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Trasplante en la almohadilla del ratón de ovario grasa

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DOI:

10.3791/54444

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7 de septiembre de 2016

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1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

En este artículo

Resumen

Se describe un ensayo de trasplante de la almohadilla de moda de ovario adecuado para estudios de epitelios normales y transformadas del tracto reproductivo femenino. La almohadilla de grasa del ratón permite el trasplante de fragmentos grandes de tejido, es de fácil acceso para la cirugía y la imagen, y proporciona el entorno nativo más favorable para los tejidos de origen de Müller.

Resumen

Los ensayos de trasplante ortotópico en ratones son invaluables para los estudios de regeneración celular y transformación neoplásica. Los abordajes comunes para el trasplante ortotópico de la superficie ovárica y los epitelios tubáricos incluyen la administración intraperitoneal e intrabursal de células. Las limitaciones respectivas de estos métodos incluyen una ubicación mal definida de las células inyectadas y un volumen de espacio limitado. Además, son poco adecuados para la preservación estructural a largo plazo de los órganos trasplantados. Para abordar estos desafíos, hemos desarrollado un enfoque alternativo, que se basa en la introducción de células y fragmentos de tejido en la almohadilla de grasa del ratón. La almohadilla de grasa ovárica de ratón se encuentra en las inmediaciones del ovario y la trompa uterina (también conocida como oviducto, trompa de Falopio) y proporciona un microambiente familiar para las células y los tejidos de estos órganos. En nuestro enfoque, las células de ratón y humanas marcadas con fluorescencia, y los fragmentos de la trompa uterina se injertan mediante cirugía de incisión dorsal mínimamente traumática. Las células trasplantadas y sus excrecencias se localizan fácilmente en la almohadilla de grasa ovárica durante más de 40 días. El trasplante a largo plazo de toda la trompa uterina permite la correcta conservación de todos los componentes principales del tejido y no produce efectos secundarios adversos, como fibrosis e inflamación. Nuestro enfoque debería ser aplicable de manera única para responder a preguntas biológicas importantes como la diferenciación, el potencial regenerativo y neoplásico de poblaciones celulares específicas. Además, debe ser adecuado para estudios de factores microambientales en el desarrollo normal y el cáncer.

Introducción

ensayos de trasplante, que implican la introducción de células y tejidos en sitios específicos del cuerpo en ratones, representan un enfoque esencial para los estudios de regeneración de tejidos y la carcinogénesis. trasplantes ortotópicos de células, es decir, su colocación en un medio nativo, son particularmente importantes para la caracterización de células madre adultas. La existencia de células madre mamarias fue sugerido por primera vez por el trasplante de fragmentos de las glándulas mamarias epiteliales en las almohadillas de grasa de la glándula mamaria de ratones libres 1. Ensayos de injerto a la almohadilla de grasa de ratón humanizado 2 se utilizaron para recapitular el desarrollo potencial regenerativo y normal de las células epiteliales de mama primarios humanos. Por otra parte, los trasplantes de dilución en serie y limitantes de tipos de células fenotípicamente distintas en la almohadilla de grasa mamaria despejado fueron cruciales para poner a prueba la capacidad de auto-renovación y diferenciación multilinaje de células madre mamarias 3-5. Los ensayos de trasplante en combinatiónico con rastreadora de linaje genético proporcionado evidencia de la célula de origen en la carcinogénesis mamaria 5. Trasplantes de riñón de la cápsula se utilizan comúnmente para ensayar las propiedades de las células madre de la próstata putativo 6. El trasplante ortotópico de ratón normal y neoplásico y organoides pancreáticos humanos reveló genes y las vías alteradas en la progresión del cáncer 7. La importancia del medio ambiente nativo también ha sido apoyado por la demostración de diversa regeneración después engraftments de las glándulas sudoríparas en diferentes lugares, tales como almohadillas de grasa mamaria, almohadillas de grasa y la piel de los hombros, la espalda 8.

La cavidad peritoneal y la bolsa ovárica se utilizan normalmente como lugares para el trasplante ortotópico de las células epiteliales del tracto reproductor femenino 9-12. Ambos métodos tienen una serie de limitaciones. La inyección intraperitoneal de las células conduce a sus implantaciones en diferentes áreas de la cavidad peritoneal, con lo que comcomplicando la vigilancia del crecimiento celular. Además, las variaciones en el microentorno, tales como la extensión de la vascularización, inervación y la representación de las células inmunes, pueden ser muy importantes en diferentes zonas de la cavidad peritoneal. La bolsa ovárica tiene un volumen muy limitado, lo que permite la inyección de no más de 10 l de líquido. Esto limita significativamente la cantidad de células que se puede administrar. Además, las inyecciones en la bolsa ovárica puede ser bastante difícil técnicamente y el procedimiento requiere una cantidad significativa de tiempo.

