En este estudio, generamos células madre pluripotentes inducidas a partir de células de líquido amniótico de ratón, utilizando un sistema de transposones no viral.
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Artículo de método
La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) se generan a partir de células somáticas de ratón y humanas mediante la expresión forzada de factores de transcripción definidos utilizando diferentes métodos. Aquí, producimos células iPS a partir de células de líquido amniótico de ratón, utilizando un sistema de transposones no viral. Todas las líneas celulares iPS obtenidas mostraron características de células pluripotentes, incluida la capacidad de diferenciarse hacia derivados de las tres capas germinales in vitro e in vivo. Esta estrategia abre la posibilidad de utilizar células de fetos enfermos para desarrollar nuevas terapias para los defectos congénitos.
Introducción
El diagnóstico prenatal es una importante herramienta clínica para evaluar enfermedades genéticas (es decir, aberraciones cromosómicas, enfermedades monogénicas o poligenéticos / multifactorial) y malformaciones congénitas (hernia diafragmática congénita es decir, lesiones pulmonares quísticas, onfalocele, gastrosquisis). El líquido amniótico (AF) las células son fáciles de obtener de forma rutinaria los procedimientos programados durante el segundo trimestre del embarazo (es decir, la amniocentesis y amniorreducción) o cesáreas 1, 2. La disponibilidad de las células AF de pacientes....
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Protocolo
Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con la ley italiana. muestras murino AF fueron cosechadas de los ratones gestantes en 13,5 días postcoital (DPC) de ratones C57BL / 6 ratones Tg (UBC-GFP) 30Scha / J llamada GFP.
Producción 1. transposón
NOTA: los vectores de expresión de transposones se generaron utilizando procedimientos de clonación estándar. El ADN plásmido para ratón AF células transfección se preparó usando kits comerciales.
- Mezclar 10 ng de ADN de plásmido con 50 l de bacterias DH5a en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar el tubo de microcentrífuga en hielo durant....
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Resultados
Para evaluar la capacidad de la reprogramación, se recogieron las células de ratón AF de fetos de ratones GFP. Las células fueron transfectadas con el plásmido de transposón circular PB-tetO2-IRES-OKMS, que expresa los factores Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4 y cmyc) vinculados a la proteína fluorescente mCherry de una manera inducible por doxiciclina, y revertir transactivador de tetraciclina (PB- CAG-rtTA) plásmidos junto con el plásmido de expresión de la transposasa (mPBase). Células de r.......
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Discusión
El método elegido para obtener la inducción de la pluripotencia es relevante para la seguridad clínica de células con respecto al trasplante a largo plazo. Hoy en día, existen varios métodos adecuados para la reprogramación. Entre los métodos no integrativos, la viral (SEV) vector Sendai es un virus de ARN que pueden producir grandes cantidades de proteína sin integrar en el núcleo de las células infectadas 40 y podría ser una estrategia para obtener células iPS. vectores SeV podría ser un candid.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación CARIPARO Subvención número 13/04 y la Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Subvención número 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin y Michela Pozzobon están financiadas por la Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin está financiada por la Fundación CARIPARO Subvención número 13/04. Paolo De Coppi está financiado por la organización benéfica Great Ormond Street Hospital Children's Charity.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de Petri de grado bacteriano de 100 mm | BD Falcon | 351029 | Para in vitro diferenciación |
| 2-mercaptoetanol | Sigma | M6250 | Para AF de ratón, células iPS-AF y medio de diferenciación |
| Alexa568 conjugado anti-ratón de cabra IgM | Thermo Fisher Scientific | A21043 | Anticuerpo secundario (inmunofluorescencia) |
| Alexa594-conjugado pollo anti-cabra IgG | Thermo Fisher Scientific | A21468 | Anticuerpo secundario (inmunofluorescencia) |
| Alexa594-conjugado pollo anti-conejo IgG | Thermo Fisher Scientific | A21442 | Anticuerpo secundario (inmunofluorescencia) |
| Alexa594-conjugado de cabra anti-ratón IgG | Thermo Fisher Scientific | A11005 | Anticuerpo secundario (inmunofluorescencia) |
| Kit de fosfatasa alcalina | Sigma | 85L1 | Fosfatasa alcalina tinción |
| Ampicilina | Sigma | A0166 | Para la selección bacteriana |
| Albúmina sérica bovina | Sigma | A7906 | BSA, para solución de bloqueo. Diluido en PBS 1x |
| Cloroformo | Sigma | C2432 | Para la extracción de ARN |
| DH5 y células alfa; | Thermo Fisher Scientific | 18265-017 | Bacterias para el procedimiento |
| Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965039 | Para MEF, AF de ratón, células iPS-AF y medio |
