Artículo de método

Un alto rendimiento, multiplexado y dirigida proteómico CSF ​​ensayo para cuantificar neurodegenerativas Biomarcadores y apolipoproteína E isoformas Estado

DOI:

10.3791/54541

⸱

20 de octubre de 2016

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1Centre for Translational Omics, Genetics and Genomic Medicine Deptartment, Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 2Dementia Research Centre, Institute of Neurology, University College London, 3Clinical Neurochemistry Laboratory, Institute of Neuroscience and Physiology, Department of Psychiatry and Neurochemistry, The Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, 4Neurology Unit, Department of Pathophysiology and Transplantation, University of Milan, 5Great Ormond Street Hospital for Children, University College London

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Se describe un alto rendimiento, múltiplex, y el ensayo de líquido cefalorraquídeo proteómica dirigida (CSF) desarrollado con potencial para la traducción clínica. La prueba se puede cuantificar marcadores potenciales y factores de riesgo para la neurodegeneración, tales como las variantes de la apolipoproteína E (E2, E3 y E4), y medir su expresión alélica.

Resumen

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Muchas enfermedades neurodegenerativas todavía se carece de tratamientos eficaces. biomarcadores fiables para la identificación y clasificación de estas enfermedades serán importantes en el desarrollo de futuras terapias novedosas. A menudo, los posibles nuevos biomarcadores no llegan a la clínica debido a las limitaciones en su desarrollo y altos costos. Sin embargo, la proteómica dirigidos utilizando monitorización de reacción múltiple Liquid Chromatography-tandem / espectrometría de masas (MRM LC-MS / MS), usando específicamente espectrómetros de masas de triple cuadrupolo, es un método que se puede utilizar para evaluar rápidamente y validar biomarcadores para la traducción clínica en los laboratorios de diagnóstico . Tradicionalmente, esta plataforma se ha utilizado ampliamente para la medición de pequeñas moléculas en laboratorios clínicos, pero es el potencial para analizar las proteínas, que hace que sea una alternativa atractiva para ELISA (Enzyme-Linked ImmunosorEnsayo de doblado) a base de métodos. Se describe aquí cómo proteómica dirigida se puede utilizar para medir marcadores multiplexados de demencia, incluyendo la detección y cuantificación de lo conocido factor de riesgo apolipoproteína E isoforma 4 (ApoE4).

Con el fin de hacer que el ensayo adecuado para la traducción, que está diseñado para ser rápida, simple, altamente específico y rentable. Para lograr esto, cada paso en el desarrollo del ensayo debe ser optimizado para las proteínas individuales y tejidos que se analizan. Este método describe un flujo de trabajo típico que incluye varios consejos y trucos para el desarrollo de una proteómica dirigida MRM LC-MS / MS para la traducción .

El desarrollo del método se optimiza el uso de versiones sintetizadas de encargo de péptidos trípticos quantotypic, que calibran la MS para la detección y luego se disparó en el LCR para determinar la correcta identificación del péptido endógeno en la separación cromatográfica previa al análisis en la MS. Para lograr absoluTe cuantificación, marcadas por isótopos estables versiones estándar interno de los péptidos con aminoácidos corta etiquetas de secuencias de ácido y que contiene un sitio de escisión de tripsina, están incluidos en el ensayo.

