Un modelo agudo de retina para evaluar sanguíneos de la retina barrera violación, así como potenciales fármacos para el tratamiento

Resumen

Un bajo costo, se establece un sistema fácil de usar y potente para evaluar posibles tratamientos que podrían aminorar incumplimiento barrera sangre retiniana inducida por la histamina. fuga de los vasos sanguíneos, la activación de células Müller y la continuidad de los procesos neuronales se utilizan para evaluar la respuesta al daño y su inversión con un fármaco potencial, la lipoxina A4.

Resumen

Se establece un sistema modelo de bajo costo, fácil de usar y potente para evaluar posibles tratamientos que podrían mejorar la ruptura de la barrera de la retina sanguínea. Se ha demostrado que un factor inflamatorio, la histamina, compromete la integridad de los vasos en la retina cultivada a través de la tinción positiva de IgG fuera de los vasos sanguíneos. Los efectos de la propia histamina y los de los fármacos candidatos a posibles tratamientos, como la lipoxina A4, se evalúan utilizando tres parámetros: fuga de vasos sanguíneos mediante inmunotinción con IgG, activación de las células de Müller mediante tinción con GFAP y cambio en las dendritas neuronales mediante la tinción para MAP2. Además, la organización en capas de la retina permite un análisis detallado de los procesos de las células de Müller y ganglionares, como los cambios de anchura y continuidad. Si bien los datos presentados son con cultivo de retina porcina, el sistema es aplicable a múltiples especies. Por lo tanto, el modelo proporciona una herramienta fiable para investigar los efectos tempranos de la integridad comprometida de los vasos de la retina en diferentes tipos de células y también para evaluar posibles candidatos a fármacos para el tratamiento.

Introducción

Un creciente cuerpo de evidencia apoya la existencia de la barrera sangre de la retina (BRB) ^1-5 y su similitud con la barrera hematoencefálica (BBB) ^​​6,7. Compromiso de la BBB ha sido estrechamente vinculada causalmente o como un marcador de diagnóstico para enfermedades neurodegenerativas crónicas tales como la enfermedad de Alzheimer (AD) ^8,9 y agudas condiciones tales como delirio ^10. conocimientos mecánicos en estas patologías y descubrimientos de los posibles objetivos farmacológicos generalmente se ven obstaculizados por la accesibilidad y la red limitada complejidad del cerebro. Se han generado alternativas tales c....

Protocolo

Todos los protocolos se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en su caso.

1. Preparación

1. Preparar los medios de estabilización con 75% de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 25% solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Mezclar bien, alícuota y se almacena a -20 ° C hasta su uso.
2. Preparar el tampón fosfato salino (PBS) y esterilizar en autoclave. Almacenar la solución a temperatura ambiente. Calentar la PBS a 37 ° C antes del experimento (5 ml por pocillo).
3. Preparar 10%, 20% y 30% de sacarosa en PBS. Filtrar todas las soluciones individualment....

Resultados

Presentamos un sistema en tiempo eficiente y fácil de usar, de bajo costo para evaluar los tratamientos potenciales que podrían proteger contra la violación BRB inducida por la histamina. IgG se ve limitada dentro de los vasos de la retina de control (Figura 1A), pero se escapa de los vasos sanguíneos tras la exposición histamina (Figura 1B), lo que confirma que el modelo se ha establecido correctamente.

Discusión

En este informe, presentamos un poderoso modelo retiniano agudo ex vivo de disfunción BRB utilizando la retina porcina. Este sistema modelo no requiere instrumentos especiales y se puede adaptar fácilmente en la mayoría de los entornos de laboratorio. Sin embargo, para obtener un resultado exitoso, varios pasos requieren mucha atención. Después de obtener los globos oculares de la fuente, deben mantenerse a 4 °C o en hielo y procesarse lo antes posible. Cuando se analiza el efecto de un tratamiento, se deben usa.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Tecnologías de Vida	11965-092
HBSS	Life Technologies	14170-112
Sacarosa	J.T.Baker	4072-05
Histamina	Sigma	H7125-1G
Penicilina-Estreptomicina	Invitrogen
PFA	Electrónica Microscopy Sciences	15710
Medios de congelación	Triángulo Ciencias Biomédicas	TFM-5
Suero de cabra normal	Rockland	D104-00-0050
Triton X-100	Sigma	T8787
GFAP Anticuerpo	Millipore	AB5804
MAP2 Anticuerpo	EMD Millipore	MAB3418
FITC burro conjugado anti-conejo IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.	711-095-152
Cy3 Conjugado Burro anti-ratón IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.	715-165-150
medio de montaje que contiene DAPI	Vector Laboratories, Inc.	H-1200
Microscopio Confocal Láser	Nikon	Eclipse Ti Microscopio
ImageJ	Institutos Nacionales de Salud	1.45s