Artículo de método

Patch Clamp grabación de células amacrinas Starburst en un plano de montaje Preparación de Deafferentated retina del ratón

DOI:

10.3791/54608

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13 de octubre de 2016

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1Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

En este artículo

Resumen

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Este protocolo muestra cómo realizar la grabación de células enteras patch clamp en neuronas de la retina de una preparación plana de montaje.

Resumen

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La retina de mamífero es un tejido en capas compuesta de múltiples tipos neuronales. Para entender cómo las señales visuales se procesa dentro de su red sináptica intrincada, registros electrofisiológicos se utilizan con frecuencia para estudiar las conexiones entre las neuronas individuales. Hemos optimizado un preparado de montaje plana para la grabación de patch clamp de neuronas marcadas genéticamente en tanto GCL (capa de células ganglionares) y INL (capa nuclear interna) de las retinas de ratones. Grabación de las neuronas en INL-montajes planos se ve favorecida sobre las rebanadas porque las conexiones verticales y laterales se conservan en la antigua configuración, permitiendo que los circuitos de la retina con grandes componentes laterales para ser estudiado. Hemos utilizado este procedimiento para comparar las respuestas de las neuronas espejo, mediante asociación en las retinas como las células amacrinas starburst colinérgicos (ZEC).

Introducción

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Como parte fácilmente accesible del sistema nervioso central, la retina ha sido durante décadas un modelo útil en los estudios de neurociencia. El marcaje genético de las neuronas ha permitido una caracterización detallada de las conexiones sinápticas en la retina. Con muchas metodologías disponibles para examinar la función y la morfología de las neuronas de la retina, la técnica de registro de pinzas de parche ha sido fundamental en nuestra comprensión actual de las señales transmitidas verticalmente en la retina. Estas señales se originan a partir de la absorción de fotones en los fotorreceptores y se envían a los centros visuales del cerebro a través de la estimulación de las células ganglionares de la retina (RGC). A pesar de la gran cantidad de conocimientos acumulados hasta ahora, la diversidad neuronal en la retina vascularizada de los mamíferos sigue sin resolverse y obstruye la apreciación completa de los circuitos retinianos que subyacen a la visión normal. Esto se debe en parte a que la mayoría de las grabaciones se realizaron en cortes de retina para intercambiar la integridad del circuito lateral por el acceso a las neuronas retinianas más proximales1-3. Para obtener una imagen completa de cómo la retina computa las señales visuales, es deseable registrar las neuronas en montajes planos en los que las conexiones laterales, grandes y pequeñas, pueden conservarse mejor.

Cuando la transmisión sináptica de los fotorreceptores a las células bipolares se interrumpe debido a una vía de señalización defectuosa del receptor metabotrópico de glutamato 6 (mGluR6) en las células bipolares despolarizadas4-6 o simplemente como resultado de la pérdida de fotorreceptores en retinas degeneradas7-10, muchas RGC exhiben actividades oscilatorias. Estas oscilaciones se originan en múltiples fuentes, sin embargo, la que involucra el acoplamiento de la unión de brecha entre las células amacrinas AII (AII-AC) y las células bipolares de cono despolarizante (DCBC) ha recibido la mayor atención y, por lo tanto, se comprende mejor1,7,11. Hemos encontrado otra fuente, que persiste bajo bloqueo farmacológico de la red AII-AC/DCBC antes mencionada y que impulsa la oscilación de SACs de tipo OFF en ratones RhoΔCTA y Nob con retinas deafferentes7,8,12. A continuación, detallamos nuestro protocolo de preparación de monturas planas de retina para el registro de neuronas INL. Este enfoque utiliza líneas de ratones comerciales (código Jax 006410 y 007905) para marcar las neuronas colinérgicas de la retina mediante la expresión de proteínas fluorescentes (tdTomato) que son identificables bajo un microscopio fluorescente equipado con óptica de mejora de contraste. Algunos resultados experimentales obtenidos a través de este abordaje han sido reportados previamente4,5,7,13.

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Protocolo

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Ética aprobación - los procedimientos que implican sujetos animales se realizaron de conformidad con las reglas y regulaciones de los Institutos Nacionales de Salud de los animales de investigación, tal como fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el uso comité de Baylor College of Medicine.

