Abstract
Стрекающие, и , в частности Hydra, были первыми животными , показанные для регенерации поврежденных или разорванных структур, и действительно такие исследования , возможно , запускаемые современный биологический запрос через работу Трамбле более 250 лет назад. В настоящее время исследование регенерации видел возрождение с использованием как "классические" регенеративные организмы, такие как гидры, планарий и хвостатых, а также расширяющийся спектр видов , охватывающих диапазон от многоклеточных, губок через млекопитающих. Кроме того, ее внутренний интерес как биологическое явление, понимание того, как регенерация работает в различных видах будет информировать нас о том, разделяют регенеративные процессы общие черты и / или видов или контекстно-зависимые клеточные и молекулярные механизмы. Актинии стерлядь, Nematostella vectensis, является новой моделью организма к регенерации. Как Hydra, Nematostella является членом древнего филюма, книдарий, но в тон класс Anthozoa, сестра клады к Нуйгогоа, которая является эволюционно более базальной. Таким образом , аспекты регенерации в Nematostella будет интересно сравнить и сопоставить с теми гидры и других кишечнополостных. В этой статье мы представляем метод Bisect, наблюдать и классифицируют регенерацию аборальной конца взрослого Nematostella, который называется physa. Physa естественным образом подвергается делению как средство бесполого размножения, а также естественное деление или ручной ампутация physa вызывает возобновление роста и реформирование сложных морфологией. Здесь мы кодифицированы эти простые морфологические изменения в системе Staging Nematostella регенерации (The NRSS). Мы используем NRSS, чтобы проверить влияние хлорохин, ингибитор лизосомных функции, которая блокирует аутофагии. Результаты показывают, что регенерация полип структур, в частности мезентериев, ненормально, когда аутофагия ингибируется.
Introduction
Наблюдение регенерации в одной гидры была знаковым событием в биологии появления как экспериментальной науки 1,2. Регенерация остается явление чрезвычайно широкое обращение к биологу и мирянина, так. Потенциал для онтогенетики, клиницистов, биомедицинской ученых и инженеров ткани , чтобы понять и преодолеть ограничения на регенерации человека делает регенерацию биологии более чем внутренне интересно.
Теперь, с использованием новейших технологий, таких как секвенирование генома и усиления и потери функциональных инструментов, поле готова дразнить друг от друга регенеративные механизмы и в конечном счете понять, как различные виды могут регенерировать в то время как другие не могут. Степень общности в молекулярном, клеточном и морфологических реакций еще предстоит выяснить, но до сих пор кажется, что основные реакции среди животных, которые могут регенерировать более похожи, чем был бы томографовНед только десять лет назад 3.
Стрекающие, в частности, являются снисходительный при регенерации почти все их части тела на фоне широкого спектра морфологического разнообразия. Из одиночного полипа пресной воды, Hydra вместе с крошечных морских полипов, которые строят огромные коралловые рифы, до сложных колониальных сифонофор, таких как Португальской Man-O-War, регенерация часто является способом размножения, в дополнение к механизму ремонта или реформирования поврежденных или утраченных частей тела в результате травмы и хищничества. Являются ли различные виды книдарий используют сходные или различные механизмы для регенерации принципиально интересный вопрос 4-6.
Мы, и другие были разработки anthozoan, Nematostella vectensis в качестве модели для регенерации 7-17. Недавно мы разработали систему определения стадии для описания регенерации всего тела от морфологически однородного куска ткани надвое от Aboraл конец полипа 10. В то время как Nematostella полипы могут регенерировать , когда разрезанный на любом уровне, мы решили сократить взрослых на аборальной позиции в наиболее морфологически простого региона, physa, отчасти потому , что это близко к нормальной плоскости естественного бесполого деления 18, а также из - за него наблюдение разрешений и молекулярный анализ того, как все тело повторно собраны от простейших морфологических компонентов.
Балетмейстер система Nematostella Регенерация (NRSS) обеспечивает относительно простой набор морфологических критериев , которые могут быть использованы , чтобы выиграть прогресс любого аспекта регенерации путем ампутированной physa, при нормальных условиях культивирования или экспериментально возмущенных ситуаций , таких как небольшие лечения молекулы, генетических манипуляций или экологического изменения. Как и ожидалось, NRSS становится принята в качестве морфологического помост, на котором можно ссылаться на клеточные и молекулярные события регенерации10.
Наконец наш метод резки производит зияющую дыру на несколько порядков больше , чем контактный точки прокола , используемой в недавнем исследовании 17, но оба раны заживают в течение около 6 часов. Документирование визуально арестовывая и отдельные фазы закрытия раны следует предложить экспериментальные подходы для объяснения кажущейся независимости от размера раны и времени, которое требуется, чтобы закрыть. Таким образом, более глубокое визуальное понимание аборальной процесса ампутации, предусмотренных этим протоколом, будет способствовать дальнейшие исследования в этой системе регенерации модели и расширить применение этой системы с использованием промежуточной Nematostella vectensis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Кондиционер животных для температуры, питания и цикл свет / темнота
- Получить Nematostella vectensis взрослых от одного из многочисленных лабораторий Nematostella по всему миру, или поставщика некоммерческий (таблица 1)
- Поддерживать Nematostella при постоянной температуре (обычно от 18 до 21 ° C) в темноте, в "1 / 3x" Искусственная морская вода (ASW) при солености 12 промилле (п.п.). Поддержание культуры в простых натриево-известкового стекла блюд культуры, как правило , 250 мл или 1,5 л мощностью 11.
