Introduction
Post-transkriptionell genexpression är exakt reglerad, som börjar med DNA-transkription i kärnan. Styrs av RNA-bindande proteiner (RBP-anordningama), mRNA biogenes och metabolism förekommer i högdynamiska ribonukleoprotein partiklar (RNP), som associerar och separera med en substratprekursor mRNA under utvecklingen av RNA metabolism 1-3. Dynamiska förändringar i RNP komponenter påverkar den posttranskription öde en mRNA och kvalitetssäkra under bearbetningen av primära transkript, deras nukleära handel och lokalisering, deras aktivitet som mRNA mallar för översättning, och slutligen omsättning av mogna mRNA.
Talrika proteiner betecknas som RBP-anordningama i kraft av deras konserverade aminosyradomäner, inklusive den RNA-igenkänningsmotivet (RRM), det dubbelsträngade RNA-bindande domän (RBD) och sträckor av basiska rester (till exempel arginin, lysin och glycin) 4. RBP-anordningama är rutinmässigtisolerades genom immunfällning strategier och screenas för att identifiera sina besläktade RNA. Vissa RBP-anordningama samar reglera pre-mRNA som är funktionellt relaterade, betecknade RNA reguloner 5-8. Dessa RBP-anordningama, deras besläktade mRNA, och ibland icke-kodande RNA, bildar katalytiska RNP som varierar i sammansättning; deras unika beror på olika kombinationer av tillhörande faktorer, liksom till den temporala sekvensen, plats och varaktighet av deras interaktioner 9.
RNA immunoprecipitation (RIP) är en kraftfull teknik för att isolera RNP från celler och för att identifiera associerade transkript med hjälp av sekvensanalys 10-13. Flytta från kandidat till Genomvid screening är möjlig genom RIP kombinerat med en microarray analys 14 eller hög genomströmning sekvensering (RNAseq) 15. På samma sätt kan samutfällning proteiner identifieras genom masspektrometri, om de är tillräckligt rikliga och skiljas från samutfällning antikropp 16,17. Här, vi tar upp den metod för att isolera RNP-komponenterna i en specifik cognate RNA från odlade humana celler, även om tillvägagångssättet är ändringsbar för lösliga lysat av växtceller, svampar, virus och bakterier. Nedströms analyser av materialet innefattar identifieringskandidat och validering av immun, masspektrometri, biokemisk enzymatisk analys, RT-qPCR, microarray, och RNAseq, som sammanfattas i figur 1.
Med tanke på den grundläggande roll som RNP i att kontrollera genuttryck vid posttranskriptionsnivå, att förändringar i uttrycket av komponent RBP-anordningama eller deras tillgänglighet besläktade RNA kan vara skadligt för cellen och är förknippade med olika typer av sjukdomar, inklusive neurologisk sjukdom 18. DHX9 / RNA-helikas A (RHA) är nödvändig för översättning av utvalda mRNA av cellulära och retrovirala ursprung 6. Dessa besläktade RNA uppvisar strukturellt relaterade cis-verkande element inom deras5 'UTR, vilket betecknas som den post-transkriptionella styrelement (PCE) 19. RHA-PCE aktivitet är nödvändig för att effektivt cap-beroende översättning av många retrovirus, inklusive HIV-1, och av tillväxtreglerande gener, inklusive Jund 6,20,21. Kodas av en essentiell gen (dhx9), är avgörande för celltillväxt och dess nedreglering RHA eliminerar cellviabilitet 22. Den molekylär analys av RHA-PCE RNP är ett viktigt steg för att förstå varför RHA-PCE aktivitet är nödvändigt för att kontrollera celltillväxt.
