Adquisición rápida de imágenes en 3D de alta resolución Usando Episcópico Microscopía

Resumen

Describimos un protocolo detallado que utiliza microscopía episcópica de alta resolución para adquirir imágenes tridimensionales (3D) de embriones de ratón. Este protocolo mejorado utiliza un método de preparación de tejido modificado para mejorar la penetración del tinte fluorescente, lo que permite el análisis morfométrico de muestras de tamaño pequeño y grande.

Resumen

La tecnología de microscopía episcópica de alta resolución (HREM) permite la adquisición rápida de datos morfométricos digitales volumétricos y tridimensionales (3D) de alta resolución. Aquí, describimos el protocolo detallado para obtener imágenes de todo el embrión de ratón. El protocolo consta de cuatro secciones principales: preparación de muestras, incrustación, adquisición de imágenes y, por último, visualización en 3D. La tecnología requiere que las muestras se tiñan con un tinte fluorescente, lo que puede ser problemático para muestras grandes o densas. Para superar esta limitación, hemos mejorado el protocolo existente para mejorar la penetración del colorante en los tejidos mediante el tratamiento previo de la muestra con una solución que contiene urea y dodecil sulfato de sodio. El protocolo utiliza solo equipos y reactivos de laboratorio de rutina para una fácil adaptación en entornos de laboratorio estándar. Demostramos que las imágenes 3D de alta resolución resultantes recapitulan fielmente las características morfológicas detalladas de los órganos internos de los embriones de ratón, lo que permite realizar análisis morfométricos. Juntos, presentamos un protocolo detallado y mejorado que utiliza equipos de laboratorio estándar para adquirir imágenes 3D de alta resolución de muestras de tamaño pequeño y grande.

Introducción

El advenimiento de las tecnologías de imagen 3D ha abierto la posibilidad de un análisis sistémico de características morfológicas detalladas durante el desarrollo fetal. En la actualidad se dispone de una variedad de modalidades de obtención de imágenes en 3D, como la resonancia magnética micromagnética (micro-RMN), la microtomografía computarizada, la ecografía de alta frecuencia, la tomografía de coherencia óptica, la tomografía óptica de proyectos y la microscopía episcópica^1-4. Cada modalidad tiene sus propias características únicas en resolución, contraste, velocidad, costo, capacidad en el útero y disponibilidad.

La captura de imágenes de fluorescencia episcópica (EFIC) y la microscopía episcópica de alta resolución (HREM) son métodos de obtención de imágenes de microscopía episcópica⁴. Aquí, las imágenes en serie de alta resolución se capturan continuamente desde la cara del bloque en lugar de secciones de tejido. Las imágenes resultantes reflejan fielmente las características morfológicas detalladas con una distorsión mínima o nula del tejido. Los datos volumétricos adquiridos se convierten fácilmente en imágenes 3D de alta resolución adecuadas para un análisis morfométrico preciso. Debido a su relativo bajo costo y alta resolución, HREM y EPIC se han convertido en las alternativas superiores para la evaluación sistémica de modelos de ratón de defectos congénitos humanos^2,4-8.

Tanto los métodos EFIC como los HREM requieren que las muestras se incrusten en el medio adecuado. EFIC detecta la autofluorescencia emitida por el tejido incrustado. Debido a esto, se limita a los especímenes que emiten altos niveles de autofluorescencia, pero no a aquellos con una autofluorescencia relativamente débil, como los embriones en etapas tempranas⁹. Para superar la dependencia de la autofluorescencia, las muestras se tiñen con un tinte fluorescente como la eosina para la obtención de imágenes HREM. La elección de los colorantes y los métodos de tinción también hacen que la HREM sea más compatible para detectar señales moleculares en el contexto de la arquitectura y la morfología de los tejidos^4,10.

En este artículo, presentamos un protocolo HREM mejorado adecuado para la evaluación de cuerpo entero de embriones de ratón en etapa tardía. Para facilitar la tinción, incluimos un paso de pretratamiento para aumentar la penetración en el tejido, lo que permite la obtención de imágenes HREM de embriones de ratón más viejos.

