Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Un modelo agudo de retina para evaluar sanguíneos de la retina barrera violación, así como potenciales fármacos para el tratamiento

6.7K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/54619

⸱

13 de septiembre de 2016

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rowan University, 2Department of Cell Biology, Rowan University School of Osteopathic Medicine

En este artículo

Resumen

Un bajo costo, se establece un sistema fácil de usar y potente para evaluar posibles tratamientos que podrían aminorar incumplimiento barrera sangre retiniana inducida por la histamina. fuga de los vasos sanguíneos, la activación de células Müller y la continuidad de los procesos neuronales se utilizan para evaluar la respuesta al daño y su inversión con un fármaco potencial, la lipoxina A4.

Resumen

Se establece un sistema modelo de bajo costo, fácil de usar y potente para evaluar posibles tratamientos que podrían mejorar la ruptura de la barrera de la retina sanguínea. Se ha demostrado que un factor inflamatorio, la histamina, compromete la integridad de los vasos en la retina cultivada a través de la tinción positiva de IgG fuera de los vasos sanguíneos. Los efectos de la propia histamina y los de los fármacos candidatos a posibles tratamientos, como la lipoxina A4, se evalúan utilizando tres parámetros: fuga de vasos sanguíneos mediante inmunotinción con IgG, activación de las células de Müller mediante tinción con GFAP y cambio en las dendritas neuronales mediante la tinción para MAP2. Además, la organización en capas de la retina permite un análisis detallado de los procesos de las células de Müller y ganglionares, como los cambios de anchura y continuidad. Si bien los datos presentados son con cultivo de retina porcina, el sistema es aplicable a múltiples especies. Por lo tanto, el modelo proporciona una herramienta fiable para investigar los efectos tempranos de la integridad comprometida de los vasos de la retina en diferentes tipos de células y también para evaluar posibles candidatos a fármacos para el tratamiento.

Introducción

Un creciente cuerpo de evidencia apoya la existencia de la barrera sangre de la retina (BRB) 1-5 y su similitud con la barrera hematoencefálica (BBB) ​​6,7. Compromiso de la BBB ha sido estrechamente vinculada causalmente o como un marcador de diagnóstico para enfermedades neurodegenerativas crónicas tales como la enfermedad de Alzheimer (AD) 8,9 y agudas condiciones tales como delirio 10. conocimientos mecánicos en estas patologías y descubrimientos de los posibles objetivos farmacológicos generalmente se ven obstaculizados por la accesibilidad y la red limitada complejidad del cerebro. Se han generado alternativas tales como imágenes in vivo 11, la cultura organotípicos cerebral 12, cultivos celulares primarios 13,14 y sistemas de co-cultivo 15. Sin embargo, la mayoría de estos modelos requieren instrumentos especiales, los períodos experimentales largos o múltiples marcadores para identificar las células. similitudes funcionales y estructurales entre BBB y BRB, así como una correlación entre la dysfunctions de los dos se han argumentado 16-19. Además, el acceso más fácil, tipos de células bien definidas y una estructura en capas han permitido a la retina bien caracterizado como una ventana al cerebro. Las identidades estructurales y funcionales de la BBB y BRB aún no se han comparado en detalle. Sin embargo, las patologías de la retina, especialmente la violación BRB, también han sido estrechamente asociado con la progresión de diversas enfermedades, incluyendo la diabetes 18-19 y 21,22 AD. Por lo tanto, es de interés para establecer un sistema de disfunción BRB no sólo para delinear el mecanismo, pero también para cribar fármacos potenciales. En este informe, un protocolo que permite la disfunción BRB mediante un sencillo cultura retiniana aguda es desarrollado y presentado.

