Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

8.1K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/54540

⸱

11 de noviembre de 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Davee Department of Neurology and Clinical Neurosciences, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Center for Molecular Innovation and Drug Discovery, Northwestern University, 3Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 4High Throughput Analysis Laboratory, Department of Molecular Biosciences, Northwestern University, 5Department of Physiology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La interacción entre los canales HCN y su subunidad auxiliar ha sido identificado como un objetivo terapéutico en el trastorno depresivo mayor. Aquí, un método basado en la polarización de fluorescencia para identificar inhibidores de molécula pequeña de esta interacción proteína-proteína, se presenta.

Resumen

(HCN) canales de nucleótidos cíclicos activado por hiperpolarización se expresan ubicuamente por todo el cerebro, donde funcionan para regular la excitabilidad de las neuronas. La distribución subcelular de estos canales en las neuronas piramidales de la zona CA1 del hipocampo es regulada por tetratricopeptide proteína repetir que contienen Rab8b interactuar (TRIP8b), una subunidad auxiliar. knockout genético de HCN formador de poros subunidades o TRIP8b, ambos conducen a un aumento en el comportamiento antidepresivo, lo que sugiere que la limitación de la función de los canales HCN puede ser útil como tratamiento para el trastorno depresivo mayor (MDD). A pesar del interés terapéutico significativo, los canales HCN se expresan también en el corazón, donde regulan la ritmicidad. Para evitar problemas fuera de objetivo asociados con el bloqueo de los canales HCN cardíacos, nuestro laboratorio ha propuesto recientemente la orientación de la interacción proteína-proteína entre HCN y TRIP8b el fin de perturbar específicamente la función del canal de HCN en el cerebro.TRIP8b se une a los poros formando subunidades HCN en dos sitios de interacción distintos, aunque en este caso la atención se centra en la interacción entre los dominios de la repetición tetratricopeptide (TPR) de TRIP8b y la cola C terminal de HCN1. En este protocolo, una descripción ampliada de un método para purificar TRIP8b y ejecución de una pantalla de alto rendimiento para identificar inhibidores de molécula pequeña de la interacción entre el HCN y TRIP8b, se describe. El método para la selección de alto rendimiento utiliza una polarización de la fluorescencia (FP) a base de ensayo para monitorizar la unión de un fragmento de TRIP8b grande a un once fluoróforo de etiquetado amino péptido ácido correspondiente al terminal de la cola C HCN1. Permite que los compuestos 'hit' a este método para ser identificados en base al cambio en la polarización de la luz emitida. Los ensayos de validación se realizan a continuación para asegurarse de que 'golpean' compuestos no son artefactos.

Introducción

(HCN) canales de nucleótidos cíclicos activado por hiperpolarización se expresan en el corazón y el sistema nervioso central donde juegan un papel importante en la regulación de la excitabilidad de la membrana 1. Los canales HCN han sido implicados en la patogénesis del trastorno depresivo mayor (MDD) 2, que se ha llevado a varios grupos a proponer que la limitación de la función del canal de HCN farmacológicamente puede ser eficaz como un nuevo tratamiento para la MDD 3. Sin embargo, atacando directamente a los canales HCN no es viable debido a su importante papel en el potencial de acción cardíaco 4. La ivabradina, el único aprobado por la FDA antagonista de los canales HCN, se utiliza para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca para producir un efecto bradicárdico 5. Como tal, hay una necesidad de agentes farmacológicos que limitan la función del canal de HCN exclusivamente en el sistema nervioso central.

Tetratricopeptide repetir que contienen proteínas que interactúan Rab8b (TRIP8b) es una especificación del cerebroFIC subunidad auxiliar de los canales HCN que controla la expresión de la superficie y la localización de los canales HCN 6,7. Knockout genético de TRIP8b provoca una reducción de los canales HCN cerebrales 7 sin afectar a la expresión de HCN en el corazón 8. Curiosamente, los ratones knockout TRIP8b pasan menos tiempo inmóvil en la tarea tarea de natación forzada y la suspensión por la cola 7, dos pruebas de detección de uso común para la eficacia antidepresiva 9-11. Estos resultados sugieren que en lugar de centrarse directamente los canales HCN con una pequeña molécula antagonista de la función del canal de HCN, lo que altera la interacción entre TRIP8b y HCN puede ser suficiente para producir un comportamiento antidepresivo.