Para hacer frente a estas limitaciones, hemos aprovechado las propiedades de la capa de grasa de ovario. La almohadilla de grasa de ovario de ratón tiene un tamaño grande, está al lado del ovario y la trompa uterina, y es fácilmente accesible por medio de cirugía. Se ha informado de que el trofoblasto equina puede ser trasplantado en la almohadilla de grasa de ovario de ratón 13. Sin embargo no se describieron los detalles de este método. Asimismo, no se informó de si esta meDTO se puede aplicar a las células y tejidos adultos. A continuación, describimos un enfoque fiable para el trasplante de células de ratón y humanos del tracto reproductivo femenino y demostramos que este método es también aplicable a los trasplantes de órganos a largo plazo.

Protocolo

Todo el trabajo en vivo descrito es aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales Universidad de Cornell.

1. Preparación de muestras para ensayos de ovario almohadilla de grasa

  1. Aislamiento y cultivo de células primarias de trompas Epitelio (TE)
    1. La eutanasia a los donantes de 6 a 8 semanas de edad virgen proteína verde fluorescente mejorada-β-actina (EFGP) o ratones β-actina-Discosoma proteína roja fluorescente (DsRed) por CO 2 administración seguido por dislocación cervical. Verificar la eutanasia con éxito por una pizca dedo del pie.
    2. Coloque un ratón individual en una cortina absorbente, lado ventral hacia arriba, y luego limpie el abdomen con un 70% de etanol. Abra la piel haciendo una incisión lateral a la línea media del cuerpo y con la punta de los dedos tiran de la piel por encima y por debajo de la incisión hacia la cabeza y la cola del ratón.
    3. Mantenga el peritoneo con unas pinzas romas y hacer un corte con tijeras finas para abrir la cavidad del cuerpo. Empuje suavemente la bobina del intestine un lado y localizar los órganos reproductores.
    4. Con unas pinzas finas recoger un cuerno uterino y debe cortar 0,5 cm por encima del punto en el que se separan los cuernos uterinos. Mientras sostiene el cuerno uterino, diseccionar el tejido conectivo unido a la trompa uterina, trompa uterina, almohadilla de grasa de ovario y cáncer de ovario. Coloque tracto reproductivo diseccionado en un plato con 6 ml estéril salina tamponada con fosfato (PBS). Proceder con el segundo aparato reproductor.
    5. Se pasa la placa a una cabina de bioseguridad y lavar los tejidos 3 veces en 6 ml de PBS estéril. Continuar el trabajo bajo un microscopio de disección situado en la cabina de bioseguridad. Coge el cuerno uterino con unas pinzas finas y desconecte el cuerno uterino de la trompa uterina mediante el corte en la unión útero-tubárica. Cortar la bolsa ovárica que rodea el ovario mediante el uso de una aguja de 25 G.
      Nota: Después de la bolsa ovárica se ha eliminado, la disección es completa y la trompa uterina individuo permanece en la solución de PBS.
    6. Transferir una cabeza del ctrompa uterina e en una caída de 50 l de PBS a una placa de 3,5 cm y tiene pelos en trozos de 0,1 mm utilizando agujas de calibre 28. Traslado a 200 l de tampón de digestión 1 (Modificado (DMEM) F12 de Eagle de Dulbecco () medio de Ham suplementado con 300 unidades ml-1 de colagenasa y 100 unidades de ml -1 hialuronidasa) e incubar durante 1 hora a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora.
    7. Después de la incubación, añadir ácido etilendiaminotetraacético Tripsina-1 ml 0,25% (EDTA) y la suspensión de la solución con la ayuda de una punta de pipeta 1 ml (también conocido como punta azul) 20 veces durante 3 minutos. Añadir 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 medio (de Ham) que contiene suero bovino fetal al 2%.
    8. Recoger los tejidos por centrifugación (600 RCF, 5 min, temperatura ambiente (RT)), y añadir tampón de digestión 1 ml 2 (DMEM F12 () medio de Ham suplementado con 7 mg ml -1 dispasa II y 10 mg ml -1 desoxirribonucleasa I ( DNasa I)). Suspender sedimento de tejido 20 veces con la ayuda de una pipeta de 1 ml tipag.
