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Artículo de método

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

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DOI:

10.3791/54598

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28 de febrero de 2017

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1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

En este artículo

Resumen

En este estudio, generamos células madre pluripotentes inducidas a partir de células de líquido amniótico de ratón, utilizando un sistema de transposones no viral.

Resumen

Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) se generan a partir de células somáticas de ratón y humanas mediante la expresión forzada de factores de transcripción definidos utilizando diferentes métodos. Aquí, producimos células iPS a partir de células de líquido amniótico de ratón, utilizando un sistema de transposones no viral. Todas las líneas celulares iPS obtenidas mostraron características de células pluripotentes, incluida la capacidad de diferenciarse hacia derivados de las tres capas germinales in vitro e in vivo. Esta estrategia abre la posibilidad de utilizar células de fetos enfermos para desarrollar nuevas terapias para los defectos congénitos.

Introducción

El diagnóstico prenatal es una importante herramienta clínica para evaluar enfermedades genéticas (es decir, aberraciones cromosómicas, enfermedades monogénicas o poligenéticos / multifactorial) y malformaciones congénitas (hernia diafragmática congénita es decir, lesiones pulmonares quísticas, onfalocele, gastrosquisis). El líquido amniótico (AF) las células son fáciles de obtener de forma rutinaria los procedimientos programados durante el segundo trimestre del embarazo (es decir, la amniocentesis y amniorreducción) o cesáreas 1, 2. La disponibilidad de las células AF de pacientes prenatales o neonatales ofrece la posibilidad de utilizar esta fuente para la medicina regenerativa, y varios investigadores investigó la posibilidad de tratar diferentes daños de tejidos o enfermedades utilizando una población de células madre aisladas de AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. La posibilidad de obtener fácilmente células AF de pacientes enfermos, en una ventana de tiempo en el que la enfermedad es a menudo estacionario, abre el camino a la idea de utilizar esta fuente de células para los propósitos de reprogramación. De hecho, las células madre pluripotentes inducidas (iPS) derivadas de células AF podrían diferenciarse en las células de interés para las pruebas de fármacos in vitro o para los enfoques de ingeniería de tejidos, con el fin de preparar una terapia adecuada específica del paciente antes del parto. Muchos estudios ya han demostrado la capacidad de las células AF para ser reprogramado y diferenciarse en una amplia gama de tipos de células 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Desde el descubrimiento por Takahashi y Yamanaka 28 de células somáticas reprogramadas a través de la expresión forzada de cuatro factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y CMYC), se han hecho progresos en el campo de la reprogramación. Teniendo en cuenta los diferentes métodos, podemos distinguir entre los enfoques virales y no virales. La primera espera que el uso de vectores virales (retrovirus y lentivirus), que tienen una alta eficiencia, pero silenciamiento generalmente incompleta del transgén retroviral, tanto con la consecuencia de una línea de células parcialmente reprogramado y el riesgo demutagénesis por inserción 29, 30, 31. El método no viral utiliza diferentes estrategias: es decir, plásmidos, vectores, ARNm, proteínas, transposones. La derivación de células iPS libres de secuencias transgénicas pretende eludir los efectos potencialmente nocivos de la expresión del transgen con fugas y la mutagénesis por inserción. Entre todas las estrategias no virales mencionados anteriormente, el sistema de transposón / transposasa PiggyBac (PB) requiere sólo las repeticiones terminales invertidas que flanquean un transgén y la expresión transitoria de la enzima transposasa para catalizar eventos de inserción o de escisión 32. La ventaja en el uso de transposones sobre otros métodos para la generación de células iPS es la posibilidad de obtener células iPS libre de vectores con un enfoque de vector no viral que muestra la misma eficacia de los vectores retrovirales. Esto es posible mediante escisión trace-menos de la codificación transposón integrado para la reprogramming siguientes factores de una nueva expresión transitoria de la transposasa en las células iPS 33. Dado que PB es eficiente en diferentes tipos de células 34, 35, 36, 37, es más adecuado para un enfoque clínico con respecto a los vectores virales, y permite la producción de células iPS sin xeno contrario a protocolos de producción virales actuales que utilizan xenobiótico condiciones, este sistema se utiliza para obtener células iPS a partir murino AF.

Aquí proponemos un protocolo detallado siguientes trabajos ya publicados para mostrar la producción de iPS a partir de células pluripotentes clones AF de ratón (células iPS-AF) 38.

