخراج الخلايا، فمن المستحسن القياسية تحلل العازلة المعهد الملكي للالانحلال في جبلة النواة / لونين. - تدور في microfuge في سرعة قصوى (16000 x ج) لمدة 1 دقيقة. هذا سيؤدي إلى مسح طاف من الحطام لنوى الثانية.
- طاف لنقل أنبوب microcentrifuge 1.7 مل الجديد الذي تم على الجليد. تحديد تركيز البروتين الكلي من مستوى، طريقة يفضل المختبر، مثل برادفورد الفحص 23. حجز قسامة لا يقل عن 10٪ للحصول على تحليل لطخة غربية، لاستخدامها كعنصر تحكم الإدخال. استخدام الخلايا المحللة تحصد فورا للمناعي أو تخزينه في -80 درجة مئوية لتحليل المستقبل.
ملاحظة: في تجربتنا، هذه العينات يمكن تخزينها واستخدامها في وقت لاحق عدة أشهر لتحليل مناعي دون حل وسط من النزاهة.
3. مناعي
- إضافة الحجم المطلوب من الخلايا المحللة حصادها، استنادا إلى تركيز البروتين في تحديد الخطوة 2.5، إلى حبات الضد مترافق الهدف. عن طريق غسل العازلة 1X، ليصبح الحجم الكلي يصل إلى 600 ميكرولتر وتناوب نهاية الإفراط في نهاية مدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: هذه الفترة الزمنية غير كافية لتوليدعزلة قوية من المجمعات RNP عالية تقارب مع تقليل غير محددة وملزمة. تمييع مصادر RNP بديلة، مثل أجزاء من التدرج السكروز، لا يقل عن 1: 1 مع غسل العازلة 1X، ثم احتضان لهم مجمعات للحبة الضد معدة مسبقا، على النحو المذكور أعلاه. - بعد 90 دقيقة من الحضانة، ووضع أنبوب IP على الرف مغناطيس لجمع الخرز. حجز طاف كما التدفق من خلال.
ملاحظة: هذه أول التدفق من خلال هو عينة السيطرة الهامة لقياس كفاءة IP. ومقايسة طخة مناعية توفر مؤشرا على كفاءة الملكية الفكرية، فضلا عن خصوصية التفاعلات التحقيق. فمن المستحسن أن تبقي هذه طاف للتحليل المصب. - غسل والخرز الضد مترافق محددة الأداء الملاحي المطلوب مع 10 مجلدات (600 ميكرولتر) من NETN-150 غسل العازلة الجليد الباردة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، 3 ملي MgCl 2؛ 0.5٪ NP40، و 10٪ الجلسرين) تحت دوران لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوة 3 مرات.
ملاحظة: هذه عازلة يختلف عن تحلل العازلة وبشكل فعال يقلل من الجمعيات ضعيفة أو غير محددة. - بعد غسل النهائي، resuspend والمجمعات الأداء الملاحي المطلوب ثبتوا في 60 ميكرولتر من 1X العازلة الجليد الباردة ملزمة (10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.6 و 40 ملي بوكل، 3 ملي MgCl 2، 5٪ الجلسرين، و 2 ملي DTT) والاحتياطي 10٪ من الخرز المعقدة ثبتوا لطخة غربية و 20٪ لعزل الحمض النووي الريبي.
4. شطف
- ضبط مستوى الصوت المتبقية إلى 100 ميكرولتر مع العازلة ملزمة 1X المثلج وحرارة الأنبوب في 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- لعزل المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين وما شابه ذلك، إضافة ~ 30 الإقليم الشمالي النوكليوتيد الحمض النووي أنه مكمل لل3 'تسلسل الحدود من الحمض النووي الريبي من الفائدة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف (100 نيوتن متر من النوكليوتيد يكفي).
ملاحظة: النوكليوتيد هو العقاقير إلى بقايا النوكليوتيدات المتاخمة للترجمة بدء موقع بناء PCE استخدامها بوصفها الامثلهه في هذا البروتوكول. يتم توفير المناسب تسلسل التكامل من قبل ~ محتوى GC 40٪. تصميم النوكليوتيد العقاقير لتهجين كفاءة في المنطقة التكميلية الحد الأدنى من الحمض النووي الريبي الهدف. - إضافة 5-10 وحدة من ريبونوكلياز H إلى أنبوب ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ليلتصق الحمض النووي الريبي من الحمض النووي الريبي: هجين الحمض النووي. نقل طاف لأنبوب 1.7 مل microcentrifuge لمعقمة. تحتوي هذه العينة المجمعات الأداء الملاحي المطلوب القبض المصالح.