TRIP8b une a HCN en dos sitios de unión distintos. El dominio de unión de nucleótidos cíclicos (CNBD) de HCN interactúa con un dominio conservado de la terminal N TRIP8b situada a los dominios TPR de TRIP8b 12,13. Aunque los residuos de la CNBD que están involucrados en esteinteracción han sido mapeado 14, la región de TRIP8b que está implicado no se ha reducido más allá de un-80-amino fragmento de ácido 13. Una segunda interacción se produce entre los dominios tetratricopeptide repetición (TPR) de TRIP8b y el tripéptido C-terminal de HCN ( 'Saturday Night Live' en HCN1, HCN2 y HCN4, pero 'ANM' en HCN3) 3,12. La estructura cristalina recientemente resuelto 15 de esta interacción C cola reveló similitud estructural sustancial a la interacción entre el receptor de importación peroxisomal, Peroxin 5 (PEX5), y sus socios interactuar, que contiene de tipo 1 peroxisomal secuencias dirigidas (PTS1) 16.

Aunque se requieren ambos sitios de interacción para la función de los canales HCN, la interacción entre los dominios TPR de TRIP8b y el terminal de tripéptido C de HCN1 sirve como el sitio de unión dominante y regula la expresión de superficie de HCN. Por lo tanto, esta interacción fue elegido como el sitio de segmentación en este estudio.Para el resto del manuscrito, cuando se hace una referencia a la interacción entre TRIP8b y HCN, es esta interacción que se hace referencia. Esta interacción se recapitula por un fragmento altamente soluble de TRIP8b correspondiente a su terminal conservado C que contiene los dominios TPR requeridas para la unión de la cola C terminal del HCN (residuos 241 a 602 de las 1A-4 isoformas de TRIP8b) 3.

Con el fin de desarrollar una pantalla de alto rendimiento para identificar moléculas pequeñas capaces de interrumpir esta interacción, una polarización de fluorescencia (FP) a base de ensayo se empleó 17. La polarización de fluorescencia se basa en la excitación de un ligando de fluoróforo-etiquetados con luz polarizada, y la medición del grado de polarización de la fluorescencia emitida 18. En presencia de una pareja de unión, el movimiento de rotación del ligando fluorescente está limitada y la luz polarizada se emite 19. En ausencia de una pareja de unión, tque el movimiento de rotación del ligando conduce a la emisión de luz despolarizada.

En el protocolo adjunto, se presenta un método para la purificación de N terminal etiquetado (6xHis) TRIP8b (241-602) usando níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) perlas. Un protocolo similar se empleó para purificar la glutatión-S-transferasa (GST)-etiquetados C terminal de 40 aminoácidos de HCN1 (c40 HCN1) usado en la etapa 7 del protocolo. Por consideraciones de espacio, se omitirá una descripción detallada de este procedimiento.

En los pasos 2 a 7 del protocolo, se presenta un flujo de trabajo cribado de alto rendimiento (véase la Figura 1). Interacciones proteína-proteína son un objetivo muy difíciles para la selección de alto rendimiento y se aconseja a los lectores a buscar recursos adicionales sobre el tema 20.

Los pasos 2 y 3 del procedimiento caracterizan la afinidad in vitro de la TRIP8b purificada (241-602) construir foisotiocianato ra de fluoresceína (FITC)-etiquetados once péptido de aminoácidos correspondiente a la cola C terminal de HCN1 (HCN1 FITC). Sobre la base de la estructura cristalina de la TRIP8b-HCN complejo 15, este segmento de once aminoácidos es suficiente para producir la unión con TRIP8b (241-602). En el paso 2, la Kd de la interacción se mide por titulación TRIP8b (241-602) en una concentración fija de HCN1 FITC. En el paso 3, una versión no marcada del péptido HCN utilizado en la etapa 2 se valora en una concentración fija de tanto TRIP8b (241-602) y HCN1 FITC para examinar si la etiqueta FITC interfiere con la unión. Estos experimentos son esenciales para la selección de las concentraciones apropiadas de TRIP8b (241-602) y HCN1 FITC utilizados en la pantalla de alto rendimiento.