    9. Añadir medio completo libre de suero de 5 ml del crecimiento del ratón epitelio tubárico (M-TE-GM, Tabla 1).
    10. Recoger las células por centrifugación (600 rcf, 5 min, RT). Añadir 1 ml de M-TE-GM, suspender y contar las células mediante un hemocitómetro. Semillas 1 x 10 5 células en 1 ml por pocillo en una placa de 24 pocillos de baja unión y se incuban en M-TE-GM a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante 4 días.
    11. Cambiar el medio cada día.
    12. Preparar suspensiones de células individuales de células TE suspensión primaria cultivadas a partir de ratones ß-actina-EGFP o β-actina-DsRed.
      1. Recoger los cultivos en suspensión TE de 24 pocillos placas de fijación bajas. Centrifugar (600 RCF, 5 min, RT), y suspender los sedimentos celulares con 1 ml 0,25% de tripsina-EDTA. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
      2. Deja de actividad de la tripsina mediante la adición de 5 ml de DMEM / F12 medio (de Ham) que contiene suero bovino fetal 5%. Recoger los sedimentos celulares por centrifugación (600 RCF, 5 min, RT).
    13. sedimentos de células de lavado dos veces con 4 ml de PBS frío (4 ° C), se añade 1 ml de PBS por sedimento celular, y suspender. Recuento de células mediante un hemocitómetro y la transferencia a 1,7 ml tubos de centrifugación. Trabajando en hielo, añadir 1 x 10 5 células a 10 l de PBS, a continuación, añadir la matriz de la membrana basal 10 l. Suspender y transportar en hielo a la sala de los animales.
      Nota: Realizar todos los trabajos de disección y el tejido de cultivo en una cabina de bioseguridad en condiciones estériles.
  2. Preparación de la línea celular inmortalizada humana
    1. Por separado crecer lentivirus-EGFP y -mCherry marcado inmortalizada humana superficial del ovario lineHIO118 célula epitelial hasta el 80 - 90% de confluencia en placas de 10 cm a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
    2. Lavar los platos dos veces con 10 ml de PBS, se añade 1 ml de 0,25% tripsina-EDTA por placa y se incuba durante 10 minutos a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Detener la reacción mediante la adición de 10 ml de DMEM / F12 medio (de Ham) que contiene suero bovino fetal 5%. Recogersedimentos celulares por centrifugación (600 rcf, 5 min, RT).
    3. sedimentos de células de lavado dos veces con 10 ml de PBS frío (4 ° C), se añade 1 ml de PBS por sedimento celular, y suspender. Recuento de células mediante un hemocitómetro y la transferencia a 1,7 ml tubos de centrifugación.
    4. Trabajando en hielo, añadir 1,0 x 10 6 células Lenti-mCherry etiquetados + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP células marcadas con 10 l de PBS. Añadir matriz de membrana basal 10 l. Suspender y transportar en hielo a la sala de los animales.
  3. Preparación de la trompa uterina
    1. Diseccionar trompas uterinas individuales de 6 a 8 semanas de edad ratones vírgenes β-actina-DsRed en PBS como se describe en los pasos 1.1.1-1.1.5. Transferencia trompas uterinas individuales en una gota 200 l de PBS con un microscopio de disección. desenrolle suavemente trompas uterinas con la ayuda de pinzas y agujas de calibre 28 mediante la eliminación de la mesosalpinx, una parte del ligamento ancho que soporta los segmentos de la trompa uterina. Coloque trompas uterinas desenrollados individuales en una gota de 200 l de PBS frío hielo hasta que la almohadilla de grasa de ovario del destinatario se expone y se preparó para recibir el trasplante.

2. Trasplante de ovario almohadilla de grasa

Nota: Desinfectar instrumentos entre cada cirugía animal. Preparar y organizar todos los equipos con antelación. trasplantes dorsal a la almohadilla de grasa ovárica derecha son preferenciales ya que esto evita el bazo. Sin embargo, los receptores de trasplantes pueden tener tanto en las almohadillas de grasa de ovario.