ملاحظة: هذا يتوقف على إمكانية الحصول على الحمض النووي الريبي وما شابه ذلك، واثنين أو أكثر جولات من العلاج ريبونوكلياز H قد يكون مفيدا لزيادة وفرة عينة للتحليل المصب. - استخدام 20٪ من شطافة في لطخة غربية للبروتينات المرتبطة المعروف و 20٪ من شطافة لعزل الحمض النووي الريبي تليها RT QPCR. 60٪ المتبقية يمكن استخدامها لقياس الطيف الكتلي أو لتحديد مكونات البروتين.
- في موازاة ذلك، إخضاع قسامة من الخلايا المحللة محفوظة لعزل الحمض النووي الريبي وتحليل RT-PCR. هذا ASSEيوفر ssment مؤشرا لتخصيب RNA داخل مجمع الأداء الملاحي المطلوب.
ملاحظة: استخدم إعداد البروتين المعزول في طخة غربية مراقبة للتأكد من أن الانقسام ريبونوكلياز H كان فعالا في الإفراج عن الأداء الملاحي المطلوب من مجمع immunuoprecipitated.
5. البروتين التحليل الكهربائي والغربية وصمة عار
- تخضع حوالي 10-20٪ من إجمالي العينة إلى SDS-PAGE وتحليل طخة مناعية وفقا لبروتوكول المختبر القياسية.
ملاحظة: هذه الخطوة تخدم للتحقق من كفاءة الملكية الفكرية والخصوصية قبل تحليل الحمض النووي الريبي المصب. ويمكن أيضا أن تستخدم لتقييم تكوين البروتين في مجمع RNP معزولة.
6. مجموعة من Immunoprecipitated RNA
ويمكن أن يتم عزل الحمض النووي الريبي عن طريق أسلوب Trizol أو بعد بروتوكول وصف: ملاحظة.
- نصف و resuspend من إجمالي العينة في 750 ميكرولتر من حمض كاشف guanidinium ثيوسيانات واحتضان في تي الغرفةemperature لمدة 5 دقائق قبل استخراج الحمض النووي الريبي من المجمعات PCE-الأداء الملاحي المطلوب القبض عليه.
- إضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم إلى أنبوب، هزة بقوة لمدة 10 ثانية، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- بعد الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، وجمع المرحلة المائية في أنبوب من جديد وإضافة حجم مساو من الأيزوبروبانول. تخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة على الأقل. إضافة 1 ميكرولتر من جلايكول الأزرق إلى العينة وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في الفريزر لهطول الأمطار أو معالجة فعالة في وقت لاحق.
- أنبوب الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعناية جمع والتخلص من طاف وذلك لعدم تعكير صفو بيليه RNA. من المستحسن استخدام micropipette غيض ف 200 لتسهيل هذه العملية.
- إضافة 500 ميكرولتر من الايثانول 75٪ لكل أنبوب، الدوامة، وأنابيب الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. بعناية جمع والتخلص من طاف كما في الخطوة 6.4. الجويتجفيف بيليه لمدة 2-3 دقائق و resuspend في 100 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه.
ملاحظة: لا تطيل الوقت الذي بيليه يجف الهواء من أجل تجنب مشكلة مع إعادة تعليق. - تطبيق 100 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي إلى عمود تنظيف الحمض النووي الريبي. معالجة باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة. أزل الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه ومخزن في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
ملاحظة: هذا الحمض النووي الريبي معزولة هو مناسبة لتحليل المصب بواسطة RT-PCR الوقت الحقيقي (QPCR)، ميكروأري، وتسلسل الحمض النووي الريبي. اعتمادا على وفرة من الأداء الملاحي المطلوب والكفاءة التي يتم عزل الأداء الملاحي المطلوب من الاهتمام، لا يجوز إخضاع نفس المحللة إلى اثنين أو أكثر من جولات الملكية الفكرية لتوليد RNA كافية للتطبيق لتحليل المصب.
7. الحمض النووي الريبي النسخ العكسي والتضخيم من [كدنا بواسطة PCR
- إخضاع الحمض النووي الريبي معزولة على عكس النسخ التي كتبها التمهيدي عشوائي مع عكس ذات جودة عالية الناسخ (RT)، وفقا لmanufaتعليمات cturer ل.