Protocolo

Todos los usos de animales son aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Hospital Infantil de Boston.

1. Preparación de muestras

1. apareamiento sincronizado
   1. Coloque una C57Bl6 tipo salvaje macho y una hembra juntos en la misma jaula.
   2. Comprobar la formación de un tapón de apareamiento mañana siguiente temprano. La clavija de acoplamiento (aka, la vagina o el enchufe de la cópula) es una deposición gelatinosa endurecida que bloquea la vagina.
   3. Ajuste la fecha enchufe como el día embrionario 0,5 (E0.5).
2. El aislamiento de los embriones de ratón
   1. La eutanasia a las mujeres embarazadas por asfixia con _CO2.
   2. Ponga los ratones en posición supina sobre una almohadilla absorbente y rociar región abdominal con un 70% de etanol.
   3. Levantar la piel y hacer una incisión de 5 mm inicial en la región abdominal caudal utilizando tijeras quirúrgicas. Cortar y quitar la piel abdominal para exponer completamente los órganos internos
   4. Cortar cerca de Vagina para extirpar todo el útero.
   5. Cortar entre sitios de implantación a lo largo de la trompa uterina. Cada segmento o producto de la concepción deben tener un solo embrión en su interior.
   6. Mantener los segmentos uterinos en solución salina 1x helada tamponada con fosfato (PBS).
3. la disección de embriones
   1. Coloque cada embrión en un plato aparte con helado de PBS en un estereoscopio.
   2. Retire los tejidos uterinos, la placenta y luego las membranas fetales utilizando secuencialmente pinza de disección finas.
   3. Transferir el embrión diseccionado a un tubo de 50 ml con 1x PBS enfriado con hielo usando un gran pipeta de transferencia. Evitar la captación de embriones directamente con fórceps para minimizar el daño tisular.
4. Fijación
   1. Fijar los embriones disecados en solución de formalina tamponada neutra al 10% a 4 ° C durante más de 24 horas con al menos 10 volúmenes de muestra de fijador.
5. El pretratamiento
   1. Preparar la solución clarificadora: 4M urea, 10% de glicerol, 4% dodecil sulfato de sodio (SDS) en agua bidestilada.
   2. Vuelva a colocar el fijador con la Solución de Compensación.
   3. gire suavemente la muestra sobre un balancín a temperatura ambiente durante 1 - 2 semanas. Intercambiar la solución de aclarado una vez en el segundo y el tercer día. El espécimen se convierte poco a poco clara y translúcida.
   4. Vuelva a colocar la solución de aclaramiento con formalina al 10% y dejar en un agitador durante 2 días.
6. Deshidración
   1. Se lavan las muestras pretratadas con 1 x PBS 3 veces durante 5 minutos cada uno.
   2. Deshidratar las muestras en una serie ascendente de etanol a temperatura ambiente en un agitador suave. Para los embriones E15.5, utilizar una serie de etanol ascendente incluyendo 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% y 100% de etanol, 2 hr cada paso. Para los embriones de más edad, el tiempo de incubación debe ser aumentado.
7. tinción
   1. Preparar la solución de tinción: añadir 0.1375 gramos de eosina Y sal disódica y 0,0275 gramos de naranja de acridina hemi (cloruro de zinc) de sal a 50 ml de etanol al 100%. Se agita durante 2 hr. Filtro con un papel de filtro. Almacenar a temperatura ambiente y evitar la luz cubriendo con papel de aluminio.
   2. Transferir la muestra a la solución de tinción durante 1 hora.
   3. Reemplazar con solución de tinción durante la noche fresca y mancha.
8. Infiltración
   1. Preparar solución de infiltración: combinar 100 ml de solución A de JB-4 kit incrustación, 1,25 g de catalizador C, 0.275 g de eosina Y sal disódica y 0,055 g de naranja de acridina hemi (cloruro de zinc) sal. Revuelva para mezclar (200 rpm) en un cubo de hielo durante 2 horas, y luego filtrar con papel de filtro.
   2. Almacenar la solución de infiltración a 4 ° C y evitar la luz cubriendo con papel de aluminio.
   3. La transferencia de los embriones a la infiltración de soluciones: solución de tinción (1: 1), y se incuba durante al menos 3 horas en un puente a 4 ° C.
   4. La transferencia de los embriones a la infiltración de soluciones e incubar durante 3 hr en un agitador en una habitación fría.
   5. Reemplazar solución de infiltración una vez al día, y dejar en un cuarto frío en un agitador suave durante tres días más.