La premisa de la pantalla de alto rendimiento es que una pequeña molécula capaz de interrumpir la interacción entre TRIP8b (241-602) y HCN1 FITC producirá decRease en luz polarizada. En el paso 4, el factor Z del ensayo se calcula 21 para una concentración dada de TRIP8b (241-602) y HCN1 FITC para asegurar que el ensayo es adecuado para el cribado de alto rendimiento de (paso 5). Los pasos 6 y 7 son ensayos de validación para confirmar que los accesos identificados en la pantalla principal de alto rendimiento están actuando mediante la interrupción de la interacción entre TRIP8b (241-602) y HCN1 FITC en lugar de a través de un mecanismo inespecífico. En el paso 6, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) marcado con HCN1 péptido (HCN1 TAMRA) es utilizado en un ensayo de polarización de fluorescencia por lo demás idéntica para filtrar compuestos fluorescentes que comprometen el ensayo de FP mediante la etiqueta FITC. Paso 7 utiliza un fragmento terminal más grande HCN1 C (HCN1 C40) y emplea un ensayo de proximidad basado en perlas, que se basa en el "túnel" de un oxígeno singlete de un cordón de donantes para un cordón aceptor traído cerca uno del otro por las proteínas que interactúan 22.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Purificación de TRIP8b (241-602) Protein

  1. Transformar el plásmido que contiene TRIP8b (241-602) en el vector de expresión de la proteína bacteriana pGS21 3 en E. competente coli para la expresión de proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Plate 300 l de la cultura en Luria Broth (LB) -agar con 5 g / ml de cloranfenicol y ampicilina. Incubar la placa a 37 ° C durante 16 h.
  2. Al día siguiente, escoge una sola colonia para inocular 50 ml de LB con 50 g / ml de cloranfenicol y ampicilina. Incubar el cultivo a 37 ° C durante 16 horas (con agitación).
  3. Añadir 50 ml de cultivo a 1 L de LB con 50 mg / ml de ampicilina. Se incuba a 37 ° C con agitación.
  4. Una vez que el cultivo ha alcanzado una DO 600 de lectura de 0,8 a 1,2, cambiar la temperatura de la incubadora a 18 ° C y añadir IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactósido) a una concentración final de 1 mM. Permitir la expresión de proteínas de proceder durante 16 horas.
  5. De girar la E. coli a 6000 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar las bacterias. Después de retirar los tubos de la centrífuga, mantener las bacterias en hielo durante el resto del procedimiento. Resuspender las bacterias en 36 ml de Tampón A con 0,25 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF).
  6. Sonicar las bacterias resuspendidas en hielo usando un perno plana durante 5-10 minutos, alternando entre 30 seg 'on' y 30 seg "off" a alta potencia.
  7. Centrifugar a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Centrifugar durante 15 minutos adicionales si el sobrenadante no está claro todavía.
  8. Aplicar el sobrenadante a una columna de 2 ml de perlas de Ni-NTA. Incubar durante 60 minutos a 4 ° C con agitación suave.
  9. Permitir que el material no unido fluya a través de la columna y se lava con 500 ml de Tampón A.
  10. Lavar la columna con 250 ml de Tampón B.
  11. Lavar la columna con 125 ml de tampón A suplementado con imidazol 5 mM.
  12. Eluir la proteína de aquí para allám la columna con 20 ml de tampón de elución.
  13. Añadir la proteína eluida a un casete de diálisis (corte de peso molecular - 10 kDa) con una jeringa. Se dializa la proteína de 60 min en 4 L de frío salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 ° C.
  14. Mueva el casete de diálisis en un nuevo 4 L cubo de PBS frío. Se dializa la proteína durante 16 horas a 4 ° C
  15. A la mañana siguiente, comprobar la concentración de proteína usando un kit de ensayo de proteínas Coomassie, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se concentra la proteína usando un concentrador de proteínas, siguiendo las instrucciones del fabricante, si se observa una concentración por debajo de 40 mM. Alícuota y se congelan a -80 ° C para su almacenamiento.