Introducción

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El impacto creciente de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la demencia con cuerpos de Lewy y la enfermedad de Parkinson, se está convirtiendo en un problema socioeconómico en muchos países 1. Hay una necesidad en biomarcadores adicionales que se pueden utilizar para identificar y clasificar los pacientes en las primeras etapas de la enfermedad, y para supervisar cualquier posible nuevos tratamientos. El objetivo general de este método es la creación de una tubería genérico de una manera ágil, económica y más rápida de validación de posibles marcadores en LCR de la neurodegeneración. La razón es el uso de la proteómica dirigidos o péptido MRM LC-MS / MS como un método fácilmente modificable para evaluar múltiples biomarcadores de proteínas potenciales de los experimentos de descubrimiento. Estos pueden ser multiplexados aún más en una separación rápida cromatográfica (<10 min) y se evaluó. Dentro de esta pantalla múltiplex de biomarcadores neurodegenerativas, hemos incluido la demencia conocido factor de riesgo de la apolipoproteína E4 isoforma (ApoE4), de modo que te pn determinar simultáneamente su estado y nivel de expresión, por que la eliminación de la necesidad de pruebas de genotipo 2 separadas. LC MS / MS se utiliza habitualmente como el método de elección para cuantificar con precisión las pequeñas moléculas a través de otros métodos tales como ELISA o radioinmunoensayo (RIA). Este cambio en el uso de la tecnología EM para el análisis de proteínas, ha sido impulsado principalmente por problemas con las tecnologías basadas en técnicas inmunológicas. Estos incluyen cruz-especificidad, variación entre lotes, la vida útil limitada, y alto costo. Por lo tanto, la proteómica dirigidos está convirtiendo rápidamente en una alternativa cada vez más a los métodos basados ​​en anticuerpos, tales como transferencia Western, RIA y ELISA. Sin embargo, la capacidad de multiplexar muchos marcadores en un ensayo es la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos basados en inmuno 3. La técnica es aplicable a muchos tejidos y se ha utilizado como una estrategia de validación para los estudios de proteómica muchos incluyendo plasma 4 y la orina 5,6.

el technique se puede aplicar a cualquier laboratorio que tiene acceso y experiencia en el uso de espectrómetros de masas de triple cuadrupolo. el diseño de péptidos es relativamente simple, con el creciente uso de las bases de datos de código abierto. El mercado competitivo de la síntesis de péptidos personalizados los hace mucho más asequible. péptidos pesados, sin embargo, son caros y, por tanto, los marcadores deben ser evaluados en una pequeña cohorte antes de trasladarse a una escala mayor. Existe un creciente potencial de la técnica que se utiliza en la configuración de diagnóstico clínico, con la mayoría de los grandes hospitales que tienen plataformas basadas triple cuadrupolo que pueden ser fácilmente adaptados para ejecutar ensayos proteómicos dirigidos. Una de tales aplicaciones del método, por lo que es en el ajuste de diagnóstico de rutina, es su reciente aplicación a la detección de gotas de sangre de recién nacidos para la anemia de células falciformes 7.

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Protocolo

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NOTA:. Un diagrama esquemático del protocolo general descrito aquí se da en la fi gura 1 Todas las muestras utilizadas para el desarrollo de este método son muestras de diagnóstico clínico excedentes y tienen la aprobación ética del Comité de Ética de Londres Bloomsbury.

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Figura 1. Esquema que ilustra el proceso global de crear un CSF GRM dirigidas LC-MS / MS. Ensayo péptidos candidato marcador para la evaluación se seleccionan de dianas proteicas. Mediante el uso de los péptidos sintetizados de encargo, se crea un método multiplex LC-MS / MS de destino. Después de la evaluación, el ensayo se puede usar para evaluar la eficacia de los posibles marcadores de neurodegeneración.

1. Selección de péptidos y Diseño

NOTA: Criterios para un péptido marcador es que debe ser único (proteotípicos (quantotypic). Para determinar si un péptido es único o no, la herramienta de búsqueda 'explosión' en el sitio web Uniprot (http://www.uniprot.org/blast/) se puede utilizar.