2. Incorporación

1. Mantenga la solución B y la solución de infiltración en el hielo.
2. Hacer Solución incrustación (1:25 de la solución B y la solución de infiltración) inmediatamente antes de la incrustación.
3. Orientar el espécimen en un molde de inclusión, a continuación, vierta la solución incrustación fría en el molde de inclusión con suavidad. Vuelva a orientar con un alfiler, si es necesario.
4. Use un alfiler para examinar si la solución de incrustación se solidifica. Empuje a cabo primero la muestra, y el ajuste si es necesario.
5. Reorientar primero la muestra usando el molde separado para obtener una orientación transversal.
6. Poner un soporte de bloque en la parte superior del molde de inclusión. Vierta suavemente la solución incrustación en el molde hasta que el molde y el soporte del bloque están sumergidos mediante la incorporación de soluciones.
7. Mantenga la muestra en un recipiente secundario y dejarloen hielo durante 3 - 4 horas en una campana de humos.
8. Almacenar las muestras solidificadas en un 4 ° C.
9. Despegar el molde de inclusión. Ponga el bloque bajo el microscopio estereoscópico con iluminación oblicua a la posición de la muestra en el bloque de inspeccionar. En la cara del bloque, las líneas de cuadrícula en Todo el espécimen.
10. Recortar el bloque para eliminar el acceso cantidad de material aglomerante usando las líneas de la cuadrícula marcados como referencias.

3. Adquisición de imágenes

1. Colocar primero la muestra para el microtomo y obtener una superficie recién cortada. Establecer espesor de corte (por ejemplo, e9.5-10.5, 1,5 micras; e11.5-12.5, 2,0 micras; e13.5-15.5, 2,5 micras; E16.5-mayores, 3 M). Mantenga la muestra / de bloques en la posición inicial del microtomo.
2. Montar el microscopio estéreo con zoom horizontalmente hacia la superficie del bloque de la muestra.
3. Encienda el ordenador y el microscopio, y ejecutar el software de adquisición de imágenes.
4. Visualizar y enfocar la óptica al bloque carabajo la modalidad de "visualización en vivo" de software de imágenes.
5. Alinear microscopio y micrótomo si es necesario de modo que el bloque de cara está en el centro de visor.
6. Ajuste el zoom de modo que el bloque entero cara está dentro del visor.
7. Seleccione la proteína fluorescente (GFP) filtro verde (excitación 470 ± 20 nm, dicroico 495 nm, emisión 525 ± 25 nm) y reorientar, si es necesario.
8. Medir y ajustar el tiempo de exposición manualmente (por ejemplo, el 80 - 400 mini-seg).
9. Adquirir imágenes del bloque de cara después de cada corte fresco y guardar las imágenes automáticamente, si es posible.
10. parámetros importantes de registro incluida la resolución, el espesor de la sección y el zoom.
11. Después de terminar la totalidad de la muestra, la exportación y convertir todos los archivos de imagen a formato JPEG si es necesario.
12. Invertir todas las imágenes originales usando un software de procesamiento de imágenes y ajustar el brillo y el contraste.
13. Guardar todas las imágenes procesadas en una carpeta separada.

4. 3DVisualización

1. Sube todas las imágenes procesadas a un software de visualización 3D siguiendo las instrucciones.
2. Resolución de entrada y espesor de corte para convertir todas las imágenes en datos volumétricos (es decir, el tamaño del voxel) y guardar el archivo 3D.
3. Alinear todas las imágenes utilizando el modo automático. Ajustar las imágenes individuales de forma manual si es necesario.
4. Guarda la imagen alineada con un nuevo nombre de archivo.
5. Analizar las características morfométricas de la muestra utilizando el software de visualización 3D.