Den exakta karakteriseringen av RHA-PCE RNP komponenter vid steady state eller vid fysiologisk störning av cellen kräver selektiv anrikning och fånga av RHA-PCE RNP tillräckligt överflöd för nedströms analys. Här var retroviralt PCEgag RNA taggade med 6 kopior av cis-verkande RNA-bindningsstället för MS2-höljeproteinet (CP) inom den öppna läsramen. MS2-höljeprotein var exogenously samuttryckt med PCEgag RNA genom plasmidtransfektion att underlätta RNP aggregatet i växande celler. RNP innehållande MS2-höljeproteinet med besläktat MS2-taggade PCEgag RNA immunutfälldes från cellextraktet och infångades på magnetiska pärlor (Figur 2A). Att selektivt fånga RNP komponenter bundna till PCE, var det immobiliserade RNP inkuberades med en oligonukleotid komplementär till sekvenser distala till PCE, som bildar en RNA-DNA-hybrid, som är substratet för RNas H-aktivitet. Eftersom PCE är placerad i 5 'terminalen av den 5'-otranslaterade regionen, oligonukleotiden var komplementär till de RNA-sekvenser som gränsar till den retrovirala translationsstartstället (gag-startkodonet). RNas H-spaltning i närheten av gag-startkodonet släppte 5 'UTR komplexet från immobiliserat RNP, som uppsamlades som elueringsmedel. Därefter ades provet utvärderades genom RT-PCR för att bekräfta infångning av PCEgag och genom SDS PAGE och immunoblotting för att bekräfta capture av målet MS2 päls protein. En kontroll av den PCE associerade RNA-bindande proteinet, DHX9 / RNA-helikas A, genomfördes därefter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
| buffertkompositioner |
| Tvättbuffert: |
| 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 |
| 150 mM NaCl |
| 3 mM MgCl2 |
| Buffert med låg salthalt: |
| 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 |
| 10 mM NaCl |
| 3 mM MgCl2 |
| 2 mM DTT |
| 1x proteasinhibitorcocktail EDTA-fri |
| RNas Out 5 ul / ml (RNas-hämmare) |
| Cytoplasma Lysis Buffer: |
| 0,2 M Sackaros |
| 1,2% Triton X-100 |
| NETN-150 Wash Buffer: |
| 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 |
| 150 mMNaCl |
| 0,5% NP-40 |
| 3 mM MgCl2 |
| 10% glycerol |
| Binding Buffer: |
| 10 mM HEPES pH 7,6 |
| 40 mM KCl |
| 3 mM MgCl2 |
| 2 mM DTT |
| 5% glycerol |
Tabell 2: Buffert kompositioner.
1. Framställning av de celler och affinitetsmatrisen
- Kultur en cellinje av intresse för sub-konfluens (80%) i en 10 cm skål. Använd 10 cm plattor för oberoende immunoprecipitationer (IP) av en FLAG-märkt NLS-MS2 päls protein. Utföra IP användning av antisera till FLAG-epitopmärkning. När uttrycker FLAG-märkta MS2 päls protein plasmid, transfektera celler 24-48 h före skörd 20.
OBS: En särskild RNP kan anrikas från kärn- eller cytoplasmanic lysat eller ett biokemiskt-fraktionerad beredning, såsom fraktioner av en sackarosgradient. Det rekommenderas att skörda lysatet från icke-transfekterade celler parallellt för att inleda en ytterligare negativ kontroll. - Överföring 60 l per IP protein G magnetiska pärluppslamningen till en 1,7 ml mikrocentrifugrör.
- Placera röret på en magnet rack för mikrocentrifugrör att separera pärlorna från lagringslösningen.
- Ta bort förvaringslösningen genom att försiktigt dra upp det med en mikropipett.
- Ta bort röret från magneten rack.
- Tvätta och jämvikt pärlorna med 600 pl (10 gånger den använda volymen av kulor) 1x tvättbuffert (20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 3 mM MgCl2 och 150 mM NaCl) och slut-over-end rotation för 3 min vid rumstemperatur.
- Placera röret på magnet rack och avlägsna tvättbufferten.