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Protocolo

Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con la ley italiana. muestras murino AF fueron cosechadas de los ratones gestantes en 13,5 días postcoital (DPC) de ratones C57BL / 6 ratones Tg (UBC-GFP) 30Scha / J llamada GFP.

Producción 1. transposón

NOTA: los vectores de expresión de transposones se generaron utilizando procedimientos de clonación estándar. El ADN plásmido para ratón AF células transfección se preparó usando kits comerciales.

  1. Mezclar 10 ng de ADN de plásmido con 50 l de bacterias DH5a en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar el tubo de microcentrífuga en hielo durante 20 min.
  2. choque térmico a 42 ° C durante 40 segundos.
  3. Coloque el tubo de microcentrífuga en hielo durante 2 min.
  4. Añadir 250 l de caldo de caldo de lysogeny (LB) precalentado (37 ° C). Agitar (300 rpm) a 37 ° C durante 30 min.
  5. Spread 30 l de cada transformación sobre placas LB con 0,1 mg / ml de ampicilina. Permita que las placas se sequen y se incuban invertidas a 37 ° C overnight.
  6. Al día siguiente, por la tarde, Pick 3 colonias, utilizando puntas estériles de 200 l, de cada transformación y transferencia a 0,1 mg / ml de LB amp.
  7. Agitar bacterias (300 rpm) durante la noche a 37 ° C.
  8. Para la purificación de plásmido utilizar kits comerciales. plásmidos de archivo a -20 ° C.

2. fibroblastos de embriones de ratón (MEF) Cultura

  1. El recubrimiento de las placas de 6 pocillos con 0,1% de gelatina
    1. recubrir placas bajo el capó adición de 1 ml de gelatina estéril al 0,1% a cada uno de los seis pozos. Deje que la gelatina se polimeriza en la incubadora (37 ° C) durante 1 hora.
    2. Desechar el exceso, y secar las placas durante 1 hora.
    3. Use parafina para sellar y las placas, almacenarlas a temperatura ambiente.
  2. La inactivación de MEF con mitomicina C
    1. Descongelar un vial de 4 x 10 6 células MEF utilizando un baño de 37 ° C.
    2. Semillas MEF en la campana en una placa de Petri (150 mm) con medio de MEF.
    3. Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO2.
    4. (Precaución) Añadir mitomicina C (5 mg / ml) cuando las células son confluentes.
    5. Células de lugar en una incubadora (37 ° C y 5% de CO2) durante 3 h.
    6. Retire medio con células mitomicina C. Lavar tres veces con solución salina tampón fosfato 1x (PBS).
    7. Añadir 2 ml de las células con tripsina y local comercial en el incubador a 37ºC durante 5 min. Después, añadir 18 ml de medio de bloqueo para detener la reacción con tripsina.
    8. Contar las células utilizando una cámara Burker de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    9. centrifugar las células a 145 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante.
    10. Seed 60.000 células / cm 2 de inactivada MEF sobre placas recubiertas de gelatina 0,1%.
    11. Cultivar las células durante 24 horas a 37 ° C y CO 2 al 5%, antes de la siembra AF y / o células iPS-AF.

3. aislamiento de células de ratón AF

  1. Configurar y comprobar los apareamientos programados PLU vaginalgs después de 24 h de co-vivienda.
  2. Observe hasta 13,5 dpc y sacrificar presa embarazada a través de la dislocación cervical.
  3. Limpiar la pared abdominal del animal usando 70% de etanol.
  4. Con unas tijeras, realizar una incisión de laparotomía media la longitud de la pared abdominal para acceder a la cavidad abdominal.
  5. Exponer el útero con unas pinzas. Quitar el útero utilizando tijeras y transferencia en una placa de Petri de 100 mm lleno de PBS estéril 1x colocó en hielo.
  6. Utilizar un microscopio estereoscópico para recoger el AF a un aumento de 10X.
  7. Sostener el útero con una pinza y quitar la pared uterina con unas tijeras. Tenga cuidado para evitar cualquier daño a las membranas fetales y la consiguiente pérdida de líquido amniótico.
  8. Recoger los fetos en una placa de Petri de 100 mm estéril lleno de 1x PBS y colocar en hielo.
  9. Agarre la placenta de un feto con una pinza de punta fina y colocar en un recipiente limpio 100 mm placa de Petri.
  10. Retire el saco vitelino con unas pinzas de punta fina.
  11. perturbar el amnios con unas pinzas de punta fina y recoger 30 l de AF para cada feto usando una jeringa de insulina en un vial cónico de 15 ml.
  12. Después de la recogida AF, lavar cada feto con estéril 1x PBS suplementado con suero de 1% de bovino fetal (FBS) y recoger en los 15 ml tubo cónico que contiene el AF.
  13. Centrifugar AF a 145 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante bajo el capó y sembrar las células sedimentadas AF.