Resultados

Hemos informado imágenes HREM de alta calidad de los embriones de ratón entre E9.5 y E13.5 ^8. La calidad de imagen de los embriones por etapas finales de los años, sin embargo, se ve comprometida de manera significativa debido a la limitada penetración en el tejido de la eosina colorante fluorescente. Para aumentar la eficiencia de la tinción, hemos probado varios métodos de tratamiento previo que son compatibles con imágenes fluorescentes ^11. En concreto, los embri...

Discusión

A continuación, presentamos un protocolo modificado mediante equipos de laboratorio de rutina para adquirir imágenes HREM de serie que son compatibles para la visualización 3D rápida y análisis morfométrico de las estructuras complejas. Debido a que las imágenes de alta resolución se toman directamente de la cara del bloque en lugar de secciones individuales, las características morfológicas finas se conservan y rápidamente reconstruidas digitalmente en un programa de visualización en 3D.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones	The Jackson Laboratory	C57BL6
Alcohol Etílico	Pharmco-Aaper	111000200	200 Proof, Absoluto, ACS/USP/Grado Kosher
Formalina	Sigma	HT501128-4L
Urea	Sigma	U5128	Solución de Limpieza
Glicerol	Fisher scientific	G33-4	Solución
de LimpiezaSulfato de dodecilo sódico	Invitrogen	15525-017	Solución de limpieza
Eosina Y sal disódica	Fisher Solución	infiltración	BP241925
Acridina Naranja de acridina sal de hemi (cloruro de zinc)	Sigma	A6014	Solución de infiltración
Papel Whatman	GE	3030-153
JB-4 Kit de incrustación - Solución A	Polysciences, Inc.	0226A-800	Kit
de incrustación de solución de infiltración JB-4 - Solución B	Polysciences, Inc.	0226B-30	Solución de incrustación
JB-4  Kit de incrustación - Catalyst	Polysciences, Inc.	02618-12	Moldes
de incrustación	Polysciences, Inc.	23185-1	Moldes
de incrustación afilados Peel-A-Way de	Polysciences, Inc.	18986-1 Cuadrado de	22 mm x 22 mm, truncado a 12 mm x 12 mm
JB-4  Soportes de bloques de plástico	Polysciences, Inc.	15899
Tubos de transferencia graduados desechables	VWR	414004-014
Placa de Petrl	VWR	25384-088	Pinzas de disección de embriones
Punta de acero inoxidable	ROBOZ	RS-5015	Disección de embriones
Pinza de tejido Graefep	ROBOZ	RS-5153	Disección de embriones
Tijera de operación delicada	ROBOZ	RS-6700	Disección de embriones
14 ml Tubos de polipropileno de fondo redondo	Falcon	352059
50 ml Tubos cónicos de polipropileno	Falcon	352098
Cubitera	Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml (3.4 onzas) Pesaje de poliestireno antiestático	VWR	89106-766
330 ml (11,2 oz.) Pesaje antiestático de poliestireno	VWR	89106-770
Cloruro de sodio	MP Biomedicals	102892	Solución de PBS
Solución de cloruro de potasio	Sigma	P0662	PBS
Fosfato de potasio monobásico	Sigma	P5405	Solución de PBS
Fosfato de sodio dibásico heptahidratado	Sigma-Aldrich	S9390	Solución de PBS
Cámara digital	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Microtomo	Leica	RM2265
Iluminador	Carl Zeiss	HXP 200C
Microscopio de fluorescencia con zoom estereoscópico	Carl Zeiss	Axio Zoom.V16
	Olympus	SZX16
Fuente de luz de fibra óptica	Leica	KL 1500 LCD
Hoja de micrótomo desechable	VWR	95057-832
Dispensador de un solo filo	Personna	62-0330-0000
ZEN	Carl Zeiss	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira 3D Software	Visage Imaging	5.4
Ordenador	Dell T7600, 2 discos duros SAS de 900 GB y 64 GB de memoria
Vibradores de plataforma oscilante	VWR	40000-304
Agitador de placa caliente estándar	VWR	12365-382
Balanza analítica	Mettler Toledo	AB54-S