- Tillsätt 10 volymer (600 fil) av 1x tvättbuffert och immunoprecipitating FLAG antikropp mot ekvilibrerats protein G magnetiska pärlor (enligt det belopp som rekommenderas av tillverkaren för en immunoprecipitation) och rotera ände-över-ände vid rumstemperatur i minst 30 minuter för att konjugera immunoprecipitating antikropp. Använd motsvarande isotyp IgG som en lämplig antikropp negativ kontroll.
- Placera röret på magneten rack för att samla pärlorna och avlägsna supernatanten.
- Ta bort röret från magneten rack och tvätta de antikropps konjugerade pärlor med 10 volymer (600 | il) av 1 x tvättbuffert och rotation under 3 min vid rumstemperatur. Upprepa detta steg två gånger.
- Placera röret på magnet rack och avlägsna tvättbufferten.
2. Skörd av RNP
OBS: Förbered RNP under inkubationstiden efter steg 1,8.
- Avlägsna odlingsmediet från cellerna genom aspiration och tvätta cellerna två gånger med 1-5 ml iskall 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Använda ett cellskrapa för att rycka loss våt,vidhäftande celler före samlingen genom centrifugering vid 226 xg under 4 minuter vid 4 ° C.
- Lägg 375 | il iskall, låg saltbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 3 mM MgCl2; 10 mM NaCl; 2 mM DTT; 1x proteas-inhibitor cocktail, EDTA-fri, och 5 | j, l / ml RNas-inhibitor) till cellpelleten och tillåta svullnad genom att placera den på is i 5 minuter.
OBS: Tailor volymen av svag saltbuffert enligt storleken hos cellpelleten. För 1,2 x 10 6 celler från en 10 cm platta, räcker 375 pl buffert. - För att samla den cytoplasmatiska cellysatet, tillsätt 125 | il iskall lysbuffert (0,2 M sackaros / 1,2% Triton X-100), och sedan utföra 10 slag med en Dounce homogenisator som var pre-kyld i en ishink.
OBS: För att samla den totala cellextrakt, är standard RIPA lysbuffert rekommenderas för solubilisering nukleoplasman / kromatin. - Spin i en mikrofug vid högsta hastighet (16.000 xg) under 1 minut; detta kommer att klara supernatanten skräp ennd kärnor.
- Överför supernatanten till ett nytt 1,7 ml mikrocentrifugrör som har varit på is. Bestämma den totala proteinkoncentrationen genom en standard, laboratorie föredragen metod, såsom Bradford Assay 23. Reservera en alikvot av åtminstone 10% för en Western blot-analys, som skall användas som en ingångskontroll. Använd den skördade cellysatet omedelbart för immunoprecipitation eller förvara den vid -80 ° C för framtida analys.
OBS: I vår erfarenhet, kan dessa prover lagras och användas flera månader senare för immunoprecipitation analys utan en kompromiss av integritet.
3. Immunfällning
- Lägg till önskad volym av den skördade cellysatet, baserat på proteinkoncentrationen bestämd i steg 2,5, till mål-antikropp-konjugerade pärlor. Använda 1x tvättbuffert, att den totala volymen upp till 600 l och rotera end-over-end under 90 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Denna tidsperiod är tillräcklig för att genereraen robust isolering av hög affinitet RNP-komplex och samtidigt minimera icke-specifik bindning. Späd alternativa RNP källor, såsom fraktioner av en sackarosgradient, åtminstone 1: 1 med 1x tvättbuffert, och sedan inkubera dem med tidigare framställda pärla-antikroppskomplex, såsom nämnts ovan. - Efter 90 min inkubation, placera IP röret på magneten rack för att samla pärlorna. Reserverar supernatanten som genomströmning.
OBS: Denna första genomflöde är en viktig kontrollprov för att mäta IP effektivitet. En immunoblot-analysen kommer att ge en indikation på IP effektivitet, liksom specificiteten hos de undersökta interaktioner. Det rekommenderas att hålla denna supernatant för nedströms analys. - Tvätta RNP bundna, antikropp-konjugerade pärlor med 10 volymer (600 fil) av iskall NETN-150 tvättbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3 mM MgCl2; 0,5% NP40; och 10% glycerol) under rotation under 3 min vid rumstemperatur. Upprepa steg 3 gånger.