4. ratón AF cultivo celular

  1. Siembra de células de ratón AF
    1. Un día antes de la siembra, preparar una placa de 6 pocillos recubierta con gelatina 0,1% con MEF tratado con mitomicina C.
    2. Después de la recogida de AF, sembrar las células obtenidas de una amniocentesis (alrededor de 1 x 10 7 células obtenidas de fetos 6) sobre el mitóticamente inactivados MEF utilizando medio de cultivo AF.
    3. Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO 2, cambiando el medio cada dos días.
    4. Después de 7 días de cultivo, transfect células AF siguiendo el procedimiento descrito a continuación.

5. La transfección, la generación de células iPS-AF y Cultura

NOTA: células de ratón AF se transfectaron con el plásmido de transposón PB-tetO2-IRES-OKMS, en conjunción con un plásmido de expresión de la transposasa (mPBase) y con el transactivador de tetraciclina inversa plásmido transposón (PB-CAG-rtTA). Todos los plásmidos fueron proporcionados por el profesor Andras Nagy 33.

  1. Mezclar 1 g de PB-tetO2-IRES-OKMS con 0,5 g de mPBase y 0,5 g de PB-CAG-rtTA (ADN total: 2 g) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Diluir el ADN a 100 l con medio libre de suero (de Eagle modificado por Dulbecco - DMEM).
  3. Añadir 8 l de la reactivo de transfección (por ejemplo, FUGENE) (en la proporción de ADN plasmídico: agente de transfección de 2 g (ADN) a agente de transfección 8 l) en el ADN que contiene 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
  4. Incubar la transfección mezcla de reactivos / ADN durante 15 min a temperatura ambiente.
  5. Añadir gota a gota 100 l de la mezcla de reactivo de transfección / DNA por pocillo a una placa de 6 pocillos con células AF ratón y distribuir por agitación suave, con un volumen final de 2 ml / pocillo. Dejar durante 24 h.
  6. El día después, inducir la expresión de factores de la Yamanaka (Oct4, Klf4 cMyc, Sox2) por la alimentación de las células con medio fresco iPS-AF suplementado con 1,5 g / ml de doxiciclina (2 ml de medio para cada pocillo).
  7. Alimentar a las células de todos los días, sin paso, en un medio con dox fresca (mantener las células en medios suplementados con doxiciclina hasta el punto 5.13).
  8. Observar las células dentro de las 24 h para la expresión mCherry y diariamente durante la formación de colonias (colonias aparecen típicamente entre 20 y 30 días después de la transfección).
  9. Un día antes de la recolección de colonia, preparar una placa de cultivo tisular de 96 pocillos con MEF tratado con mitomicina C.
  10. Recoger colonias individuales en 50 l de volumen usinga 200 pipeta l, y transferir de forma secuencial en una placa de 96 pocillos en pocillos individuales.
  11. El día después, se disocian todas las colonias en células individuales mediante la adición de 50 l de la tripsina comercial e incubar durante 5 min a 37 ° C.
  12. Pipetear arriba y abajo para desagregar la colonia.
  13. Transferencia de 50 l de la tripsina que contiene la colonia disociada en un nuevo bien con inactivada MEF en una gelatina 0,1% recubierto de 96 pocillos de la placa llena con 100 l de medio fresco iPS-AF suplementado con doxiciclina.
  14. Cuando las células alcanzan el 60-70% de confluencia, se dividió en un pocillo de una placa de 24 pocillos.
  15. Cuando las células alcanzan el 60-70% de confluencia, se dividió 1: 2 a dos pocillos, uno con doxiciclina y la otra sin doxiciclina, para verificar si las colonias aparecen también en la condición sin doxiciclina.
  16. Seguir manteniendo clones iPS-AF, doxiciclina independiente, en inactivada MEF en el medio IPS-AF.
  17. Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO 2, CHAnging medio diario.