2. Pequeña Escala polarización de la fluorescencia de ensayo para caracterizar la interacción de los fragmentos de proteínas Dos

  1. Descongelar 200 l de 40 mM TRIP8b (241-602) y añadirlo a un tubo de 1,5 ml. Añadir 100 l de PBS a 11 tubos de 1,5 ml adicionales.
  2. Realizar diluciones en serie mediante la transferencia de 100 l de TRIP8b (241-602) del tubo original a la siguiente tubo en la serie, pipeteando arriba y abajo, y repitiendo el proceso. Esto producirá una serie de 12 puntos de diluciones de 2 veces de TRIP8b (241-602) que van desde 0,01-40 mM.
  3. Preparar una mezcla de 650 l maestro de 0,1 M HCN1 FITC (6,5 l de una alícuota de 10 mM) y 2 mM de ditiotreitol (DTT) en PBS.
    Nota: La mezcla maestra es 2x.
  4. Establecer 12 nuevos tubos de 1,5 ml. Añadir 50 l de la mezcla maestra que contiene HCN1 FITC a cada tubo, y luego se añaden 50 l de cada una de las diluciones seriadas 12.
    Nota: Esto generará 12 tubos, conteniendo cada uno 0,05 mM HCN1 FITC y media de la concentración de TRIP8b (241-602) a partir de la dilución de serie original.
  5. Añadir la serie de dilución a una placa de ensayo, 30 l por pocillo, por triplicado. Use un negro placa de 384 pocillos sólida unión de baja.
  6. Girar la placa fo 2 min a 900 xg a TA.
  7. Leer la placa usando un lector de microplacas, siguiendo las instrucciones del fabricante. Medir la polarización de fluorescencia utilizando los siguientes parámetros de medición: 485 nm de excitación, 530 nm de emisión, 505 nm espejo dicroico, 100 mseg de tiempo de integración.
  8. Colocar los valores de polarización (mP) frente a la (241-602) la concentración en una escala logarítmica TRIP8b. Ajustar los datos con la ecuación de Hill para determinar la afinidad (K d) de TRIP8b (241-602) para el péptido HCN1 etiquetado.
    Nota: Para la preparación de las diluciones en serie, una placa de múltiples pocillos también se puede utilizar en lugar de tubos.

3. Examinar la interacción proteína-proteína usando un control positivo

  1. Añadir 200 l de péptido no marcado HCN1 (200 mM) a un tubo de 1,5 ml. Añadir 100 l de PBS a 11 tubos de 1,5 ml adicionales. Realizar diluciones en serie mediante la transferencia de 100 l del tubo que contiene 200 l de péptido al primer tubode 100 l de PBS. Repita el proceso para generar 12 tubos con 2 diluciones de péptido no marcado HCN1.
  2. Prepare una mezcla maestra de 650 l de 0,2 M HCN1 FITC y 4 M TRIP8b (241-602).
    Nota: Esta es una solución de 2x.
  3. Añadir 50 l de mezcla maestra de 12 nuevos tubos de 1,5 ml.
  4. Añadir 50 l de cada dilución en serie a un tubo de 1,5 ml.
  5. Cargar la placa de microtitulación de 384 pocillos por triplicado negro, la adición de 30 l por pocillo.
  6. Se centrifuga la placa durante 2 minutos a 900 x g a temperatura ambiente.
  7. Leer la placa usando un lector de microplacas capaz de FP. Utilizar la misma configuración como se describe en el paso 2.7.
  8. Calcular la afinidad del péptido no marcado para TRIP8b (241-602) usando la ecuación de Cheng-Prusoff: K d 1 = IC50 / (1 + [L] / K d 2), donde K d 1 representa la afinidad de la no marcada péptido para TRIP8b (241-602), IC 50 se determina en la etapa precedentey representa la capacidad del ligando sin marcar para desplazar el ligando marcado, [L] es la concentración del ligando marcado en el paso 3.2, y K d 2 es la afinidad de TRIPb (241-602) para el ligando marcado.