OBS: Denna buffert skiljer sig från lysbuffert och effektivt minskar svaga eller icke-specifika föreningar. - Efter den slutliga tvättningen, resuspendera immobiliserade RNP-komplex i 60 | il iskall 1x bindningsbuffert (10 mM HEPES, pH 7,6; 40 mM KCl; 3 mM MgCl2; 5% glycerol, och 2 mM DTT) och reserven 10% av det immobiliserade komplexet pärlor för Western blöt och 20% för RNA-isolering.
4. Eluering
- Justera den kvarvarande volymen till 100 | al med iskall 1x bindningsbuffert och värm röret vid 70 ° C under 3 min.
- För att isolera besläktade RNA-proteinkomplex, tillsätt en ~ 30-nt DNA-oligonukleotid som är komplementär till 3'-sekvensen gränsen av RNA av intresse och inkubera under 30 min vid rumstemperatur med försiktig skakning (100 nM oligonukleotid är tillräckligt).
OBS: Oligonukleotiden är antisens till de nukleotidrester intill translationsstart-stället i PCE-konstruktionen används som en example i detta protokoll. Lämplig sekvens komplementaritet tillhandahålls av ~ 40% GC-innehåll. Utforma antisensoligonukleotiden för effektiv hybridisering till den minimala komplementära regionen av mål-RNA. - Lägga 5-10 enheter av RNas H till röret och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme för att klyva RNA hos RNA: DNA-hybrid. Överför supernatanten till en steril 1,7 ml mikrocentrifugrör; detta prov innehåller de fängslade RNP-komplex av intresse.
OBS: Beroende på tillgängligheten av besläktade RNA, kan två eller flera omgångar av RNas H behandling vara användbar för att öka prov överflöd för de efterföljande analyserna. - Använda 20% av eluatet i en Western blöt för kända associerade proteiner och 20% av eluatet för RNA-isolering följt av RT qPCR. De återstående 60% kan användas för masspektrometri eller för att identifiera proteinkomponenter.
- Parallellt utsätta en alikvot av den reserverade cellysatet till RNA-isolering och RT-PCR-analys. denna assessment ger en indikation på anrikningen av RNA inom en RNP-komplex.
Anmärkning Använd den isolerade proteinberedningen i ett styr western blöt för att försäkra sig om att RNas-H-spjälkning var effektiv i att frigöra RNP från immunuoprecipitated komplexet.
5. Protein Elektrofores och Western blot-analys
- Ämne cirka 10-20% av det totala urvalet för SDS-PAGE och immunblotanalys enligt standard laboratorieprotokoll.
OBS: Detta steg tjänar till att validera IP effektivitet och specificitet före nedströms RNA-analys. Den kan också användas för att bedöma proteinkompositionen hos det isolerade RNP-komplexet.
6. Insamling av det immunfällda RNA
OBS: RNA-isolering kan göras genom Trizol-metoden eller efter den beskrivna protokollet.
- Resuspendera hälften av den totala provet i 750 pl syra guanidiniumtiocyanat reagens och inkubera vid rums temperatur- under 5 minuter före extraktion av RNA från de infångade PCE-RNP-komplex.
- Tillsätt 200 ul av kloroform till röret, skaka kraftigt i 10 sek, och inkubera vid rumstemperatur under 3 min.
- Efter centrifugering vid 16.000 xg under 15 min vid 4 ° C uppsamlades den vattenhaltiga fasen in i nytt rör och tillsätt en lika stor volym isopropanol. Blanda väl och inkubera vid rumstemperatur under minst 10 min. Tillsätt 1 l av glykol blå till provet och förvara den vid -20 ° C i frysen för effektiv utfällning eller behandling vid en senare tidpunkt.