1. externa y de soluciones internas

  1. Use la solución de Ringer de mamíferos durante la disección retina y como la solución externa de registro electrofisiológico posterior. Preparar la solución de Ringer mamífero de la solución madre 10x (sin calcio) en el día de la grabación, y añadir CaCl2 gota a gota, después de 15 minutos de carbogenation (95% de O2 y 5% de CO 2). La solución final 1x contiene (en mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO 3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 1 MgSO 4 y 10 D-glucosa.
  2. Use dos soluciones internas para caracterizar las oscilaciones SAC. Pruebala utilidad de las soluciones preparadas en las grabaciones de patch clamp de células enteras prolongados en CGR de ratón adulto y almacenar los lotes verificados en 500 ml de alícuotas a -20 ° C hasta su uso.
    1. Para la grabación de potencial de membrana de oscilación, utilice una solución interna a base de potasio que contiene (en mM): 125 K-gluconato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES y 0,2% biocitina (w / v). Ajustar el pH a 7,3 con KOH.
    2. Para la grabación de excitación y de las corrientes postsinápticas inhibitorias, utilice una solución interna a base de cesio que contiene (en mM): 100 Cs-metanosulfonato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES y 0,2% biocitina ( Virginia Occidental). Ajustar el pH a 7,3 con CsOH.

2. Preparación para el Día de la grabación

  1. Para preparar una membrana de nitrocelulosa con los agujeros abiertos, perforar manualmente la membrana con un golpeador personalizada a partir de una 16 G aguja de la jeringa romo y aplanar la membrana entre dos placas de vidrio limpias. Por su conjunto-montar retina, hacer un agujero central de 0,2 mm de diámetro y rodearlo de 4 agujeros más grandes que son 1-1,2 mm de diámetro.
  2. Para hacer un filamento de material de relleno a medida para cargar solución interna en los electrodos, fundir una punta de pipeta de 10 l en el medio y alargar suavemente la parte fundida hasta que se enfría y se endurece. Justo antes de usar, usar una hoja de afeitar limpia para cortar el filamento hasta que es ligeramente más largo que las pipetas de parche.
  3. Tire de pipetas de parche en un extractor programable de tubo de vidrio de borosilicato con un filamento interno. Fabricación las micropipetas el día del experimento y utilizarlos inmediatamente.
    NOTA: Para las ZEC de grabación, se utiliza la siguiente configuración de tirador: calor: 484; tire: 0; velocidad: 25; el tiempo de retardo: 1; presión: 400 y un valor de rampa de 462. El OD e ID de los tubos de borosilicato son 1,65 mm y 1,0 mm, respectivamente. Resistencia de las pipetas es 10-14 mO.
  4. Una hora antes de la cosecha de tejidos, descongelar un tubo de solución interna por Shaking en un vórtice para> 30 min.

3. La disección de la retina

  1. Anestesiar al animal en un 4% de isoflurano en oxígeno hasta que el animal pierde la capacidad de respuesta a una pizca dedo del pie. Sacrificar al animal por dislocación cervical.
  2. Corte ambos globos oculares fuera de los nervios ópticos a 1-2 mm de distancia de las cabezas del nervio óptico con Iris-rectas señalado tijeras.
  3. Rollo de los globos oculares en una toalla de papel limpia para eliminar la sangre y luego sumergirlos en una solución de Ringer carbogenated mamíferos. Haz un agujero en el limbo con una aguja de 23 G y la bisectriz de los globos oculares cortando a lo largo del limbo con micro-tijeras. Retire la córnea y el cristalino utilizando unas pinzas finas.
    1. Para todo el montaje de la retina, pelar suavemente toda la retina fuera del epitelio pigmentado con unas pinzas finas y hacer cortes cuatro 1,5-2 mm ortogonales desde el borde hacia la cabeza del nervio óptico.
  4. Sumergir una membrana de nitrocelulosa perforado en el plato y arrastrar suavemente sobre la retina conGCL el lado hacia arriba. Coloque la cabeza del nervio óptico en el orificio central en la preparación de todo el montaje en una retina. La transferencia de la membrana con la retina en otro plato limpio. aplanar suavemente la retina con un pincel fino para parecerse a una cruz de Malta y sentar los cuatro bordes a través de los agujeros.
    1. Si una fracción de la retina debe ser examinado en un momento, corte cada ocular preparado a partir de la Etapa 3.3 en 3-4 piezas con una cuchilla de afeitar con el epitelio pigmentado permanece unido. Proteger las piezas no utilizadas de la luz en la solución externa carbogenated y usarlos dentro de las 12 horas.
  5. Seque la membrana de nitrocelulosa con un trozo de papel de filtro seco y eliminar la membrana limitante interna vítreo y con unas pinzas y un pincel.
  6. Asegúrese de que todos los bordes de la retina están totalmente unidos a la membrana antes de transferir el conjunto en la cámara de grabación con un cubreobjetos de vidrio sellado en la parte inferior. Asegure la membrana con grasa de vacío a la hoja de la cubierta y rehydrate la retina con la solución externa. Tenga cuidado no para atrapar las burbujas de aire debajo de la asamblea.
  7. Ajuste la cámara en el escenario de un microscopio vertical. Perfundir la cámara con (34-35 ° C) solución externa caliente carbogenated a una velocidad de ~ 3 ml por min.
  8. Examinar la retina bajo una lente objetivo de 10x primero y, a continuación, utilizar una lente de 60x de inmersión en agua para ver neuronas GCL y INL bajo contraste de interferencia diferencial (DIC) y / o de epifluorescencia. Para visualizar las ZEC tdTomato expresan, utilice una fuente de luz blanca LED en combinación con un filtro de excitación de 554 nm y un filtro de emisión de 581 nm.