- لتضخيم الحمض النووي الريبي من الفائدة، تصميم التمهيدي العقاقير جينات محددة ضمن تسلسل انشقاق ريبونوكلياز H. استخدام كميات مماثلة من النوكليوتيد العقاقير، وهو أول كتاب عشوائي، أو التمهيدي بنسبة ضئيلة من DT (انظر الجدول المواد).
ملاحظة: التمهيدي بنسبة ضئيلة من DT ومرنا-adenylated بولي توفر ردود الفعل مراقبة إيجابية لردود الفعل RT-PCR. - احتياطي 5٪ من رد فعل RT (1 ميكرولتر) لQPCR إعدادي به جنبا إلى جنب مع سيطرة سلبية المحللة الملكية الفكرية وعينات من الحمض النووي للسيطرة الإيجابية لتحديد قطع وإنتاج منحنى القياسية. إذا كانت قيمة المقطعية للQPCR إعدادي هي خارج نطاق منحنى قياسي، يخفف من رد فعل RT في متتالية 1: 5 التخفيفات وكرر الخطوة 7.2.
ملاحظة: للحصول على تسلسل الحمض النووي الريبي وتقنية مطياف الكتلة، الرجاء مراجعة ملف الطريقة التكميلي. الرجاء الضغط هنا رس عرض هذا الملف الطريقة التكميلي. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
حددت النتائج RIP السابقة الرنا هفوة فيروسات وتحديد الرنا الخلوية التي تشارك في راسب مع DHX9 / رحه، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية-1 6، جند 6 وحور (فريتز وبوريس-لوري، غير منشورة). وقد أظهرت فيروسات 5 'UTR للمشاركة في يعجل مع DHX9 / رحه في النواة وللمشاركة في عزل في السيتوبلازم على polyribosomes. يتم تعريف فريد على أنها رابطة الدول المستقلة -acting عنصر تحكم ما بعد النسخي (PCE) 6. لعزل المجمعات بروتين نووي ريبوزي PCEgag RNA-رحه (RNPs) التي تشكلت في الخلايا المتكاثرة، أجرينا FLAG-MS2 الأداء الملاحي المطلوب مناعي في transfected لست] خلية HEK293. أظهرت النتائج هطول كفاءة البروتين FLAG-MS2. والجدير بالذكر أن حددت DHX9 / رحه داخل هذا المجمع الملاحي المطلوب وليس داخل isotype السيطرة مفتش، ولا داخل الخلية المحللة السيطرة السلبية HEK293 (الشكل 2A). وقد حضنت مصفوفة تحتوي على RNPs مع مكملة 30النوكليوتيد -nt، وبعد ذلك تم إجراء أي انشقاق ريبونوكلياز H الهجين RNA-DNA. على ريبونوكلياز H الهضم، تم تحليل eluates قبل الغرب النشاف. وأظهرت ريبونوكلياز H انشقاق من PCEgag الحمض النووي الريبي في موقف الهجين RNA-DNA الافراج عن مجمع RNP ملزمة على وجه التحديد إلى UTR 5 '. تم تحديد RNPs المرتبطة رحه-DHX9 / لتخصيبه في eluents. الأهم من ذلك، ظلت RNPs متجهة الى FLAG-MS2 مع الخرز الضد مترافق (الشكل 2B). تم التحقق من صحة شارك في مناعي من MS2 الجذعية حلقة تحتوي على فيروسات PCEgag الحمض النووي الريبي في الخلايا وفي eluents بواسطة RT-PCR وqRTPCR (الشكل 2C). وأكدت النتائج مختارة العلاقة بين DHX9 / رحه وفيروسات 5 'UTR، الذي يسلط الضوء عليها والأداء الملاحي المطلوب فريدة من نوعها المهم بالنسبة استهدفت السيطرة الترجمة 6.