4. Evaluar Ensayo de Rendimiento (Calcular el Factor Z)

  1. Preparar una mezcla maestra haciendo una solución de tampón FP 12 ml con 2 M TRIP8b (241-602), 50 nM HCN1 FITC, y DTT 1 mM en tampón de FP.
    Nota: Esto requerirá de 60 l de 40 mM TRIP8b (241-602), 60 l de 10 mM HCN1 FITC, y 1.080 l de tampón de FP.
  2. Añadir 30 l de la mezcla maestra a cada pocillo de una placa de microtitulación de 384 pocillos de color negro.
  3. Añadir 1 l de péptido no marcado HCN1 1 mM a 192 pozos para servir como control positivo.
  4. Añadir 1 l de tampón de FP a 192 pozos para servir como un control negativo.
  5. Se centrifuga la placa durante 2 minutos a 900 x g a temperatura ambiente.
  6. Leer la placa usando un MIcroplate lector.
  7. Se calcula el factor Z para el ensayo utilizando la siguiente fórmula: Z = 1 - 3 * (σ pos -σ neg) / (μ neg -μ pos) donde pos σ y neg σ son las desviaciones estándar de los pocillos de control positivos y negativos y pos μ y neg μ representan las señales promedio de los pocillos de control positivos y negativos.

5. Pantalla de Alto Rendimiento

  1. Descongelar alícuotas de TRIP8b (241-602) y HCN1 FITC y mantenerlos en hielo.
  2. Preparar 10 ml de TRIP8b (2 M) y HCN1 FITC (50 nM) en tampón de FP.
  3. Dispensar 25 l de la mezcla en cada pocillo de una unión de 384 pocillos de placas de microtitulación negro utilizando una pipeta bajo.
  4. Para el cribado de la biblioteca, añadir compuestos en cada pocillo de las columnas 3 a 22 (40 mM de concentración final para cada uno) usando un manipulador de líquidos acústica.
    Nota: Debido a la relatively tasa de éxito baja observada con este ensayo, dos compuestos diferentes se combinaron en un solo pozo. Los dos compuestos de cada pocillo activa se ensayaron posteriormente para identificar de forma individual que ha conferido la actividad.
  5. Añadir 100 nl de dimetil sulfóxido (DMSO) en cada pocillo de las columnas 1 y 23 de cada placa como controles negativos.
  6. Añadir péptido HCN1 no marcado en cada pocillo de las columnas 2 y 24 de cada placa como controles positivos.
  7. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 2 h. Leer placas o se incuba a 4 ° C durante 16 h antes de la lectura.
  8. Medir la polarización de la fluorescencia en un lector de placas. Utilizar la misma configuración como se describe en el paso 2.7.
  9. Calcular el porcentaje de inhibición mediante la normalización de las señales mediante los controles positivos y negativos promedio de cada placa como 100%. Usar la ecuación XN = 100% * ((X neg - X) / (X neg - X pos)) donde X N es el porcentaje de inhibición normalizado correspondiente a la señal X, X pos Es la media de la señal de los pocillos de control positivo, y X neg es la señal de los pocillos de control negativo.