- Centrifugera röret vid 16.000 xg under 10 min vid 4 ° C. Noggrant samla in och kassera supernatanten för att inte störa RNA pelleten; användning av en p-200 mikropipett spets rekommenderas att underlätta denna process.
- Tillsätt 500 pl av 75% etanol till varje rör, vortexa, och centrifugera rören vid 16.000 xg under 5 min vid 4 ° C. Noggrant samla in och kassera supernatanten som i steg 6,4. Luft-torka pelleten i 2-3 min och återsuspendera i 100 pl RNas-fritt vatten.
OBS: inte förlänga tiden pelletslufttorkas för att undvika problem med blandning. - Tillsätt 100 pl RNA-prov till en RNA-sanering kolonn. Behandla den med hjälp av tillverkarens protokoll. Eluera RNA i 30 pl RNase-fritt vatten och förvara vid -80 ° C i upp till 3 månader.
OBS: Detta isolerade RNA är lämplig för efterföljande analys av RT-realtids-PCR (qPCR), microarray, och RNA-sekvensering. Beroende på överflödet av RNP och den effektivitet med vilken den RNP av intresse isoleras, kan samma lysat utsättas för två eller flera omgångar av IP för att generera tillräcklig RNA tillämpliga för nedströms analyser.
7. RNA omvänd transkription och amplifiering av cDNA genom PCR
- Utsätta det isolerade RNA: t för att omvänd transkription av en slumpmässig primer med en högkvalitativ omvänt transkriptas (RT), enligt den manufacturer anvisningar.
- För att amplifiera RNA av intresse, designa en genspecifik antisensprimer inom RNas-H klyvningssekvensen. Använda liknande mängder av antisens-oligonukleotiden, en slumpmässig primer eller en oligo-dT-primer (se Material tabell).
OBS: oligo-dT-primer och poly-adenylerade mRNA ge positiva kontrollreaktioner för RT-PCR-reaktioner. - Reserve 5% av RT-reaktionen (1 | j, l) för en preparativ qPCR gjort i tandem med negativ-kontroll-lysat IP och positiv-kontroll DNA-prov för att definiera cutoff och producera en standardkurva. Om CT värdet av framställnings qPCR ligger utanför området för standardkurvan, späd RT-reaktionen i rad 1: 5 späd och upprepa steg 7,2.
OBS: För en RNA-sekvensering och masspektrometri teknik, se kompletterande metod filen. Klicka här to se denna kompletterande metod fil. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidigare RIP resultat identifierade retrovirala gag-RNA och utvalda cellulära RNA som samfällning med DHX9 / RHA, inklusive HIV-1 sex, Jund 6 och HUR (Fritz och Boris-Lawrie, opublicerad). Den retroviral 5 'UTR har visats samutfällning med DHX9 / RHA i kärnan och att samarbeta isolera i cytoplasman på polyribosomer. Det är unikt definieras som cis-verkande efter transkriptionskontrollelement (PCE) 6. För att isolera PCEgag RNA-RHA ribonukleoprotein komplex (RNP) som bildats i celler som förökar sig, utförde vi FLAG-MS2 RNP immunoutfällning i transfekterade HEK293 cellysat. Resultaten visar effektiv utfällning av FLAG-MS2 protein. Noterbart är DHX9 / RHA identifieras inom denna RNP komplex och inte i IgG isotyp kontroll eller inom negativ kontroll HEK293 cellysatet (Figur 2A). Matrisen innehåller RNP inkuberades med en kompletterande 30-NT oligonukleotid, och sedan en RNas-H-spjälkning av RNA-DNA-hybriden utfördes. Upon RNas H digererades eluaten analyserades med Western blotting. Den demonstrerade RNas-H-spjälkning av PCEgag RNA vid RNA-DNA-hybrid läge släppt den RNP-komplexet specifikt bunden till 5'-UTR. De DHX9 / RHA-associerade RNP var fast beslutna att berikas i eluenter. Viktigare, FLAG-MS2-bundna RNP återstod med de antikropps konjugerade pärlor (Figur 2B). Co-immunoprecipitation av MS2 stam-slinga som innehåller retroviralt PCEgag RNA i celler och eluenter validerades genom RT-PCR och qRTPCR (figur 2C). Resultaten bekräftade en utvald förening mellan DHX9 / RHA och retroviral 5 'UTR, som har lyfts fram som en unik RNP viktig för riktad translationskontroll 6.