Aumento de la permeabilidad de la BHE y cambios patológicos AD-como se han establecido en una cultura organotípicos cerebro se incubaron con histamina, un mediador proinflamatorio 12. Por lo tanto, en el sistema presentado, la histamina era applIED hasta el cultivo ex vivo para inducir la disfunción retiniana BRB. Las retinas de varias especies, tales como Mus musculus y Bos Taurus, han sido probados. Debido a su disponibilidad comercial y semejanza con el tejido humano, se utilizaron ojos porcinos frescos para proporcionar los datos aquí presentados. Después de incubar con la histamina y / o otras drogas, las retinas se procesaron para su evaluación por la inmunotinción para varias proteínas de 12, tales como la inmunoglobulina G (IgG), uno de los principales componentes de la sangre; proteína ácida glial fibrilar (GFAP), un marcador conocido para la activación glial; y la proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2), una proteína del citoesqueleto neuronal específica esencial para el ensamblaje de los microtúbulos. Además, la estructura en capas de la retina permite un análisis detallado de los procesos de las células de Müller y células ganglionares, tales como cambios en su anchura y continuidad. Por lo tanto varios parámetros adicionales están disponibles para evaluar las consecuencias de laBRB incumplimiento en una etapa temprana y para evaluar los efectos de reversión de tratamientos potenciales.

En este protocolo, los posibles efectos de reversión de los fármacos seleccionados se evalúan desde tres perspectivas: la fuga de los vasos sanguíneos (BVS), la activación de células gliales y el daño de respuesta de las células neuronales. Se utilizan varios métodos de cuantificación, por ejemplo, el nivel de expresión se muestra por la intensidad de la inmunotinción, la medición de la anchura de un proceso y la continuidad de los procesos neuronales se muestra por un filtro de mejora. Para ilustrar mejor el método y para ayudar a interpretar los resultados, la lipoxina A4 (LXA4), un compuesto sintetizado de forma endógena en respuesta a una lesión inflamatoria y atenuar la disfunción endotelial 23, ha sido elegido con fines de demostración.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los protocolos se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en su caso.

1. Preparación

  1. Preparar los medios de estabilización con 75% de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 25% solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Mezclar bien, alícuota y se almacena a -20 ° C hasta su uso.
  2. Preparar el tampón fosfato salino (PBS) y esterilizar en autoclave. Almacenar la solución a temperatura ambiente. Calentar la PBS a 37 ° C antes del experimento (5 ml por pocillo).
  3. Preparar 10%, 20% y 30% de sacarosa en PBS. Filtrar todas las soluciones individualmente más de 0,22 micras separadas filtros para la esterilización. Guardar las soluciones a 4 ° C.
  4. Preparar la solución de histamina de valores en PBS a una concentración de 90 mM. Esterilizar la solución por filtración a través de un filtro de 0,22 mM. Alícuota y se puede guardar la solución a -80 ° C. Evitar ciclos de congelación-descongelación y-.
  5. Hacer fresco 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS antes del experimento. Colocarlo sobre hielo.
    Precaución: Mantenga PFA en una campana de humos y llevar equipo de protección apropiado.
  6. Descongelar el medio de estabilización (20 ml por la retina). Añadir penicilina-estreptomicina a una concentración final de 100 U / ml. parte caliente del medio (15 ml por retina) a 37 ° C en incubadora antes del experimento. Deje el resto del medio en el hielo.
  7. Coloque el HBSS (10 ml por la retina) en hielo.