6. Confirmación de Resultados El uso de etiquetado-TAMRA HCN Péptido

  1. Validar golpea con la inhibición de más del 50% utilizando péptido marcado con TAMRA HCN1 (HCN1 TAMRA).
    1. Preparar una mezcla maestra de 12 ml de 2 M TRIP8b (241-602) y 50 nM HCN1 TAMRA en FP tampón.
    2. Dispensar 25 l de la mezcla maestra en cada pocillo de una placa de microtitulación de 384 pocillos de color negro.
    3. Transferencia de diluciones en serie de cada uno de los compuestos activos en los pocillos respectivos. Hacer diluciones dobles de tal manera que la concentración de cada golpeado varía de 0,2 M a 200 mM.
    4. Para las reacciones de control negativo, la transferencia de 100 nl de DMSO en cada pocillo. Para el control positivo añadir 100 nl de péptido no marcado HCN1 diluido en serie con una concentración final que va desde 200μM a 0.1μM.
    5. Se incuba la placa a temperatura ambientedurante 2 h. Leer placas o incubar durante 16 horas a 4 ° C antes de la lectura.
    6. Medir la polarización de fluorescencia (mP) usando los siguientes parámetros de medición: excitación 535 nm; 580 nm de emisión; 535 nm espejo dicroico, 20 ms de tiempo de integración.
    7. Calcular valores de CI50 ajustando los datos de PF dependientes de la concentración de cada compuesto utilizando una de cuatro parámetros modelo de regresión no lineal 23.

7. Validación dosis-respuesta de ensayo de proximidad basado en perlas

  1. Descongelar 1 alícuota de TRIP8b marcada con His (241-602) (Su-TRIP8b) y proteínas de fusión HCN1 marcada con GST (GST HCN1 C40) y mantenerlos en hielo.
  2. Combinar Su-TRIP8b con GST-C40 HCN1 en tampón de ensayo a concentraciones de 400 nM Su-TRIP8b y 40 nM GST HCN1 C40. Preparar 300 l de la mezcla para cada compuesto a ensayar.
    Nota: Los compuestos se realizaron por triplicado a 11 concentraciones diferentes además de un DMAsí que el control (sin compuesto).
  3. Para los pozos de control, preparar 30 l de Su-TRIP8b (200 nM) sin GST-HCN1C40 separado y luego preparar 30 l de GST-HCN1C40 (20 nM) sin Su-TRIP8b en tampón de ensayo.
  4. Para cada compuesto a ensayar, añadir 7 l de la Su-TRIP8b: mezcla GST-HCN1 C40 (preparado en la etapa 7.2 anterior) a 36 pocillos de una placa con una pipeta de 16 canales. Para el ensayo de un solo compuesto, disponer las 12 concentraciones diferentes en las filas de Al y las tres réplicas en las columnas 1-3. Añadir 7 l de la solución de His-TRIP8b (preparado en 7.3) para las columnas 1-3 de la fila M y 7 l de solución de GST-HCN1 C40 (preparado en 7.3) a las columnas 1-3 de la fila N. Centrifugar brevemente la placa a asegurar los líquidos están en el fondo de cada pocillo, y para eliminar las burbujas.
  5. Dispensar los compuestos de golpe a ensayar en la placa de tal manera que la concentración de cada golpeado rangos de 200 micras (en la fila A) de hasta 0,1 M (en la fila K). Dispensar un volumen deDMSO en filas LN que coincide con la cantidad de compuesto dispensado en filas AK.
  6. Agitar la placa durante 2 min y se incuba durante 2,5 horas a temperatura ambiente.
  7. Diluir las perlas aceptoras anti-GST 1:50 con tampón de ensayo.
  8. Añadir 3,5 l de las perlas aceptoras diluido a cada pocillo de la placa con una pipeta de 16 canales y mezclar suavemente pipeteando para evitar la creación de burbujas.
  9. Incubar la placa durante 1 hora a RT en la oscuridad.
  10. Diluir las cuentas de los donantes níquel quelato 1:50 con tampón de ensayo. No exponga la mezcla a la luz.
  11. Añadir 3,5 l de las perlas de donantes diluido a cada pocillo de la placa con una pipeta de 16 canales y mezclar suavemente pipeteando para evitar la creación de burbujas.
  12. Se incuba la placa durante 1,5 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.
  13. Leer en un lector de placas. Use un lector de placas con los siguientes parámetros de medición: 40 ms tiempo de excitación, 100 ms de tiempo de emisión, 0,1 mm de altura de detección.
  14. Calcular los valores de IC50 ajustando los datos de EACcompuesto h utilizando un período de cuatro parámetros modelo de regresión no lineal 23.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Para evitar problemas de derechos de autor con nuestra publicación anterior, una sonda marcada con TAMRA HCN1 TAMRA se utilizó para generar las Figuras 2 y 3. Tenga en cuenta que esta sustitución no hizo una diferencia apreciable en los resultados, y los protocolos son idénticos a los descritos anteriormente con HCN1 FITC. Para evaluar la interacción con HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) se tituló en una concentración fija de ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Debido a su potencial como diana terapéutica en el TDM 24, ha habido un considerable interés en los enfoques farmacológicos que antagonizan la función del canal de HCN en el sistema nervioso central 4. Sin embargo, estos esfuerzos se han visto afectadas por la importancia del papel de los canales HCN en marcapasos cardíaco y el riesgo de arritmia 25. Pensamos que la interrupción de la interacción entre el HCN y su subunidad auxiliar específicas del cerebro, TRIP8b 8, podría se...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Grant R21MH104471 y R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. y D.M.C.), y National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). Una parte de este trabajo fue realizada por el Núcleo de Química Medicinal y Sintética de la Universidad Northwestern (ChemCore) en el Centro para la Innovación Molecular y el Descubrimiento de Fármacos (CMIDD), que está financiado por el Consorcio Biomédico de Chicago con el apoyo de los Fondos Searle en el Chicago Community Trust y el Centro de Apoyo al Centro de Cáncer Subvención P30 CA060553 del Instituto Nacional del Cáncer otorgado al Centro Oncológico Integral Robert H. Lurie. El trabajo de detección de alto rendimiento se realizó en el Laboratorio de Análisis de Alto Rendimiento, que también es una instalación central del Centro Oncológico Integral Robert H. Lurie.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ni-NTA agarosa Qiagen30210
Cassette de diálisis ThermoFisher66456
Isopropilo b-D-1-tiogalactopiranósido Sigma-AldrichI5502 - 1 gr
384 Pocillos Placa Negra Corning3820
Proxiplate Perkin-Elmer 
Cuentas aceptoras anti-GST Perkin-Elmer 6760603C
NiquelatoPerkin-Elmer AS101D
pGS21-aGenscriptSD0121
PMSFSigma-Aldrich10837091001
Coomassie KitThermoFisher23200
Concentrador de proteínasThermoFisher88527
Perkin Elmer Enspire Lector de placas multimodoPerkin-Elmer #2300-001M
BL21 (DE3) Células competentesAgilent200131
6008289