  1. Definir una lista de proteínas diana (marcadores), es decir, la ApoE (ver Tabla 2).
    NOTA: Si el marcador ha sido identificado a partir de experimentos anteriores perfiles proteómicos 8, a continuación, seleccione el péptido que da la mejor respuesta por parte de ese conjunto de datos.
  2. Si esta información no está disponible, utilizar los sitios web de código abierto, como in silico digestión con tripsina de las proteínas diana, utilizando una herramienta de software como MS-Digest.
  3. Elija el péptido tríptico que es y no es susceptible de modificación postraduccional.
    NOTA: Esta información se puede consultar en la página web Uniprot www.uniprot.org. Evitar péptidos propensos a la modificación química durante la preparación de la muestra LC-MS.
  4. Solicite la síntesis a medida de los péptidos elegidos.
    NOTA: la etiqueta de plástico péptidos pueden ser sintetizados a medida por diversas empresas comerciales. Para el péptido ApoE quantotypic utilizado para medir los niveles totales de ApoE se determinó que era AATVGSLAGQPLQER. Las secuencias de péptidos proteotípicos utilizados para determinar las variantes de E2 y E4 son los péptidos trípticos para la posición 158 (RLAVYQAGAR y CLAVYQAGAR) y la posición 112 (LGADMEDVCGR y LGADMEDVR), respectivamente.

2. Preparación de péptidos estándar

NOTA: Con el fin de seleccionar los mejores transiciones cuantitativos, la detección de la matriz (LCR) necesita ser optimizado. La forma más eficiente de optimizar péptidos multiplexados es crear charcos de los péptidos a concentraciones conocidas. Estas piscinas se pueden utilizar para el desarrollo de métodos y las curvas de calibración.

  1. Resuspender péptidos sintéticos (detalles de péptidos se dan en la Tabla 2) a 1 mg / ml de stockconcentración de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por defecto, si las instrucciones no están disponibles, los péptidos volver a suspender en 50:50 (v / v) de acetonitrilo (ACN) / H2O
  2. Preparar las diluciones 1:10 de péptido de la concentración de la piscina y 1,000 pmol de cada péptido en un tubo de microcentrífuga de unión de baja. Se seca en un concentrador Speed-Vac el grupo final y se almacena a -20 ° C. Preparar varias piscinas para su uso futuro.
  3. Alícuota de 100 l de LCR en bajas tubos de unión. Liofilizar la CSF.
  4. Resuspender una alícuota de 1.000 pmol agrupados péptidos en tampón de digestión (Tris HCl 100, pH 7,8, 6 M urea, 2 M tiourea, 2% ASB14) para obtener concentraciones de 10 y 1 pmol / l.
  5. Pico de los péptidos agrupados en los 100 ml de alícuotas liofilizadas de LCR en el momento 0, 1, 2, 5, 10 y 15 las concentraciones de PM. Añadir 20 ng de proteína no relacionada intacta tales como enolasa de levadura para actuar como un patrón interno y el control de la eficiencia de la digestión trypsin.
  6. Rellenar las alícuotas MEC con tampón para digerir una cantidad final de 20 l. Vórtice.
  7. Añadir 1,5 l de ditiotreitol (30 mg en 1 ml de 100 mM Tris HCl, pH 7,8) y agitar a temperatura ambiente durante 1 hr.
  8. Añadir 3 l de yodoacetamida (35 mg en 1 ml de 100 mM Tris HCl, pH 7,8) y agitar a temperatura ambiente durante 45 min en la oscuridad.
  9. Añadir 165 l de ddH2O
  10. Añadir 10 l de 0,1 g / l solución de tripsina modificada de grado de secuenciación se resuspendieron en tampón de bicarbonato de amonio 50 mM, pH 7,8. Incubar en un baño de agua a 37 ° CO / N y detener la digestión mediante la congelación de muestras. Tienda digiere a -20 ° C hasta el momento de analizar.