4.-Patch Clamp células enteras de grabación del plano de montaje en la retina

  1. Filtrar la solución interna a través de un filtro de jeringa en el filamento relleno personalizado.
  2. Inserte el filamento en una micropipeta recién tirada y dispensar la solución interna cerca de la punta hasta que la solución cubre el electrodo de alambre de plata para>5 mm. Sujetar la micropipeta sobre un soporte del electrodo con un poste de succión, a través del cual la presión dentro del electrodo se puede ajustar empujando o tirando el émbolo de una jeringa de plástico de 10 ml de tubo conectado.
  3. Encuentra la pipeta con arreglo al objetivo y llevarlo hasta ~ 100 m por encima de la retina. Bajo el modo actual seguidor (I = 0), el uso DC offset a cero la señal de tensión de corriente continua de pie. Mida la resistencia de la pipeta bajo la grapa de corriente en modo (I Clamp) mediante la inyección de corrientes de onda cuadrada de amplitud fija a través de la pipeta mientras está en el baño y neutralizar la diferencia girando el mando rAccede. Utilice la lectura en el pomo rAccede para calcular la resistencia de la pipeta por la ley de Ohm.
  4. Poco a poco llevar el electrodo de ~ 10 m por encima de la retina. Aplicar presión positiva al electrodo. Ver el cambio de la reflexión cerca de la punta de la pipeta cuando se aproxima a la retina. Rápidamente, pero forzar suavemente la pipeta en el GCL y reducir el pressu positivovolver inmediatamente.
  5. Mover la pipeta hacia una neurona marcada. Evitar el contacto con otras neuronas, vasos sanguíneos y endfeet de células de Muller. Aplique presión más positiva si es necesario para evitar la obstrucción del electrodo.
  6. Coloque la punta de la pipeta cerca de la línea media de una neurona marcada hasta un hoyuelo es visible. Liberar la presión positiva y permitir que la membrana plasmática para rebotar de nuevo en la punta de la pipeta.
  7. Aplicar 20 a 120 pA corrientes negativas a la pipeta para ayudar a la formación de un sello giga-ohm. Aplicar una succión suave si es necesario tirar de la membrana plasmática en la pipeta. Esperar 5 min después de la formación del sello a la ruptura de la membrana celular. Esto permite que la solución interna derramado a que se solucione mediante superfusión. Romper la membrana por una suave succión.
  8. Después de la ruptura de la membrana y en el modo de fijación de corriente, cambiar el equilibrio del puente y ajustar con el mando rAccede.
    NOTA: Para una pequeña celda como el SAC, sólo es necesario un ligero ajuste, en su caso. Alterntivamente, ficha excitatoria y inhibitoria postsináptica corrientes en el modo de fijación de voltaje (V Clamp) por la celebración de la célula en los potenciales de inversión de cloruro (alrededor de -75 mV) y glutamato (en torno a 0 mV), respectivamente. Comprobar y ajustar la posición de la pipeta si es necesario para dar cabida a la retina ocasional y / o la deriva micromanipulador.
  9. Para grabar el potencial de membrana o cambio de corriente antes, durante y después del tratamiento farmacológico, preparar bloqueadores sinápticas (por ejemplo, CNQX, AP5, picrotoxina, tubocurarina, etc.) y moduladores del canal (por ejemplo, flupirtina, dopamina, ácido meclofenámico, etc.) fresca en el día del experimento de las existencias congeladas. Diluir los fármacos con solución de Ringer carbogenated. Aplicarlos de manera lotes a través de la perfusión.
  10. Después de la grabación, eliminar suavemente la pipeta del soma. Transferir el conjunto de la cámara a un plato limpio. Desconecte y vuelva a colocar la retina en otra membrana de nitrocelulosa aplanado y sin hol perforadaes para asegurar la planitud retina durante la fijación.
  11. Fijar la retina por inmersión en paraformaldehído al 4% durante 30 min a RT. Retire la retina de la membrana de nitrocelulosa y enjuagarlo extensamente con PBS 1x. Revelar la morfología de las células registradas por O tinción / N con estreptavidina conjugada con colorante diluido en 1x PBS con 0,4% de Triton X-100 a 4 ° C 14. Montar la retina en un medio antifade y observar las células grabados utilizando un microscopio confocal de barrido.
    NOTA: Los procedimientos que implican paraformaldehído, que es volátil y tóxico, deben llevarse a cabo en un proyecto de la cámara de seguridad.