Referencias

  1. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
  2. Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (244), pe44(2012).
  3. Han, Y., et al. Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels. J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).
  4. Postea, O., Biel, M. Exploring HCN channels as novel drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).
  5. Stieber, J., Wieland, K., Stöckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors. Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).
  6. Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction. J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).
  7. Lewis, A. S., et al. Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice. J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).
  8. Heuermann, R. J., et al. Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy. Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).
  9. Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).
  10. Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).
  11. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  12. Han, Y., et al. Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites. J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).
  13. Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP. J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).
  14. Saponaro, A., et al. Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).
  15. Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).
  16. Gatto, G. J. Jr, Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5. Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).
  17. Owicki, J. C. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer. J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).
  18. Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
  19. Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).
  20. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Eglen, R. M., et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).
  23. Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. , Worth Publishers. New York. (2000).
  24. Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors. Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).
  25. Wahl-Schott, C., Biel, M. HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function. Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).
  26. DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b. Structure. 23 (4), 734-744 (2015).
  27. Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).
  28. Prinz, H. Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms. J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).
  29. Pollard, T. D. A Guide to Simple and Informative Binding Assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  30. Rossi, A. M., Taylor, C. W. Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization. Nat Protoc. 6 (3), (2011).
  31. Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -W. Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors. J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).
  32. McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening. J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).
  33. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  34. Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Interacción HCN1-TRIP8bensayo de polarización de fluorescenciacribado de alto rendimientopurificación de proteínasensayo de unión de péptidoscálculo de la CI50ensayo de proximidad basado en esferasvalidación de compuestosterapia para la depresión
Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.