  1. Utilizar ratones singénicos o ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID / NCR) como receptores de células primarias. Para las células humanas, tales como células, HIO118 / ratones SCID uso Nod / gamma (GSN) o ratones SCID.
  2. Anestesie ratón receptor con una sola inyección intra-peritoneal de 2,2,2-tribromoetanol a una dosis de 0,15 ml / 10 g de peso corporal. Colocar el animal sobre una almohadilla térmica, en la campana animal y confirmar la anestesia adecuada por la pérdida del reflejo de pedal (pizca dedo del pie). Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras que elanimal es bajo anestesia. Se inyecta por vía subcutánea el animal con el analgésico ketoprofeno en dosis de 4 mg / g de peso corporal para el tratamiento para el dolor post-quirúrgico.
    Nota: Como alternativa, el uso de anestesia con isoflurano. Colocar el animal en la cámara de inducción y ajustar el medidor de flujo de oxígeno al 0,8 a 1,5 L / min y el vaporizador de isoflurano al 2-3%. Retire el animal anestesiado de la cámara, que lo respira isoflurano de una máscara y ajustar el medidor de flujo de oxígeno a 0,4-0,8 l / min y el vaporizador de isoflurano al 1,5%, a continuación, iniciar la cirugía.
  3. Afeitar el área quirúrgica con máquinas de cortar # 40; eliminar el vello de un área de 2 veces el área quirúrgica, preparar la piel afeitada con tres friega antisépticas de povidona yodada, seguido de etanol al 70%, y cubrir con un paño estéril.
  4. Mover el animal bajo un microscopio de disección situado en una cabina de bioseguridad. Exponer el aparato reproductor mediante una incisión en la posición dorsomedial directamente encima de la almohadilla de grasa de ovario.
    Nota: Critpaso ical: incisión de la piel Precise facilita la cicatrización de heridas, el uso de un bisturí se recomienda en el paso 2.4.
  5. Utilizando unas pinzas finas romos tire de la almohadilla de grasa de ovario cuidadosamente a través de la incisión hacia la línea media, se minimiza el daño a los nervios y los vasos sanguíneos principales.
    Paso Crítico: Si se produce una hemorragia, detener la cirugía y considerar el trasplante a un animal huésped diferente.
  6. Bajo el control del microscopio de disección con la ayuda de una aguja de calibre 28 biselado hacer una incisión profunda de 2-4 mm en la almohadilla de grasa de ovario, 3-4 mm por encima del ovario.
    paso crítico: Asegúrese de que la incisión única pasa por la mitad de la almohadilla de grasa; punción de todo el camino a través de la parte inferior provoca fugas. Ser rápida y proceder sin demora después de este paso.
  7. Para los trasplantes de células, llenar una jeringa (aguja de calibre 30) con 10-20 l de la membrana de la matriz-mezcla de células-sótano y se inyecta en la incisión almohadilla de grasa. Para el trasplante de trompa uterina, recoger el ingenio trompa uterinah pinzas finas y colocarlas en 10 - matriz de la membrana basal 20 l mantuvieron en hielo. El uso de un 0,1-10 l / 20 XL graduó punta del filtro (se ha reducido en un 3 mm) recoger el tejido y la suspensión de la membrana basal de la matriz y la liberación en la incisión almohadilla de grasa.
  8. Espere 5 minutos para que la matriz de la membrana basal para solidificar y colocar el tracto reproductivo de nuevo en el peritoneo. Cierre los músculos con 2 puntos de sutura de sutura quirúrgica y la piel con dos clips pequeña herida o sutura quirúrgica.
  9. Repita los pasos 2.4-2.8 para trasplantar una matriz de mezcla de membrana PBS-sótano en la almohadilla de grasa contra-lateral del animal que servirá como control.
    paso crítico: Después de la cirugía de colocar al animal en una almohadilla eléctrica, debido a la pérdida de calor es rápida en ratones anestesiados.
  10. Deje que los animales se recuperan en una almohadilla térmica en la jaula nativa y observar el animal hasta que esté completamente despierto de la anestesia. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado la suficiente conciencia para mantener los esternonesl decúbito. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
  11. Coloque un puñado de bolitas de comida pre-húmedas dentro de la jaula, además de secar el alimento en la jaula después de la cirugía. Aplicar analgésicos post-quirúrgicos si es necesario para los próximos días y examinar la herida diariamente. Aplicar los antibióticos de acuerdo con el protocolo aprobado de animales si se produce la infección de la herida. Retirar grapas para heridas 10 días después de la cirugía cuando la herida se ha cerrado completamente.