2. Retina Organotípicos Cultura

  1. Transferir las muestras a una campana de cultivo de tejido. Abra la tapa del ocular al cortar alrededor de la lente. El uso de un cepillo, retire con cuidado el humor vítreo sin tirar de la retina. desprender suavemente la retina desde el borde de corte con un cepillo para exponer el disco óptico. Severa del nervio óptico con una navaja y suelte la retina.
  2. La transferencia de la retina en una placa de Petri y enjuagar cuidadosamente la retina una vez usando HBSS frío. Colocar la muestra en HBSS en ice. Diseccionar tantos retinas a cabo según sea necesario repitiendo el paso 2.1 y este paso.
  3. Cortar la retina en medio simétricamente con una navaja de afeitar. transferir suavemente las muestras a una placa de 6 pocillos con 3 ml de medio de estabilización por pocillo. Permitir el equilibrio durante 30 min a 37 ° C en una incubadora con la atmósfera que contiene 5% de CO 2.
  4. Preparar los siguientes reactivos durante la incubación a Paso 2.3: Diluir la solución de histamina de valores para la concentración deseada (450 mM) en un medio caliente. Disolver LXA4 (almacenado en atmósfera de argón) en el medio a una concentración final de 250 ng / ml.
    NOTA: Cuando se mide el efecto de LXA4, una media de un solo retina se usa para la histamina sola, mientras que el otro medio se utiliza para la histamina con LXA4.
  5. Aspirar el medio de estabilización con cuidado y añadir el medio preparado a cada pocillo (3 ml por pocillo). Se incuban las muestras a 37 ° C durante 1 hora en una incubadora con la atmósfera que contiene 5% de CO 2.
  6. enjuague elmuestras una vez en caliente, PBS estéril.

3. Preparar las muestras para inmunotinción

  1. Aspirar PBS de las placas. Añadir 4% PFA (3 ml por pocillo) y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
  2. aspirar rápidamente la PFA. Enjuague las muestras una vez utilizando PBS. Transferir las muestras a 10% de sacarosa (5 ml por pocillo) y se incuba durante 2 a 4 horas a 4 ° C.
  3. Transferir las muestras a un 30% de sacarosa (5 ml por pocillo) y se incuba durante la noche a 4 ° C. Mezclar una parte del medio de congelación comercial con dos partes de 20% de sacarosa para hacer que el medio de congelación de trabajo. Dejarlo a 4 ° C durante la noche o más tiempo hasta que el aire burbujas desaparecen.
  4. Transferir las muestras al medio de congelación de trabajo y permitir el equilibrio durante 5 min a temperatura ambiente. Recorte cada retina en rectángulos (aproximadamente 3 mm por 5 mm).
  5. Transferir cuidadosamente las muestras en el medio de congelación de trabajo contenido en un recipiente cilíndrico (aproximadamente 1 cm de altura x 2 cm de radio) devzada de papel de aluminio. Asegúrese de que las rebanadas de retina son verticales (orientado para proporcionar una sección transversal de la retina al corte) y congelarlos en nitrógeno líquido. Guarde los bloques a -80 ° C hasta su uso.
  6. Sección cada bloque en un criostato a 14 micras rodajas gruesas y montar las secciones sobre portaobjetos de vidrio. Almacenar las diapositivas a -80 ° C hasta su uso.

4. La inmunotinción

  1. Se lavan las secciones con tampón de 5% de fosfato de sacarosa (SPB, 5% de sacarosa en PBS, pH 7,4) una vez. Bloquear los sitios de unión no específica mediante la incubación de las secciones en tampón de bloqueo (5% SPB con 10% de suero normal de cabra y 0.5% de Triton X-100) durante 1 hora a temperatura ambiente.
  2. Incubar las secciones (en las diapositivas) con el anticuerpo primario apropiado (GFAP o MAP2, diluido a 1: 500 en tampón de bloqueo) durante 1 hr. Aspirar la solución. Lavar tres veces en 5% SPB. Para la tinción de la IgG endógena, omita este paso.
  3. Se incuban las secciones con la segunda correspondeanticuerpos dary (Cyanine3 / FITC burro conjugado IgG anti-ratón / anti-conejo, diluido a 1: 800 en el tampón de bloqueo) durante 1 hr.
  4. Lavar las secciones a fondo con 5% SPB tres veces. Preparar las muestras para microscopía montándolos en el montaje de un medio que contenía DAPI y cubrir con cubreobjetos.
  5. El uso de un microscopio confocal, capturar imágenes láser a través de una lente de 20X bajo parámetros idénticos, tales como la intensidad del láser, valor de ganancia, tiempo de permanencia, etc. a través de grupos. Establecer las longitudes de onda de excitación / emisión para el canal azul (para detectar DAPI) como 408/447 nm, para el canal rojo (para detectar Cyanine3) como 561/785 nm y para el canal verde (para detectar FITC) como 488/525 nm .