Figur 1: RNP isolering och anrikning av specifika RNP som är associerade med 5 'UTR av PCEgag genom RNas-H-spjälkning. Arbetsflöde som visar stegen för att isolera en utvald ribonukleoprotein bildas de novo i celler, sin samling av oligonukleotid-styrd RNasH klyvning, och nedströms analys av RNA och proteinkomponenter. Sammanfattning av affinitetskromatografi med användning av en hög affinitet interaktion mellan multimerer för MS2 RNA stam-slingan och MS2 päls protein FLAG-fusionsprotein för att fånga PCE-RNA på FLAG pärlor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: En PCEgag RNA innehållande 6 MS2 RNA-bindningsställen fångades av ett immobiliserat FLAG-märkt MS2-höljeproteinet, och specifika RNP som är associerade med 5 'UTR varfrigöras genom oligonukleotid-styrd RNas-H-spjälkning. HEK293-celler samtransfekterades med pAR200 (en plasmid innehållande PCEgag och 6x MS2 loopar i HIV intron) och en plasmid som uttrycker FLAG-epitopen-taggade MS2 protein med en nukleär lokaliseringssekvens (NLS). Cellerna uppsamlades och cytoplasman isolerades på 48 h efter transfektion. De cytoplasmatiska lysaten utsattes för immunutfällning med antingen FLAG-antikropp eller en IgG-kontroll. (A) IP effektivitet bestämdes genom immunoblot med användning av en anti-FLAG-antikropp. DHX9 / RHA, en PCE-bindande protein, tjänade som en positiv kontroll; PCE-innehållande RNA immunutfälldes med MS2-proteinet. Lanes 1-3: Ingångs proteiner som används för IP. Banorna 4-5: FLAG IP av FLAG MS2 uttryckt lysat och HEK293 cytoplasmisk cellysat. Bana 6: IgG IP av FLAG MS2 uttryckt lysat. Banorna 7-9: Genomflöde av IP-adresser. (B) 5 'UTR-bundna RNP anrikades av RNas-H-spjälkning. Lanes 1-3: Eluat av 5'-UTR-bundet protein genom RNas H. Lanes 4-6: proteiner bundna till antikropp-konjugerade pärlor. (C) omvänt transkriptas-PCR och realtids kvantitativ PCR av specifik RNA bunden till olika fraktioner av RNP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNP isolering och besläktade RNA identifierings strategi som beskrivs här är en selektiv sätt att undersöka en specifik interaktion RNA-protein och att upptäcka kandidatproteiner samtidigt reglera en specifik RNP i celler.
Fördelen med att använda oligonukleotid-styrd RNas-H-spjälkning för att isolera RNP är förmågan att fånga och särskilt analysera den RNP cis-verkande RNA-elementet över heterogena RNP bundna nedströms till cis-agerande RNA-element av intresse. Eftersom överflödet av en besläktad RNA i en given RNP är en mindre del av de insamlade RNP isolerade utan RNas H-spaltning, den stora nackdelen med detta arbetsflöde är bristen på det besläktade RNP. I vår erfarenhet, krävde denna begränsning 5- till 10-faldigt mer utgångsmaterial än konventionella RNA IP för detektion i känsliga immunoblot och proteomik analyser. En annan fördel med att immobilisera RNP är att underlätta för att upprepa RNas H treatment och samla ytterligare eluatet. I vår erfarenhet, 2-4 rundor av RNas H behandling var lämpligt att samla in ytterligare eluatet.