3. Histología y Adquisición de imágenes

  1. Injerto de recolección y preservación
    1. Preparar la solución de paraformaldehído al 4% mezclando 26 ml ddH2O con 4 ml 10x PBS y solución de paraformaldehído 10 ml de 16%.
    2. Diseccionar en un bloque, la almohadilla de grasa ingerida en los ovarios, ovario, trompa de Falopio, el útero de 0,5 cm como se describe en los pasos 1.1.1-1.1.4. colocar inmediatamente en 2 ml de paraformaldehído al 4% y fijar durante 2 horas, a temperatura ambiente. Desde el mismo animal, diseccionar la no injertadosistema de almohadilla de grasa de ovario contralateral trasplantados con PBS-sótano mezcla matriz de la membrana como un control (véase el paso 2.9). Fijar y el proceso de la misma manera.
    3. Después del lavado de fijación tejidos tres veces con PBS durante 5 min y se incuba durante la noche en PBS a 4 ° C.
    4. Para todo el montaje en la obtención de imágenes de la almohadilla de grasa de ovario continúe en el paso 3.2.1.
      Nota: Después de que los tejidos de adquisición de imágenes se pueden congelar (3.3.1) o tratados para la inclusión en parafina (3.3.2). incubación durante la noche en 30% de sacarosa en PBS a 4 ° C mejora la calidad de los tejidos congelados.
  2. Adquisición de imágen
    1. Coloque todo el montaje en sistemas de la capa de grasa de ovario en los platos de PBS llenas y la imagen usando un microscopio invertido equipado con el accesorio de epi-fluorescencia y cámara a color de alta definición, con 4, 10 veces más objetivos, y un estereomicroscopio equipado con un accesorio de fluorescencia, cámara a color y el Plan Apo 1xWD70, objetivos ED plan de 1.5xWD45.
  3. Histología
    1. Siguiendotodo el montaje de adquisición de imágenes (3.2.1) se coloca una gota de 200-500 l de medio de inclusión para las muestras de tejido congelado en una pieza de 2 x 1 cm de la película de laboratorio y el uso de fórceps, transferir el tejido de la caída. Recoge la película en un borde y transferir la caída del tejido de mediano a un vial criogénico ml 1.8. Cerrar el vial y sumergirse en nitrógeno líquido. Almacenar tejidos congelados a -80 ° C.
    2. Como alternativa, proceder a la inclusión en parafina estándar. Utilice 20-40 volúmenes de volumen de tejido para cada paso.
      1. Sumergir los tejidos una vez en 65% de etanol durante 30 min, agitando suavemente a TA.
      2. Sumergir los tejidos una vez en 70% de etanol durante 30 min, agitando suavemente a TA. En esta etapa las muestras se pueden almacenar durante meses a temperatura ambiente.
      3. Sumergir los tejidos una vez en 90% de etanol durante 30 min, agitando suavemente a TA.
      4. Sumergir los tejidos una vez en 95% de etanol durante 30 min, agitando suavemente a TA.
      5. Sumergir los tejidos dos veces en etanol absoluto (200 prueba) durante 30 min, agitando suavemente a TA.
      6. Sumergir los tejidos dos veces en cloroformo durante 30 minutos, agitando suavemente a TA.
      7. Sumergir los tejidos una vez en parafina durante 30 minutos, agitando suavemente a 58 ° C.
      8. Sumergir los tejidos una vez en parafina durante 12 horas, agitando suavemente a 58 ° C.
      9. Sumergir los tejidos una vez en parafina durante 3 horas, a 58 ° C.
      10. Colocar en moldes de tejidos histológicos de metal y llenar los moldes con 58 ° C de parafina. Añadir un casete histología de plástico en la parte superior de la parafina y parafina se enfríe a 4 ° C. Extraer bloques de parafina de los tejidos y se almacena a temperatura ambiente.
        Nota: temperatura de parafina no debe exceder de 58 ° C para la conservación óptima de tejido adecuada para tinción inmunohistoquímica.
    3. Alternativamente, Prepárese para la inclusión en parafina con Espécimen de procesamiento del gel.
      1. Aspirar el PBS y transferir los tejidos de todo el montaje y el 70% de etanol. Incubar a temperatura ambiente durante 2 hr. En un baño de agua, la muestra de procesamiento de precalentamiento de gel a 60 ° C.
      2. pipeteee 200 l de gel de procesamiento de muestras en una placa de Petri forrada con película de laboratorio. Utilizando unas pinzas de disección finas transferir todo el montaje del sistema de tejidos a la caída de gel de procesamiento de las muestras.
      3. Deje que el tapón de gel de procesamiento de las muestras se solidifique a temperatura ambiente, o se solidifique el tapón durante 10 min a 4 ° C.
      4. Coloque el tejido embebido gel procesamiento de muestras en cassettes de tejido histología intercaladas entre almohadillas de espuma biopsia. Incrustar en parafina como en los pasos 3.3.2-3.3.2.10.
        Nota: Espécimen de procesamiento incrustación de gel evita la pérdida y permite la conservación de las pequeñas muestras de tejidos frágiles.
        Nota: Los tejidos conservados por congelación o la inclusión en parafina son adecuados para la tinción inmunohistoquímica 14,15.