3. Optimización de la detección MS de péptidos

  1. Copiar y pegar la secuencia del péptido para optimizar, en un software adecuado, por ejemplo, Skyline 9. Haga clic en la secuencia del péptido para obtener la informaciónde iones de masas de iones precursores y productos esperados.
  2. Diluir los péptidos de concentración de reserva (véase la sección 2.1) sobre la base de 1 ng / ml de concentración para el desarrollo de métodos de MS.
  3. Directamente infundir los péptidos en el espectrómetro de masas a un caudal optimizado (normalmente de 0,1 - 0,8 ml / min) y de 0 - 5% de la energía de colisión.
  4. Adquirir MS espectro con el fin de identificar a los iones precursores experimentales se multiplican cargadas 8. Elija el ión precursor (m / z) que da la mayor intensidad (por enlace doble o se les aconseja iones precursores cargados triplemente).
  5. Reinfundir el péptido y aplicar energía de colisión para fragmentar el péptido por colisión inducida por disociación (CID). Optimizar las energías de colisión de cono y para obtener el mejor patrón de fragmentación (fragmentos de iones con carga simple o doble, y la masa de ion fragmento preferiblemente más grande que de iones de los padres, se aconseja).
  6. Compruebe que las transiciones obtenidos experimentalmente se ajustan a las transiciones generadas in silico </ Em> (como se describe en el paso 3.1). Guardar la lista de transición en el archivo de método MRM utilizando por lo menos 2 transiciones más intensos por ión precursor. Incluye 2 transiciones: 1 para la cuantificación y el 1 de confirmación en el ensayo final.
    NOTA: Algunos fabricantes EM tienen una función (es decir, Aguas Intellistart) para MRM automatizada o la optimización de análisis de SRM. Si es posible infundir péptidos con fases móviles combinados al 50 - 70% de ACN con 0,1% FA.

Desarrollo 4. Método LC-MRM

NOTA: Analizar la mezcla de péptidos sintéticos por un sistema de cromatografía de líquidos (UPLC) acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Rendimiento Ultra. Asegúrese de que la fuente está limpio. El disolvente A es ddH 2 0 con 0,1% FA; Disolvente B se ACN con 0,1% FA.

  1. Usar el sistema de LC-MS equipado con una columna UPLC lleno de C-18 de fase (1,6 m de diámetro, 90 poros A, 2,1 mm x 50 mm de longitud) y unido a una pre-columna de la misma fase.
  2. De descongelación digiere CSF sobre hielo, se centrifuga a 16.000 g durante 10 min y la transferencia de 60 l en 300 l viales inserto de vidrio y guardar el resto de vuelta a -20 ° C
  3. Inyectar la concentración más alta de punto de la curva estándar utilizando 10 min 1 - 40% de gradiente de ACN lineal (véase la Tabla 1 para la configuración de gradiente)
  4. Abra el cromatograma y retención nota de tiempo resultante y la parte superior dos transiciones más intensos (cuantitativos) por péptido con todas las transiciones creadas en el paso 3.
  5. Basándose en esta información, actualizar un método MRM 10 min (creado en el paso 3.6) con canales temporizados para medir péptidos (véase la Figura 2 para un ejemplo). Para mantener la sensibilidad, mantener cada canal con puntos por pico mayor que 8 y tiempo de permanencia mayor que 0,01 seg para al menos una transición para cada péptido.
  6. Incluya 'solventes' retrasos en el método de MRM: uno al principio, hasta 10 segundos antes de la primera elución pico yotro al final del método, 20 seg después de la última elución pico. Para ello, selecciona "retrasos de disolvente" en los eventos del método de archivo de MS método.
  7. Ejecutar la curva estándar a través del método de MRM cronometrado y garantizar la ausencia de picos no específicos que interfieren en las transiciones (generadas en el paso 3.6) por la comprobación de la linealidad.
  8. Determinar si los péptidos son detectables mediante la ejecución de control no agrupada de pinchos y LCR enfermedad a través del método.
  9. Retirar los péptidos que están por debajo del límite de detección del ensayo.