الشكل 1: RNP العزلة وإثراء RNPs محددة ترتبط مع 'UTR 5 من PCEgag من ريبونوكلياز H الانقسام. سير العمل تبين خطوات لعزل بروتين نووي ريبوزي اختيار المكون من جديد في الخلايا، وجمع من خلال التوجيه النوكليوتيد RNaseH الانقسام، وتحليل المصب من مكونات الحمض النووي الريبي والبروتينات. موجز اللوني تقارب باستخدام تفاعل عالية تقارب بين multimers لMS2 RNA الجذعية حلقة ومعطف MS2 البروتين البروتين FLAG الانصهار لالتقاط نفقات الاستهلاك الشخصي RNA على حبات FLAG. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
واعتقل PCEgag RNA يحتوي على 6 مواقع الربط MS2 الحمض النووي الريبي لالموسومة FLAG MS2 بروتين معطف يجمد، وكانت RNPs محددة ترتبط مع 'UTR 5: الرقم 2صدر عن الموجه النوكليوتيد ريبونوكلياز H الانقسام. خلايا HEK293 وقد شارك في transfected مع pAR200 (البلازميد التي تحتوي على PCEgag و6X MS2 حلقات في إنترون فيروس نقص المناعة البشرية) والبلازميد معربا عن FLAG الموسومة حاتمة البروتين MS2 مع تسلسل توطين النووي (NLS). وقد تم جمع الخلايا وتم عزل السيتوبلازم في 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن. وتعرض لست] حشوية إلى مناعي مع أي الأجسام المضادة FLAG أو عنصر تحكم مفتش. (أ) تم تحديد كفاءة الملكية الفكرية طخة مناعية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة FLAG. خدم DHX9 / رحه، وهو بروتين نفقات الاستهلاك الشخصي ملزمة، كما تحكم إيجابية. التي تحتوي على نفقات الاستهلاك الشخصي RNA immunoprecipitated مع البروتين MS2. الممرات 1-3: البروتينات المدخلات المستخدمة للملكية الفكرية. الممرات 4-5: FLAG IP من FLAG MS2 overexpressed المحللة وHEK293 الخلايا المحللة هيولية. لين 6: مفتش IP من FLAG MS2 overexpressed المحللة. الممرات 7-9: تدفق من خلال من البرامج المتكاملة. وقد أثرى (ب) RNPs متجهة الى UTR 5 'من قبل ريبونوكلياز H الانقسام. الممرات 1-3: Eluates من 5 'من البروتين ملزمة UTR من ريبونوكلياز H. الممرات 4-6: البروتينات ملزمة لحبات الضد مترافق. (C) PCR الناسخ العكسي في الوقت الحقيقي والكمي PCR من الحمض النووي الريبي محددة ملزمة لكسور مختلفة من RNPs. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العزلة الأداء الملاحي المطلوب واستراتيجية تحديد الحمض النووي الريبي وما شابه ذلك وصفت هنا هي وسيلة انتقائية التحقيق في تفاعل معين RNA والبروتينات واكتشاف البروتينات مرشح شارك في تنظيم والأداء الملاحي المطلوب معين في الخلايا.
وميزة استخدام الموجه النوكليوتيد ريبونوكلياز H الانقسام لعزل RNPs هي القدرة على التقاط وتحليل الأداء الملاحي المطلوب المفعول رابطة الدول المستقلة عنصر RNA على RNPs غير متجانسة ملزمة المصب إلى عنصر الحمض النووي الريبي تعمل رابطة الدول المستقلة من الاهتمام على وجه التحديد. بسبب وفرة من الحمض النووي الريبي وما شابه ذلك في الأداء الملاحي المطلوب معين هو جزء بسيط من RNPs جمعت معزولة دون ريبونوكلياز H الانقسام، والعيب الرئيسي لهذا العمل هو ندرة الأداء الملاحي المطلوب وما شابه ذلك. في تجربتنا، واستلزم هذا القيد 5- إلى 10 أضعاف المزيد من المواد الانطلاق من الحمض النووي الريبي الملكية الفكرية التقليدية للكشف في طخة مناعية حساسة والبروتينات يحلل. ميزة أخرى توفرها شل حركة والأداء الملاحي المطلوب هو راحة تكرار تري ريبونوكلياز Hatment وجمع شطافة إضافية. في تجربتنا، وكانت 2-4 جولات من العلاج ريبونوكلياز H ينصح لجمع شطافة إضافية.
في هذا البروتوكول، والاهتمامات الفنية الرئيسية هي الحفاظ على درجة الحرارة المثلى وضمان التعامل مع معقم من الكواشف. يجب أن تكون جميع الكواشف RNase- وخالية من البروتياز. سلامة عينة الحمض النووي الريبي هو شرك محتمل للنظر في ما إذا كان تفاعل الحمض النووي الريبي البروتين لا يمكن كشفها.