| de diferenciaciónDoxiciclina | Sigma | D9891 | Para la expresión de factores exógenos |
| Tubos de microcentrífuga (1,5 ml) | Sarstedt | 72.706 | Para la producción de PB |
| ES FBS | Thermo Fisher Scientific | 10439024 | para AF de ratón, células iPS-AF y medio de diferenciación |
| FBS | Thermo Fisher Scientific 10270106 | para MEF medio | |
| Pinza de punta fina | F.S.T | . Dumont #5 | Aislamiento de AF |
| Gelatina | J.T.Baker | 131 | Utilizada al 0,1%, diluida en PBS 1x |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | Para solución de bloqueo. Diluido en PBS 1x |
| Hematoxilina QS | Vector Laboratories | H3404 | Detección de núcleos |
| HE | Bio-Optica | 04-061010 | Análisis histológico del teratoma |
| Hoechst | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Suero de caballo de detección |
| de núcleos | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | Para solución bloqueante |
| HRP-conjugada de cabra anti-ratón IgG | SantaCruz | sc2005 | Anticuerpo secundario (inmunoperoxidasa) |
| ImmPACT NovaRED | Vector Laboratories | SK4805 | Sustrato de peroxidasa |
| Jeringa de insulina con aguja (25 G) | Terumo | SS+01H25161 | Procedimiento de amniocentesis |
| Klf4 | SantaCruz | sc-20691 | IgG |
| L-glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030 | Para AF de ratón, células iPS-AF y caldo LB de medio de diferenciación |
| (Lennox) | Sigma | L3022 | Para el crecimiento bacteriano |
| LIF | Sigma | L5158 | Para ratón AF y células iPS-AF medio |
| Matrigel | BD | 354234 | Para diferenciación in vitro. Diluido 1:10 en DMEM |
| Metanol | Sigma | 32213 | Bloqueo de peroxidasa |
| MULTIWELL Placa de 24 pocillos | BD Falcon | 353047 | Para diferenciación in vitro |
| MULTIWELL Placa de 6 pocillos | BD Falcon | 353046 | Para el cultivo de células MEF, AF de ratón e iPS-AF |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | IgG policlonal de conejo |
| Aminoácidos no esenciales | Sigma | M7145 | Para ratón AF, células iPS-AF y medio de diferenciación |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S2000 | Para solución de bloqueo. Diluido en PBS 1x |
| NP-40 | Sigma | 12087-87-0 | Para permeabilización celular. Diluido en PBS 1x |
| Oct4 | SantaCruz | sc-5279 | monoclonal IgG2b |
| Thermo Fisher Scientific | 18418012 | para RT-PCR | |
| Paraformaldehído (solución) | Sigma | 441244 | PFA, fijador, diluido en PBS |
| PBS 10x | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | D-PBS, libre de Ca2+/Mg2+. Diluido con agua estéril para obtener PBS 1x |
| Penicilina - Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Para MEF, AF de ratón, células iPS-AF y medio de diferenciación Placa de |
| Petri (150 mm) | BD Falcon | 353025 | Para cultivo de MEF, cultivo de tejidos |
| Plásmido de expresión de transposasa PiggyBac | Proporcionado por el profesor Andras Nagy | laboratorio-mPBase | |
| PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS plásmido de transposón | Proporcionado por el profesor Andras Nagy | laboratorio-PB-tetO2-IRES-OKMS | |
| QIAprep Spin Maxiprep Kit | Qiagen | 12663 | Para la purificación de plásmidos |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Para la purificación |
| de plásmidosPlásmido transactivador de transposón de tetraciclina inversa | Proporcionado por el profesor Andras Nagy | laboratorio-rtTA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | para extracción de ARN |
| Sox2 | SantaCruz | sc-17320 | IgG policlonal de cabra |
| SSEA1 | Abcam | ab16285 | IgM monoclonal de ratón |
| SuperScript II Transcriptasa inversa | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | para RT-PCR |
| T | Abcam | ab20680 | IgG policlonal de conejo Taq |
| ADN polimerasa | Thermo Fisher Scientific | 10342020 | PCR |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | Pasaje de cultivo celular |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-047 | Para permeabilización celular, diluido en PBS 1x |
| Reactivo TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596-026 | Para extracción |
| Tubb3 | Promega | G712A | IgG1 |
| TWEEN-20 | Sigma | P1379 | Para permeabilización celular, diluido en PBS 1x |
| α fp | R& D Systems | MAB1368 | IgG1 monoclonal de ratón |
| αSMA | Abcam | ab7817 | IgG2a |
| (FuGENE HD) | Promega | E2311 | Para la transfección de células AF |
| Microscopio estereoscópico | Nikon | SM2645 | Para realizar amniocentesis |
| 200 μ l consejos | Sarstedt | 70.760012 | Para recoger colonias de bacterias |
| Tijera | F.S.T | 14094-11 inoxidable 25U | Para realizar amniocentesis |
| Etanol | Sigma | 2860 | Para limpiar la pared abdominal de la madre embarazada |
| Placa de Petri para cultivo de tejidos (150 mm) | BD Falcon | 353025 | para la expansión de MEF |
| Mitomicina C | Sigma | M4287-2MG | para la inactivación de MEF |
| Placa de 96 pocillos | MULTIWELL BD Falcon | 353071 | para cultivo iPS-AF |
Referencias
- You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
- Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection.
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Reimpresiones y permisos