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Resultados

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Grabaciones representativas de dentro y fuera de tipo ZEC de una retina del ratón deafferentated se muestran en la Figura 1. Células colinérgicas en tanto GCL y INL se pueden identificar de forma fiable mediante fluorescencia tdTomato y específicas para la grabación de células enteras patch clamp bajo DIC (Figura 1A) para revelar la oscilación de sus potenciales de membrana (Top trazas) y las corrientes sinápticas que la impulsan (trazas de fondo,

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Discusión

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Muchos laboratorios han registrado desde las neuronas GCL en la preparación 15-18 plana de montaje, pero nuestros procedimientos permiten la grabación de las neuronas de la INL. Por la presente hacemos hincapié en varios pasos que son críticos para las grabaciones de rutina con éxito.

La frescura y planeidad de la retina son importantes para penetrar en él con una pipeta de grabación. En este sentido, la firma de la unión de la retina a la membrana de nitrocelulosa perforado es de...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Joung Jang y Xin Guan por su asistencia técnica. Agradecemos al Dr. Rory McQuiston de la Universidad de la Commonwealth de Virginia por establecer nuestro primer equipo de abrazadera de parche y por asesorarnos sobre los procedimientos experimentales. Agradecemos al Dr. Samuel Wu por sus sugerencias sobre el registro de pinzas de voltaje. El trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de los NIH EY013811, EY022228 y un EY002520 de subvenciones de Vision Core. C-KC es la cátedra de la Fundación Alice R. McPherson para la Investigación de la Retina en el Baylor College of Medicine.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio fluorescente de platina fija con micromanipuladores DICOlympusBX51-WI
SutterMP-225
Amplificador de pinza de parcheA-MAM2400
Convertidor ADNational InstrumentNI-USB-6221
Controlador de calefacciónWarner InstrumentTC-324B
En línea calentadorWarner InstrumentSC-20
Bomba peristálticaRaininDynamax
extractor de pipetasSutter InstrumentP-1000
Tubo de vidrio con filamentoKing Precision GlassEstimulador personalizado
A.M.P.I.Master-8
BiocytinSigmaB4261
NaClSigmaS6191
KClSigmaP5405
NaHCO3FisherBP328-1
Na2HPO4SigmaS0876
Na2HPO4SigmaS5011
CaCl2SigmaC5670
MgSO4SigmaM1880
D-glucosaSigmaG6152
K-gluconatoSigmaG4500
ATP-MgSigmaA9187
Li-GTPSigmaG5884
EGTASigmaE0396
HEPESSigmaH4034
KOHSigmaP5958
Cs-metanosulfonatoSigmaC1426
CsOHSigma232041
Filtro de jeringaNalgene171
Jeringa de 1 mlRainin
10 μ l punta de pipetaGenesee Scientific24-130RL
Streptavidin-488ThermoFisherS-11223
10x PBSLonza17-517Q
Sistema 17013002

Referencias

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