هذا الأسلوب يتطلب تحلل كفاءة الخلايا للوصول إلى RNPs في كمية مناسبة من أجل الكشف. في حين تحذير هام وهو غير مكتمل تحلل الخلية وعلاجات قوية قد تزيد التفاعلات غير محددة مع الحمض النووي الريبي. ولذلك، ينبغي قياس الظروف التجريبية من أجل إثراء التفاعل البروتين RNA محددة. ومع ذلك، فإن استخدام يغسل عالية صرامة، قد القضاء على التفاعلات الهامة بعد عابرة. ولذلك، فإن الظروف غسل هي متغير آخر لconsidإيه في المتطلبات المحددة للتجربة معينة.
كفاءة RIP هي تقنية قوية لعزل شركاء RNA والبروتينات وما شابه ذلك، ولكن يتم فقدان بعض التفاعلات عابرة أو ضعيفة ذات الأهمية الفسيولوجية خلال الخطوات الملزمة أو الغسيل. عبر ربط مجمع mRNP هو خيار للنظر في تحليل. وعلاوة على ذلك، يجب أن تبقى ظروف النمو الفسيولوجية في الاعتبار أثناء تحليل RNPs التنظيمية، ومستوى التعبير من الحمض النووي الريبي وما شابه ذلك أو الممارسات التجارية التقييدية قد تكون عرضة لتقلبات الفسيولوجية في ظل ظروف معينة. وعلاوة على ذلك، فإن النوع من التحليل المصب أيضا أن تلعب دورا في اختيار الظروف تحلل والغسيل خلال مناعي.
بالإضافة إلى ذلك، مناعي الناجح يتطلب أن الخلايا المحللة أن يخفف إلى حد كبير (على الأقل 1: 1). غسل العازلة 1X (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.3، 3 ملي MgCl 2، و 150 مم كلوريد الصوديوم) هو مخفف المحدد، كما تكوينهالا يؤثر على سلامة الأداء الملاحي المطلوب، حل الذوبان، أو تفاعلات الضد مستضد.
لقياس الطيف الكتلي المصب، وينبغي أن تكون العينات خالية من الأملاح، بما في ذلك نا +، الكلورين -، وتريس، وكذلك بعض المنظفات. إذا لزم الأمر، قد المركبات التي يتم تخفيض مكونات مخازن-والأيونية التي كتبها الغسيل الكلوي أو الأيونية الصرف الترشيح، وفي بعض الحالات، ومخازن الطيارة مفيدة في الخطوات النهائية. في الحالات عند استخدام مصل مضاد لعزل بروتين حاتمة الموسومة التي أعرب عنها ترنسفكأيشن، والمصادقة لطخة غربية من البروتين المؤتلف باستخدام الخلايا المحللة الأولي يجب أن يعدم قبل إجراء مزيد من التحليل. في حالة استخدام علامة حاتمة (أي، FLAG، MYC، GFP، وما إلى ذلك)، والتعرض للعلامة أمر حاسم لنجاح خطوة ملزم الأجسام المضادة. وينبغي تجنب تجميد أذاب من العينات.
وقد استخدمت هذه التقنية RIP على نطاق واسع لتوضيح الآليات المتنوعة للسيطرة الجين بعد النسخي10،25. ويشمل ذلك تحديد رواية البروتين مرنا، البروتين الرنا الميكروي، وتفاعلات البروتين البروتين 10،25. هنا، ونحن نقدم بروتوكول شامل لتحديد تكوين الأداء الملاحي المطلوب في ثقافة الخلية. يسمح لدينا وسيلة لتقييم المستهدفة وعلى نطاق الجينوم من التفاعلات الحيوية والبروتينات الحمض النووي الريبي، فضلا عن القبض على المجمعات الأداء الملاحي المطلوب نادرة و / أو عابرة.
وقد ساهم تطبيق هذه التقنية لتوصيف لدينا من الرنا ملزمة DHX9 / RNA هيليكاز ألف وساعدتنا على تحديد تنظيم حرج بعد النسخي من الفيروسات والخلوية بروتو الجينات المسرطنة جند 6،26 وحور (فريتز وبوريس-لوري ، بيانات غير منشورة). نتوقع تطبيق هذه التقنية في الدراسات المستقبلية لتعزيز فهمنا لآليات حاسمة للسيطرة على الجينات، بما في ذلك تلك التي تتوسط فيها المجمعات طويلة غير الترميز الأداء الملاحي المطلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
والكتاب الامتنان الدعم من قبل المعاهد الوطنية للصحة P50GM103297، P30CA100730 والشامل للسرطان P01CA16058.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F.
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