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Figura 2. Ejemplo de un método dinámico MS MRM. Temporizado canales de transiciones de péptidos pueden ser agrupados de acuerdo a los tiempos de retención establecidas. MRMs Habilitación para ser incorporado en una forma temporizada como los péptidos marcadores seleccionados eluyen de la columna de cromatografía, reduce al mínimo el número de transitions durante un período de tiempo y aumenta la sensibilidad del ensayo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. La adición del Reglamento Interno

Nota: Como se ha descrito previamente 10, los patrones internos marcados con isótopos estables pueden ser incluidos en el ensayo. Debido al costo de estas normas, se recomienda evaluar primero los péptidos en la matriz.

  1. Determinar los péptidos ideales optimizados para la detección in CSF: elegir los péptidos que son los más recurrentes, con la intensidad más alta y sin picos de interferencia.
  2. Diseño péptidos correspondientes para incluir pesados etiquetas 13 C 15 N de aminoácidos que aumentan la masa del péptido de al menos 6 Da en relación con péptido endógeno. Además, agregar una etiqueta de 4 - 6 aminoácidos adicionales en cualquiera de los extremos N- o C-terminal de la pep pesadamarea para controlar por la digestión con tripsina.
  3. Diluir los estándares internos marcados con isótopos estables en tampón de digestión (véase el paso 2.4). Determinar la cantidad ideal de estándar interno marcado con un isótopo estable que se clavó en el LCR por clavar en varios niveles en función de las abundancias observadas previamente durante el desarrollo. Tratar de conseguir aproximadamente 1: 1 de la norma marcada con isótopos estables de péptido endógeno.
    NOTA: Los estándares internos marcados con isótopos estables pueden ser sintetizados por diversas empresas comerciales.

6. LC-MRM de las muestras de LCR de pacientes

  1. Pico cantidad de estándares marcados con isótopos estables optimizado en 100 l de CSF y liofilizar la mezcla.
  2. Resuspender el LCR en 20 l de tampón de digestión y realizar la digestión como se describe en los puntos 2.7 - 2.10.
  3. Analizar las muestras utilizando el método LC-MRM desarrollado en el paso 4.
  4. Para el análisis cuantitativo, ejecute la pep normamareas en concentraciones de 0 -15 pmol en una curva estándar. Vea el paso 2.5 para la preparación de la curva estándar.

Análisis 7. Datos

NOTA: cuantitativo de datos se basa en la relación de intensidad de pico de los estándares internos de línea de base (péptidos marcados pesada). Información detallada sobre los análisis de datos / MRM SRM se ha descrito previamente 10. datos de relación de a continuación, se pueden utilizar en una curva estándar para determinar los niveles absolutos o calcularlas partir de la concentración añadida de péptido-pesado etiquetado.

  1. Analizar los datos de LC-GRM utilizando el software estándar de 10 los Espectrómetros de masa para los fabricantes. Como alternativa, utilice el software del horizonte para analizar los datos cuantitativos de GRM 10.
  2. Comprobar la sensibilidad de la carrera por el control de la respuesta de un patrón interno tal como la enolasa de levadura de púas o un estándar marcado con isótopo estable en cada ejecución. Asegúrese de que el coeficiente de variación (CV) no es mayor que25%.
  3. revisar manualmente la anotación de datos para asegurar la exactitud. Analizar cada péptido y la relación a un estándar interno marcado isotópicamente estable apropiado, es decir, utilizar la versión marcada con isótopo estable del péptido si está disponible.
  4. Para obtener valores absolutos de pmol por cada 100 l de CSF, ejecutar los datos de relación a través de las curvas de calibración apropiadas que se ejecutaron en el mismo tiempo.
  5. Calcular el coeficiente de variación (CV). CV para cada péptido debe ser inferior a 25% y por debajo de 15% para altas péptidos abundantes.
    NOTA: El valor absoluto por 100 pmol valores de LCR l se puede utilizar en el análisis estadístico posterior aguas abajo.