Resultados

Células y tejidos experimentales pueden ser trasplantados con precisión en la almohadilla de grasa de ovario bajo un microscopio de disección (Figura 1). Los ejemplos incluyen las células del epitelio de las trompas de ratón primarios derivados de ratones de forma ubicua que expresan EGFP (Figura 2A) o DsRed (Figura 2B) y células inmortalizadas humanos superficie del ovario epitelio HIO118 16,17 células marcadas con mCherry y EGFP lentivirus (Figura 2C - F). El enfoque es aplicable para el trasplante a largo plazo de órganos, como la trompa uterina de ratón (Figura 3) también. De acuerdo con la tinción inmunohistoquímica, tanto ciliadas (Foxj1 positiva 14) y células secretoras (Pax8 positiva 15) se conservan en el epitelio de las trompas de tejidos trasplantados (Figura 3D y E).

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Figura 1:. Ovárico almohadilla de grasa Trasplante (A) área expuesta del trasplante (flecha). (B) Se realiza una incisión por un 28 G aguja (flecha). (C) UT / matriz de la membrana basal mezcla de injerto por punta de la pipeta (flecha). (D) UT injertadas (flecha, rojo brillante, UT de los ratones-DsRed β-actina). FP, almohadilla de grasa; Ov, ovario; UT, trompa uterina. Barra de escala = 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Detección de Trasplantados. Alfombrilla de células primarias de epitelio y Tubal humanas inmortalizadas ovárico células del epitelio de superficie (A, B) de salida crecimientos de ratón primaria células del epitelio de las trompas (flechas) de ratones β-actina-EGFP (A, verde) y la beta-actina-DsRed (B, rojo) 8 días después del trasplante en un ratón singénico. (C, D) Engraftments de células mixtas HIO118 (flechas) etiquetados, ya sea con Lenti-EGFP (verde) o Lenti-mCherry (rojo) 10 días después del trasplante en ratones GSN. (D) Área ampliada a partir de (C, flecha). (E, F) del injerto desarrolló 43 días después del trasplante de las mismas células que en C, D para ratón SCID (flechas). AD, M, fluorescencia; E, de campo claro, FP, almohadilla de grasa; Ov, ovario; UT, trompa uterina. (A, B, DF) Barra de escala = 500 micras; (C) Barra de escala = 1,600 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Caracterización de Trasplantes uterino tubo. (A) trompa uterina completa (flecha) de la β-actina-DsRed ratón 6 días después del trasplante en la almohadilla de grasa de ovario (flecha, de color rojo brillante). (B) sección congelada fluorescente de la almohadilla de grasa con el trasplante se muestra en (A). Rojo, DsRed; Azul, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) contratinción nuclear. (C) de la prótesis tubular uterino (flecha) 40 días después del trasplante en GSN ratón receptor (flecha). una sección de parafina. Nota correcta conservación de todos los componentes del tubo uterino principales, y la falta de la fibrosis y la inflamación trasplante asociada. Hematoxilina y eosina. (D, E) La detección de marcadores de epitelio de las trompas-paired box gen 8 (PAX8) y caja forkhead J1 (Foxj1; de color marrón nuclear, puntas de flecha) en las células del injerto (flechas) que se muestran en ( C). sistema de inmunoperoxidasa. Contratinción con verde de metilo. FP, almohadilla de grasa; Ov, ovario; UT, trompa uterina. (A) Barra de escala = 1,000 m; (B) Barra de escala = 200 micras; (CE) Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Componente 1x DMEM F12 medio (Ham)
L-Glutamina 2 mM
pruvate de sodio 1 mM
Factor de crecimiento epidérmico 10 ng ml-1
Básica factor-2 de crecimiento de fibroblastos 10 ng ml-1
hidrocortisona 500 ng ml-1
Insulina 5 mg ml -1
Transferrin 5 mg ml -1
selenita de sodio 5 ng ml-1
albúmina bovina 0,10%
Penicilina / estreptomicina 100 unidades ml -1 / 100 mg ml -1
Medio Eagle (MEM) aminoácidos no esenciales mínimos esenciales 0.1 mM
Beta-mercaptoetanol 10 -4 M