6. La tinción de fosfatasa alcalina

  1. Realizar tinción de fosfatasa alcalina siguiendo el protocolo del fabricante cuando se produzca la aparición de células iPS-AF independientes doxiciclina.

7. La inmunofluorescencia

  1. Siempre que se produzca la aparición de células iPS independientes doxiciclina-AF, sembrar 150.000 células / cm2 en un pocillo de una placa de 24 pocillos con inactivada MEF, y hacer crecer las células durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO2.
  2. (Precaución) fijar las células mediante la adición de 300 l por pocillo de 4% de paraformaldehído (PFA) durante 15 min a temperatura ambiente.
  3. Añadir 300 l de 0,1% de células para permeabilizar NP-40.
  4. Enjuagar las células con 300 l de 0,1% PBS-Tween 20.
  5. Añadir 300 l de tampón de bloqueo de la (10% de suero de caballo en 1x PBS) durante 1 hr a temperatura ambiente.
  6. Utilice los siguientes anticuerpos primarios: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) y SSEA1 (1:80). Diluir SSEA1 con 1% de albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra normal al 10%, 0,3 M de glicina en 0,1% PBS-Tween-20. Diluir todos los otros anticuerpos con 10% de suero de caballo en 1x PBS.
  7. Se incuban los anticuerpos durante la noche a 4 ° C.
  8. Enjuague con 300 l de 0,1% PBS-Tween-20.
  9. Usa los anticuerpos secundarios diluidos en suero de caballo al 10% en 1 x PBS: cabra Alexa594-conjugado anti-IgG de ratón (1: 200), Alexa594-conjugado IgG de pollo anti-cabra (1: 200), Alexa594 conjugado de pollo anti-IgG de conejo (1: 200), de cabra conjugado con Alexa568 anti-IgM de ratón (1: 200). Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.
  10. Enjuague con 1x PBS.
  11. núcleos de tinción con solución de Hoechst (1: 10.000) en 1x PBS.

8. En Vitro Diferenciación Celular

  1. Para formar gota colgante cuerpos embrioides (EBS), cultivar las gotas individuales (2.000 células / 20 l) sobre la tapa de las placas Petri, con el medio de diferenciación.
  2. Incubar las placas a 37 ° Cy 5% de CO2 durante 4 días.
  3. Transferir los EB en 100 mm platos bacteriana grado en el cultivo en suspensión durante 3 días en medio de diferenciación.
  4. EBs de placas en placas de 24 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal (diluido 1:10 en DMEM) durante otros 14 días.
  5. Para los análisis de inmunofluorescencia, utilizar anticuerpos primarios: T (1: 100), αfp (1: 200) y Tubb3 (1: 500) 37.

Formación 9. En Vivo Teratoma

  1. Se inyectan 100 l de 1x PBS que contenía 1 x 10 6 células iPS-AF en el músculo de la extremidad posterior de Rag2 - / -? C - / - ratones.
  2. Sacrificar los ratones mediante dislocación cervical 6 semanas después de la inyección de células.
  3. Retire las masas tumorales, que se distinguen por su tamaño, de la extremidad posterior de los ratones durante los siguientes análisis.
  4. Cortar 7-10 micras secciones transversales de espesor del tumor isopentano-congelado usando un criostato.
  5. Para una Haematoxylind eosina (HE) de la mancha:
    1. Manchar con HE para evaluar la composición del tejido tumoral, siguiendo el protocolo del fabricante.
  6. Para las manchas de inmunoperoxidasa:
    1. Fijar secciones teratoma con 4% PFA durante 15 min a temperatura ambiente.
    2. Permeabilizar con 0,1% Triton X-100.
  7. Incubar con los siguientes anticuerpos: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) y αSMA (1: 100) diluido en 1% de BSA en PBS 1x. Incubar durante 1 hora a 37 ° C (para Tubb3) o durante la noche a 4 ° C (para los otros anticuerpos).
  8. peroxidasa bloque usando 100% de metanol durante 20 min.
  9. Incubar durante 45 min a 37 ° C con el anticuerpo secundario conjugado con HRP (1: 150) anti-ratón.
  10. Enjuague con 1x PBS.
  11. Incubar con peroxidasa sustrato (HRP) (ver Materiales Tabla) durante 5 min.
  12. Enjuague con agua del grifo durante 5 minutos.
  13. Teñir con hematoxilina QS durante 9 s.
  14. Enjuague con agua del grifo.