I detta protokoll är viktiga tekniska problem att upprätthålla den optimala temperaturen och garantera steril hantering av reagenserna. Alla reagens bör vara RNase- och proteas-fri. Integriteten av RNA-provet är en potentiell fallgrop att överväga om en RNA-proteininteraktion är inte upptäckas.
Denna teknik kräver en effektiv lys av cellerna för att komma åt RNP i en lämplig kvantitet för detektering. Medan ett viktigt förbehåll är ofullständig cellysering, kan kraftfulla behandlingar öka icke-specifika interaktioner med RNA. Därför bör de experimentella betingelserna mätas för att anrika specifika protein-RNA-interaktioner. Emellertid kan användningen av hög stringens tvättar bort viktiga men övergående interaktioner. Därför är de tvättbetingelser är en annan variabel för att consider i de särskilda omständigheterna i ett särskilt experiment.
RIP effektivitet är en kraftfull teknik för att isolera besläktade RNA proteinpartner, men vissa övergående eller svag växelverkan som är av fysiologisk betydelse försvinner under de bindande eller tvättsteg. Tvärbindning av mRNP komplexet är ett alternativ att överväga i en analys. Dessutom bör fysiologiska tillväxtförhållanden hållas i minnet samtidigt analysera reglerings RNP, som uttrycksnivån för den besläktade RNA eller RBP kan vara föremål för fysiologiska variationer på vissa villkor. Vidare kommer typen av nedströms analys också spela en roll i valet av lys och tvättbetingelser under immunoprecipitation.
Dessutom kräver den framgångsrika immunoutfällning att cellysatet avsevärt utspädd (minst 1: 1). 1x tvättbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,3; och 150 mM NaCl; 3 mM MgCl2) är den valda utspädningsmedlet, som dess kompositionpåverkar inte RNP integritet, lösning löslighet, eller antikropp-antigen-interaktioner.
För nedströms masspektrometri, ska proverna vara fri från salter, inklusive Na +, Cl -, och Tris, samt några rengöringsmedel. Om det är nödvändigt kan föreningar-komponenter av buffertar-de joniska minskas genom dialys eller jonbyte filtrering, och i vissa fall, flyktiga buffertar är användbara i de sista stegen. I de fall då antiserum används för att isolera en epitop-märkt protein uttryckt genom transfektion, bör Western blot-validering av det rekombinanta proteinet med användning av initiala cellysat exekveras innan vidare analys. I det fall en epitopmärkning används (dvs., FLAG, MYC, GFP, etc.) är avgörande för framgången av antikroppen bindningssteget exponering av taggen. Frysning-tining av prover bör undvikas.
RIP teknik har i stor utsträckning används för att belysa olika mekanismer för post-transkriptionell genkontroll10,25. Detta innefattar identifiering av nya protein-mRNA, protein-mikroRNA, och protein-proteininteraktioner 10,25. Här ger vi en omfattande protokoll för bestämning av RNP komposition i en cellodling. Vår metod gör det möjligt att målinriktat och genomet hela bedömningen av kritiska protein-RNA-interaktioner, liksom för fångst av sällsynta och / eller övergående RNP komplex.
Tillämpningen av denna teknik har bidragit till vår karakterisering av RNA är bundna av DHX9 / RNA-helikas A och hjälpte oss att definiera den kritiska post-transkriptionell reglering av retrovirus och de cellulära proto-onkogener Jund 6,26 och HUR (Fritz och Boris-Lawrie , opublicerade data). Vi förväntar tillämpningen av denna teknik i framtida studier för att öka vår förståelse av de kritiska mekanismer för genkontroll, inklusive de som förmedlas av långa icke-kodande RNP-komplex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt stöd av NIH P50GM103297, P30CA100730 och Comprehensive Cancer P01CA16058.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F.
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