Tabla 1:. Tubal ratón Epithelim Medio de Crecimiento (M-TE-GM) componentes enumerados en la columna de la izquierda se disuelven en 1x DMEM F12 medio (Ham) a las concentraciones indicadas, columna derecha. La composición del medio final es libre de suero.

Discusión

Hemos establecido un ensayo de trasplante de almohadilla de grasa de ovario que permite la entrega precisa y la detección de las células y los tejidos epiteliales. La almohadilla de grasa procedimiento de trasplante de ovario ensayo es técnicamente menos exigente que la inyección de la bursa 10-12 y permite más uniforme y ubicación precisa de las células trasplantadas en comparación con la inyección intraperitoneal 9. También es muy adecuado para el trasplante a largo plazo de todo un órgano, tal como el tubo uterino.

Es importante destacar que la almohadilla de grasa de ovario proporciona un microambiente familiar para los epitelios del sistema reproductor femenino. Debe ser particularmente adecuada para los estudios de las propiedades moleculares y celulares de ovario humano y de ratón y células del epitelio de las trompas durante la regeneración y transformación maligna. A diferencia de otros órganos, pocos estudios se han centrado en la identificación y caracterización de células madre en el epitelio de la r hembratracto EPRODUCTIVA 18,19. Este tipo de estudios son de particular importancia debido a que muchos cánceres se cree que se originan a partir de células madre adultas 20. Aún orígenes celulares de cáncer epitelial de ovario siguen siendo muy discutible 18. Cánceres ováricos epiteliales representan la mayoría de los cánceres de ovario y está en quinto lugar entre todas las muertes relacionadas con el cáncer de las mujeres en los EE.UU. 21. Por lo tanto el desarrollo de un ensayo ortotópico con varias ventajas sobre las técnicas de trasplante existentes 9-12 debería facilitar en gran medida los estudios en esta área.

Dada la localización superficial de la almohadilla grasa de ovario, sistemas de imágenes de animales pequeños se pueden utilizar para el seguimiento de engraftments marcado con fuerte fluorescente o reporteros bioluminiscentes. También debe ser posible establecer ensayos de invasión mínima de formación de imágenes de alta resolución en vivo, como la microscopía no lineal 22. La almohadilla de grasa de ovario también se puede mantener en cultivos de órganos, permite de ese modoing cultivo tridimensional de epitelio normal y neoplásica en condiciones recapitulan de cerca la organización de las células y la matriz extracelular. Los estudios futuros deben abordar estas posibilidades prometedoras.

Varios pasos críticos tienen que ser considerados. Proporcionar una resistencia de calentamiento y mantener caliente roedores durante la cirugía mejora en gran medida la tasa de supervivencia. La esterilidad de los instrumentos de manejo de la almohadilla de grasa se asegura de que los sistemas injertadas se mantienen estériles. En nuestra experiencia, los resultados de un sangrado significativo en el retraso del crecimiento de los trasplantes. Es importante destacar que la almohadilla de grasa de la incisión debe hacerse precisamente por desgarro de la almohadilla de grasa o perforar a través de las causas de sangrado. Coagulantes deben utilizarse para detener el sangrado, según sea necesario. Si engraftments no se desarrollan, una mayor concentración de células inyectadas debe ser considerado. Las primeras excrecencias exitosos pueden observarse tan pronto como una semana después del trasplante y más engraftments debe ser uno visiblemeses después del procedimiento. Para el transplante, agujas con diámetro más grande (23 a 25 G) se pueden utilizar para evitar cortes de las células grandes (más de 10 m de diámetro). Sin embargo, dichas agujas pueden ser más traumática de la almohadilla de grasa y su uso debe ser probado con antelación. Para nuestros experimentos hemos utilizado ratones de donantes y receptores 6-8 semana. Para ambos propósitos ratones jóvenes o mayores pueden ser utilizados. Sin embargo, puede ser necesario ajustar el número de células inyectadas. También será necesario tener en cuenta el menor tamaño de las almohadillas de grasa de ovario en los donantes jóvenes.