Análisis 5. Imagen

  1. Cuantificar el porcentaje de los vasos sanguíneos que gotean de acuerdo con los siguientes criterios 12: Incluir sólo los vasos sanguíneos con núcleos de células endoteliales dentro del plano de la sección en el conteo; considerar un vaso sanguíneo con fugas si muestra agradient de inmunotinción que rodea el buque.
  2. Para determinar el nivel de expresión, seleccionar regiones de interés y medir el valor de gris medio utilizando el software de análisis de imágenes.
  3. Para medir la anchura del proceso, elegir un área de la sección en la que los procesos son distintos (la capa exterior nuclear, ONL, por ejemplo). A continuación, seleccione un campo óptico cuando dichos procesos son visibles y continua. Ajuste la barra de escala de acuerdo a la configuración microscópica, dibujar una línea a lo largo del proceso y realizar la medición.
  4. Para analizar la continuidad del proceso, seleccione las regiones de interés, se aplican el filtro llamado varianza que mejora los bordes de la imagen mediante la sustitución de cada píxel con su varianza barrio, ajustar automáticamente el contraste y el brillo, contar las líneas y normalizar el recuento por el zona.
  5. Calcula significaciones estadísticas usando la prueba t de Student de dos colas. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001. PAGmucho el resultado como media ± SEM.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Presentamos un sistema en tiempo eficiente y fácil de usar, de bajo costo para evaluar los tratamientos potenciales que podrían proteger contra la violación BRB inducida por la histamina. IgG se ve limitada dentro de los vasos de la retina de control (Figura 1A), pero se escapa de los vasos sanguíneos tras la exposición histamina (Figura 1B), lo que confirma que el modelo se ha establecido correctamente.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

En este informe, presentamos un poderoso modelo retiniano agudo ex vivo de disfunción BRB utilizando la retina porcina. Este sistema modelo no requiere instrumentos especiales y se puede adaptar fácilmente en la mayoría de los entornos de laboratorio. Sin embargo, para obtener un resultado exitoso, varios pasos requieren mucha atención. Después de obtener los globos oculares de la fuente, deben mantenerse a 4 °C o en hielo y procesarse lo antes posible. Cuando se analiza el efecto de un tratamiento, se deben usa...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Bringhurst Meats (Berlin, NJ) es reconocido por su genuina ayuda en el suministro de globos oculares para cerdos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMTecnologías de Vida 11965-092
HBSSLife Technologies 14170-112
SacarosaJ.T.Baker4072-05
Histamina SigmaH7125-1G
Penicilina-Estreptomicina Invitrogen
PFAElectrónica Microscopy Sciences15710
Medios de congelación Triángulo Ciencias BiomédicasTFM-5
Suero de cabra normal RocklandD104-00-0050
Triton X-100SigmaT8787
GFAP AnticuerpoMilliporeAB5804
MAP2 AnticuerpoEMD MilliporeMAB3418
FITC burro conjugado anti-conejo IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-095-152
Cy3 Conjugado Burro anti-ratón IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.715-165-150
medio de montaje que contiene DAPIVector Laboratories, Inc.H-1200
Microscopio Confocal LáserNikonEclipse Ti Microscopio
ImageJInstitutos Nacionales de Salud1.45s

Referencias

  1. Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3(2011).
  2. Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
  3. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
  4. Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
  5. Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
  6. Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782(2013).
  7. Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
  8. Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
  9. Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
  10. Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10(2015).
  11. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
  12. Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148(2015).
  13. Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188(2014).
  14. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33(2013).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
  17. Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
  18. Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
  19. Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202(2011).
  20. Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
  21. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
  22. Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055(2010).
  23. Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
  24. Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
  25. Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Tratamiento con histaminaLipoxina A4inmunotinci n de IgGtinci n de GFAPtinci n de MAP2microscop a confocalcultivo ex vivocribado de f rmacos
Un modelo agudo de retina para evaluar sanguíneos de la retina barrera violación, así como potenciales fármacos para el tratamiento
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.