8. La apolipoproteína E isoforma Estado

NOTA: Para determinar el estado de isoforma ApoE, la presencia de los péptidos correspondientes se puede realizar mediante la determinación de la presencia de cada isoforma.

  1. Considere la ApoE en 100 l de LCR umbral de> 1.000 señal-to-ruido como positivo para ese péptido. Vea la Figura 5 para los péptidos requeridos / ausente para determinar el estado isoforma de un paciente. Determinar la expresión alélica mediante el cálculo del% de cada isoforma a un total de expresión ApoE.

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Resultados

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Utilizando el método descrito anteriormente, se desarrolló un ensayo multiplex de alto rendimiento 10 min que consiste de 74 péptidos de 54 proteínas, como un ensayo para los marcadores de los trastornos neurodegenerativos de la enfermedad de Alzheimer y cuerpos de Lewy (LBD) 8. La Figura 3 muestra un cromatograma multiplex publicado previamente 8 de los marcadores de péptidos significativos del ensayo. Los péptidos incluidos en el ensayo y sus tran...

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Discusión

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Como con todos los ensayos basados ​​en MS, los pasos críticos en el método son la determinación de las cantidades adecuadas y precisas de estándares internos. Si se utiliza la cuantificación absoluta, entonces las cantidades correctas de péptidos de púas en la curva estándar también son críticos.

Nuestro ensayo no requiere la precipitación del CSF o el uso de cualquier tipo de limpias pasos arriba o de desalado antes del análisis MS - se trata de un método de reacción en un solo recipiente ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado y facilitado a través de la iniciativa de investigación GOSomics por el Instituto Nacional de Investigación en Salud, el Centro de Investigación Biomédica en el Hospital Great Ormond Street y el Centro de Espectrometría de Masas Biológicas de UCL en el Instituto de Salud Infantil de UCL con amables donaciones de la Fundación Szeban Peto. El Centro de Investigación de la Demencia es un centro coordinador de Alzheimer's Research UK. Los autores agradecen el apoyo de Alzheimer's Research UK, la Unidad de Investigación Biomédica de Demencia Queen Square del NIHR, el Centro de Investigación Biomédica UCL/H y el Centro de Neurología Experimental Leonard Wolfson.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Acetonitrilo (ACN), grado LC-MS FisherA955-1
Ácido fórmico, grado LC-MS,FisherA117-50
Dithiothreitol (DTT)Sigma  D5545 - 5 g
de ácido clorhídrico, 37 % p/pVWR BDH3028 - 2.5 LG
Yodoacetamida   Sigma I1149 - 5 g
Hidróxido de sodio (NaOH)FisherS318-500
Tripsina, grado de secuenciación, modificadoPromegaV5113
Ácido trifluoroacético (TFA), grado LC-MSFisherA116-50
UreaSigmaU0631- 500 g
Agua, LC-MS ULTRA ChromasolvFluka14263
Péptidos sintetizados personalizados desalinizados 1-4 mgGenscriptaminoácido
[13C; 15N] péptidos personalizadosGenscriptpersonalizado
ASB 14Merck Millipore182750 - 25 g
ThioureaSigmaT7875 - 500 g
Tris baseSigmaT6066
Precolumna VanGuardWaters 186007125
Cortecs UPLC C18 + 1.6 μ m  Columna de 2,1 x 50 mmAguas186007114
Levadura Enolasa SigmaE6126
300 μ l viales de vidrio transparentes con tapa de roscaFisher scientific03-FISV
Y tapones de rosca de hendidura Liofilizador Fisher scientific9SCK-(B)-ST1X
Edwards Mudulyo Sistema Mudulyo
Concentrador/Aspirador de velocidadEppendof concentrador  plus 5301
Xevo -TQ-S espectrómetro de masasWaters
Acquity Sistema UPLCWaters
marcado pesado personalizado

Referencias

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  3. Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10 (1), 19-22 (2013).
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