Al igual que con cualquier método, hay algunas limitaciones del ensayo de trasplante de almohadilla de grasa de ovario de ratón. Aunque los ratones inmunocompetentes singénicos se pueden utilizar para células / tejidos primarios murinos, nuestra técnica requiere NSG o ratones SCID para el trasplante de material humano. Es probable posible humanizar la almohadilla de grasa para apoyar el crecimiento de células epiteliales humanas. Sin embargo, no hemos probado este enfoque todavía. El uso de más joven Felos machos pueden dar lugar a menores costes de cría; Sin embargo, los ratones hembras vírgenes maduros (edad 8 a 10 semanas) tienen una almohadilla de grasa más grande, permitiendo de este modo el trasplante de las muestras más grandes. Por último, el personal de laboratorio deben ser entrenados en la cirugía de los animales para asegurar la ejecución oportuna y con éxito del procedimiento.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Dr. Andrew K. Godwin, Universidad de Kansas Medical Center, para proporcionar a las células humanas HIO118. Estos estudios fueron apoyados por las subvenciones del Programa de Células Madre de Nueva York (NYSTEM; T028095) y los Institutos Nacionales de / Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (P50HD076210) para AFN Salud, y por las subvenciones de NYSTEM (C028125, C024174 y T028095), Institutos nacionales de / Instituto de Salud Nacional del cáncer (CA182413) y el Fondo de Investigación del cáncer de Ovario (327516) para AYN.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguja de calibre 25BD Becton Dickinson305122
aguja de calibre 28 (jeringa hipodérmica con aguja adjunta)Kendall30339Número de pieza: 8881500014
factor de crecimiento básico de fibroblastos-2 MatrizSigma-AldrichF9786
(Geltrex)InvitrogenA1413202
β-actina-DsRatones rojosEl Laboratorio Jackson6051B6. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J
β-actina-EGFPratones The Jackson Laboratory3291C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J
β-mercaptoetanolSigma-AldrichM7522
albúmina bovinaSigma-AldrichA3311
cloroformoVWREM-CX1058-1
colagenasa/hialuronidasa Technologies7912
viales criogénicosThermo Scientific Nunc377267
dispasa IIWorthingtonNPRO2
DMEM F12 (HAM's)Corning10-092-CV
DNaseI (Desoxirribonucleasa I)Stem Cell Technologies7900
medio de inclusión para muestras de tejido congelado (O. C. T.)Sakura Finetek 4583
factor de crecimiento epidérmicoSigma-AldrichE4127
etanol 200 pruebaKoptecV1001para preparar 70% 
suero fetal bovinoSigmaF4135
punta de filtro 0.1-10/20 y micro; l XL USA Scientific1120-3810
FOXJ1 anticuerpoeBioscienceE10109-1632utilizado a concentración 1:1.000 (sin desenmascaramiento)
hidrocortisonaSigmaH0135
KetoprofenoZoetis4396H
película de laboratorio (Parafilm M)American National CanPM-999
L-GlutaminaCorning25-005-Cl
insulina-transferina-selenito de sodioSigma-AldrichI884
isoflurano, 250 mlSanta Cruz Animal Healthsc-363629Rx
placa de fijación baja 24 pocillosCostar3473
MEM aminoácidos no esencialesCorning25-025-Cl
moldes de histología metálicaCiencias de la microscopía electrónica62527-22
microscopio, microscopio invertidoNikonEclipse TS 100
, estéreoNikonSMZ800
Nod/SCID/gamma (NSG)ratones The Jackson Laboratory05557NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ
solución de paraformaldehído al 16% ElectrónicaMicroscopy Sciences15710
parafina (Paraplast, X-TRA)Fisher Thermo Scientific23-021-401
Anticuerpo PAX8Proteintech10336-1-APutilizado a concentración 1:1.000 (sin desenmascaramiento)
PBS (solución salina tamponada con fosfato)Corning  21-030-CV
penicilina estreptomicinaCorning30-002-Cl
inmunodeficiencia combinada severa (SCID/NCr), antecedentes de BALB/C)Programa de Producción Animal NCI-Frederick01S11
piruvato de sodioCorning25-000-Cl
gel de procesamiento de muestras (HISTOGEL)Richard-Allan ScientificHG-4000-012
sacarosaSigma-AldrichS0389
Tripsina-EDTA, 25%Corning25-053-Cl
de membrana basal Célula madre de ratones con

Referencias

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