10. Extracción de ARN a partir de células

  1. Utilice un kit de extracción de ARN comercial de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante.

11. La extracción de RNA de teratoma

  1. Homogeneizar el teratoma usando una mano de mortero y mortero y nitrógeno líquido para evitar la descongelación de la muestra.
  2. Pesar 25 mg de tejido.
  3. Añadir 1 ml de reactivo comercial para la extracción de RNA y 200 l de cloroformo.
  4. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
  5. Centrifugar a 13.000 xg y 4 ° C durante 15 min.
  6. Transferir el sobrenadante aclarado a un tubo nuevo.
  7. Para purificar el RNA utilizar un kit de extracción de ARN comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Análisis de la reacción en cadena de la polimerasa 12. Reverse Transcription

  1. Sintetizar la primera hebra de ADNc utilizando una transcriptasa inversa para la transcripción inversa (RT) reacción en cadena de polimerasa (PCR) y oligo accor (dT)ding con el protocolo del fabricante, para obtener 50 ng / l de cDNA. Diluir cDNA con agua libre de RNasa a una concentración de 10 ng / mL.
  2. Realizar RT-PCR utilizando la polimerasa de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante, utilizando 1 ng / l de cDNA.

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Resultados

Para evaluar la capacidad de la reprogramación, se recogieron las células de ratón AF de fetos de ratones GFP. Las células fueron transfectadas con el plásmido de transposón circular PB-tetO2-IRES-OKMS, que expresa los factores Yamanaka (Oct4, Sox2, Klf4 y cmyc) vinculados a la proteína fluorescente mCherry de una manera inducible por doxiciclina, y revertir transactivador de tetraciclina (PB- CAG-rtTA) plásmidos junto con el plásmido de expresión de la transposasa (mPBase). Células de r...

