Preparación de muestras para análisis de masas Citometría

Resumen

Este artículo describe la recolección y el procesamiento de muestras para el análisis de citometría de masas.

Resumen

Masa utiliza citometría de anticuerpos conjugados con etiquetas de metales pesados, un enfoque que ha aumentado considerablemente el número de parámetros y oportunidades para el análisis profundo mucho más allá de lo que es posible con el flujo basado en la fluorescencia convencional citometría. Como con cualquier nueva tecnología, hay pasos críticos que ayudan a asegurar la generación fiable de datos de alta calidad. Se presenta aquí un protocolo optimizado que incorpora múltiples técnicas para el procesamiento de muestras de células para análisis de masas citometría. Los métodos descritos aquí ayudarán al usuario a evitar los errores comunes y lograr resultados consistentes al minimizar la variabilidad, que puede conducir a datos inexactos. Para informar el diseño experimental, la razón de pasos opcionales o alternativos en el protocolo y su eficacia en el descubrimiento de nuevos hallazgos en la biología del sistema que está siendo investigado está cubierto. Por último, los datos representativos se presenta para ilustrar resultados esperados de la Presente técnicasd aquí.

Introducción

Citometría permite la medición simultánea de múltiples objetivos de anticuerpos en un único nivel celular a través de grandes poblaciones de células. En tradicional citometría de flujo basada en fluorescencia, el número de parámetros que pueden cuantificarse está limitada por la superposición espectral entre el espectro de emisión de múltiples fluoróforos, que requiere cálculos de compensación cada vez más complejos como el número de parámetros aumenta. Estas limitaciones se abordan en masa citometría, donde se detectan y cuantifican por tiempo de vuelo (TOF) espectrometría de masas para ampliar en gran medida el número de parámetros recogidos simultáneamente y produ....

Protocolo

1. La recolección celular

1. Recolección de células de tejido primario
   NOTA: El proceso descrito para las células de recolección de tejido primario es específicamente aplicable a los tejidos de tumor de mama de ratón y puede no ser aplicable como es de tejidos primarios de otras fuentes.
   1. Preparar tampón de digestión por disolución de 5 mg de hialuronidasa y colagenasa 30 mg en 10 ml de medio DMEM / F12 por gramo de tejido a procesar. Filtrar esterilizar tampón de digestión.
   2. Aislar tumor de la glándula mamaria primaria de ratón y tumor ficha peso.
   3. Picar tejido con # 10 bisturí durante al menos 5 min.

Resultados

El protocolo que se presenta aquí se puede aplicar en general a una amplia variedad de muestras de células cultivadas y primario con sólo modificaciones menores. Dependiendo de los requisitos del experimento, se puede realizar de una manera modular cuando ciertos elementos, tales como códigos de barras o de la superficie celular de la tinción, no son necesarios. Utilizado en su totalidad este protocolo permite la preparación de la masa multiplexada citometría de muestras marcadas para la.......

Discusión

El protocolo aquí presentado se ha empleado con éxito para el tratamiento de varias líneas cultivadas de células (H1 y H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) y muestras de tejidos primarios (médula ósea de ratón, el hígado embrionario de ratón, ratón adulto hígado, tumor de ratón). Independientemente de la fuente, cualquier tejido que puede ser disociado en las células individuales, preservando el estado celular debe ser susceptibles de análisis por citometría de masa, pero puede requerir alguna optimizació.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit medio mTeSR1	Tecnologías de células madre	05850	Calentar a temperatura ambiente antes
de usar DMEM F-12	ThermoFisher	11330-032	Calentar a 37  ° C antes de usar
Accutase	Stem Cell technologies	07920	Warm at 37  ° C antes de usar
Albúmina sérica bovina	Equitech	BAH62
solución salina tamponada con fosfato	Hyclone	SH30256.01
Saponina	Sigma-Aldrich	47036
Cell ID Pt194	Fluidigm		Proporcionado en 1  mM
ID de celda pt195	fluidigm		proporcionado en 1  mM
ID de celda pt196	fluidigm		proporcionado en 1  mM
Cisplatino	Enzo Ciencias de la Vida	ALX-400-040-M250	Soluble a 25  mg/mL en DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Kit de códigos de barras	Fluidigm	201060
5-Iodo-2'-desoxiuridina	Sigma-Aldrich	I7125	Soluble a 74  mg/mL en 0,2 y nbsp; N NaOH
Rodio 103 agente intercelante	Fluidigm	201103A
Metanol	Fisher	BP1105-4	Enfriar a -20  ° C antes
de usar Azida de Sodio	Sigma-Aldrich	S2002
5 mL tubos de fondo redondo	Falcon	352058
5 mL 35 μ Tubos de tapón de filtro m	Falcon	352235
EQ perlas de calibración de cuatro elementos	Fluidigm	201078
Hialuronidasa Tipo I-S	Sigma-Aldrich	H3506
Colagenasa de Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Bisturí Desechable #10	Sigma-Aldrich	Z69239