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Discusión

El método elegido para obtener la inducción de la pluripotencia es relevante para la seguridad clínica de células con respecto al trasplante a largo plazo. Hoy en día, existen varios métodos adecuados para la reprogramación. Entre los métodos no integrativos, la viral (SEV) vector Sendai es un virus de ARN que pueden producir grandes cantidades de proteína sin integrar en el núcleo de las células infectadas 40 y podría ser una estrategia para obtener células iPS. vectores SeV podría ser un candid...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación CARIPARO Subvención número 13/04 y la Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Subvención número 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin y Michela Pozzobon están financiadas por la Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin está financiada por la Fundación CARIPARO Subvención número 13/04. Paolo De Coppi está financiado por la organización benéfica Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de Petri de grado bacteriano de 100 mm BD Falcon351029Para in vitro diferenciación
2-mercaptoetanol SigmaM6250Para AF de ratón, células iPS-AF y medio de diferenciación
Alexa568 conjugado anti-ratón de cabra IgM Thermo Fisher ScientificA21043Anticuerpo secundario (inmunofluorescencia)
Alexa594-conjugado pollo anti-cabra IgG Thermo Fisher ScientificA21468Anticuerpo secundario (inmunofluorescencia)
Alexa594-conjugado pollo anti-conejo IgG Thermo Fisher ScientificA21442Anticuerpo secundario (inmunofluorescencia)
Alexa594-conjugado de cabra anti-ratón IgG Thermo Fisher ScientificA11005Anticuerpo secundario (inmunofluorescencia)
Kit de fosfatasa alcalina Sigma85L1Fosfatasa alcalina  tinción
AmpicilinaSigmaA0166Para la selección bacteriana
Albúmina sérica bovina SigmaA7906BSA, para solución de bloqueo. Diluido en PBS 1x
CloroformoSigmaC2432Para la extracción de ARN
DH5 y células alfa;Thermo Fisher Scientific18265-017Bacterias para el procedimiento
Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039Para MEF, AF de ratón, células iPS-AF y medio
de diferenciaciónDoxiciclina SigmaD9891Para la expresión de factores exógenos
Tubos de microcentrífuga (1,5 ml) Sarstedt 72.706Para la producción de PB 
ES FBS Thermo Fisher Scientific10439024para AF de ratón, células iPS-AF y medio de diferenciación
FBS Thermo Fisher Scientific 10270106para MEF medio
Pinza de punta finaF.S.T. Dumont #5 Aislamiento de AF
GelatinaJ.T.Baker131Utilizada al 0,1%, diluida en PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718Para solución de bloqueo. Diluido en PBS 1x
Hematoxilina QSVector LaboratoriesH3404Detección de núcleos
HE Bio-Optica04-061010Análisis histológico del teratoma
Hoechst Thermo Fisher ScientificH3570Suero de caballo de detección
de núcleos Thermo Fisher Scientific16050-122Para solución bloqueante
HRP-conjugada de cabra anti-ratón IgGSantaCruzsc2005Anticuerpo secundario (inmunoperoxidasa)
ImmPACT NovaRED Vector LaboratoriesSK4805Sustrato de peroxidasa
Jeringa de insulina con aguja (25 G)TerumoSS+01H25161Procedimiento de amniocentesis
Klf4 SantaCruzsc-20691IgG
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030Para AF de ratón, células iPS-AF y caldo LB de medio de diferenciación
(Lennox)SigmaL3022Para el crecimiento bacteriano
LIF SigmaL5158Para ratón AF y células iPS-AF medio
Matrigel BD354234Para diferenciación in vitro. Diluido 1:10 en DMEM
MetanolSigma32213Bloqueo de peroxidasa
MULTIWELL Placa de 24 pocillosBD Falcon353047Para diferenciación in vitro
MULTIWELL Placa de 6 pocillosBD Falcon353046Para el cultivo de células MEF, AF de ratón e iPS-AF
Nanog ReproCELLRCAB0002P-FIgG policlonal de conejo
Aminoácidos no esenciales SigmaM7145Para ratón AF, células iPS-AF y medio de diferenciación
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS2000Para solución de bloqueo. Diluido en PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0Para permeabilización celular. Diluido en PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279monoclonal IgG2b
 Thermo Fisher Scientific18418012para RT-PCR
Paraformaldehído (solución)Sigma441244PFA, fijador, diluido en PBS
PBS 10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, libre de Ca2+/Mg2+. Diluido con agua estéril para obtener PBS 1x
Penicilina - Estreptomicina Thermo Fisher Scientific15070063Para MEF, AF de ratón, células iPS-AF y medio de diferenciación Placa de
Petri (150 mm)BD Falcon353025Para cultivo de MEF, cultivo de tejidos
Plásmido de expresión de transposasa PiggyBac Proporcionado por el profesor Andras Nagylaboratorio-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS plásmido de transposónProporcionado por el profesor Andras Nagylaboratorio-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663Para la purificación de plásmidos
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Para la purificación
de plásmidosPlásmido transactivador de transposón de tetraciclina inversa Proporcionado por el profesor Andras Nagylaboratorio-rtTA
RNeasy Mini Kit Qiagen74134para extracción de ARN
Sox2 SantaCruzsc-17320IgG policlonal de cabra
SSEA1 Abcamab16285IgM monoclonal de ratón
SuperScript II Transcriptasa inversa Thermo Fisher Scientific18064-014para RT-PCR
T Abcamab20680IgG policlonal de conejo Taq
ADN polimerasaThermo Fisher Scientific10342020PCR
Trypsin Thermo Fisher Scientific25300-054Pasaje de cultivo celular
Triton X-100Bio-Rad161-047Para permeabilización celular, diluido en PBS 1x
Reactivo TRIzolThermo Fisher Scientific15596-026Para extracción
Tubb3   Promega G712AIgG1
TWEEN-20SigmaP1379Para permeabilización celular, diluido en PBS 1x
α fp     R& D SystemsMAB1368IgG1 monoclonal de ratón
αSMA Abcamab7817IgG2a
(FuGENE HD)Promega E2311Para la transfección de células AF
Microscopio estereoscópicoNikonSM2645Para realizar amniocentesis 
200 μ l consejosSarstedt 70.760012Para recoger colonias de bacterias
TijeraF.S.T14094-11 inoxidable 25UPara realizar amniocentesis 
EtanolSigma2860Para limpiar la pared abdominal de la madre embarazada
Placa de Petri para cultivo de tejidos (150 mm) BD Falcon353025para la expansión de MEF
Mitomicina CSigmaM4287-2MGpara la inactivación de MEF
Placa de 96 pocillosMULTIWELL BD Falcon353071para cultivo iPS-AF
de clonación policlonal de conejo Oligo (dT) de ratón de ARN monoclonal de ratón Reactivo de transfección monoclonal de ratón

Referencias

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