Примечание: Эти простые условия культивирования обычно используются среди лабораторий, изучающих Nematostella, но уход культура также может быть автоматизировано 19. - Поток Nematostella свеже вылупившихся артемии науплии 2 - 4 раза в неделю. Hatch цисты артемии в полную силу (36) п.п. или 1 / 3x ASW при 30 ° C, в неглубокой прямоугольной стеклянной посуде 20 или влюбой из ряда небольших масштабах, коммерческих или самодельных артемии инкубаторах. Если инкубатор не доступен, креветки вылупляются при комнатной температуре, но сделать это более медленно.
Примечание: Для этого часто требуется более 24 ч для завершения. - Заменить культуру воды анемона не реже одного раза в неделю. Для лучшего здоровья взрослых, тщательно очистить (без мыла) культуры миски один раз в неделю накопленных слизистых выделений, которые покрывают чашу и может ловушку несъеденная пищевых продуктов и отходов, а также запутать животных.
2. Выбор и релаксация Питательно условных животных
- Выберите размер соответствием полипы приблизительно одинаковой длины (3 - 5 см, когда, естественно, расслаблены) и поместить их в миску, отделенной от колонии в течение трех дней до ампутации.
Примечание: количество животных, отобранных для резки будет определяться экспериментом проводится, конечно, но в целом мы рекомендуем, по крайней мере пять животных на одну точку образца с шестью репликаций. Таким образом,В типичном эксперименте минимум 30 животных будет предварительно выбран. В общем, имеет смысл выбрать более чем минимальное число (30), так как ампутации, которые нерегулярно (см ниже) может впоследствии повлиять на выигрыш. - Удалить блюдо из отобранных животных из инкубатора в комнате свет, по крайней мере за один час до ампутации.
Примечание: Время экспозиции на свету и вибрации обработки, вероятно, приведет животные сокращаться, поэтому они должны быть адаптированы или "смягчены" путем инкубации на лабораторном столе. Животные станут тугоплавкого на ощупь и освещенность, и в этот момент можно перемещать осторожно пипеткой. - Дополнительно: Обезболить животных путем добавления 7,5% MgCl 2 (в 1 / 3x ASW). Осторожно добавьте раствор MgCl 2 в миску со стандартной пластиковой 5 мл пипетки.
Примечание: Хотя животные в конечном счете станет приученный к свету и к физической манипуляции, может быть предпочтительным, чтобы давать наркоз животным для поддержания или "исправить" Tон расслабленном состоянии после того, как они стали удлиненные 16,21,22. - Используйте широкий канал (> 0,5 см), пластик пипетки для передачи (в 1 / 3x ПЛО) пяти животных из бассейна, чтобы отсечь, в нижней части стерильной резки стекла тарелки диаметром 100 мм, содержащей 12 п.п. ASW. Поместите блюдо на сцену стереомикроскопа с переменным увеличением от 10 - 40х.
Примечание: Если животные не были под наркозом и расслабленным для резки, они все еще могут реагировать на прикосновения и стереоскоп освещения и, таким образом, возможно, потребуется несколько минут, чтобы стать расслабленным снова.
3. Ампутация
- Использование стерильным скальпелем, ампутацию аборальном physa от каждого полипа, с целью получить участок physa, который приблизительно до тех пор, как он широкий и не содержащий брыжейку.
Примечание: Идеальный сайт вырезать просто аборальная к прекращению брыжейки. На плоскости резания происходит переход от брыжейки собственно к тонкому лИнес , соответствующий каждому мезентериальной вставки (смотри рисунок 1, стрелки). Отсутствие брыжейки имеет решающее значение , поскольку он производит слизистый , которые могут облегчить "затыкать" дыры 17,30.- Поместите лезвие скальпеля в контакте с животным в желаемом месте ампутации. Делайте это либо без посторонней помощи (руки), или осторожно захватывая тело животного с # 5 щипцов (Dumont стиле или подобное).
- Вырезать через ткань, усиливая изогнутое лезвие скальпеля в «качалке» движения по всему телу.
Примечание: Ткань должна разрывать чисто, как скальпель качались и освободить нужный раздел physa от донора. Однако, если небольшой кусочек ткани до сих пор соединяет тело и physa, вырезать его с помощью скальпеля. Не пытайтесь отделить соединенные части, потянув, так как это может привести к повреждению physa.
- Удалите каждую ампутировали 'донора' полип из чашки и вернуть его к SEPAЧаша скорость маркированы '' объединенные с ампутированными конечностями; дата чашу и вернуть его в маточной культуры.
Примечание: Ампутированные полипы исцелит рану аборальной в течение суток, а затем можно подавать в обычном режиме. Они будут регенерировать нормально выглядящую physa в течение двух недель и в этот момент physa может быть ампутированными снова, если это необходимо. - Полоскание вырезанную physa, которые остаются в разделочной блюдо в 12 п.п. ASW, а затем перенести каждую physa в отдельную стерильную лунку в мульти-луночный культуральный планшет, который уже имеет 10 мл 12 п.п. ASW в каждую лунку.
Примечание: В этом примере используется шесть-луночного планшета, с каждым хорошо владеющее 10 мл морской воды и пять вырезанной physa. В общей морской воде должна охватывать physa достаточно, чтобы избежать воздействия воздуха из-за движения при обращении с ними и потенциального испарения. Пластина или скважины должна иметь крышку. - Повторите шаги 3.1 - 3.3, чтобы собрать по меньшей мере 5 physa в каждую лунку зарезервированное для каждого экспериментального лечения.
- Выдержите physa при температуре, которая будет провIde наилучшую скорость регенерации для планируемых экспериментальных допросов. Поместите пластину, содержащую physa в температуре, отрегулированной инкубаторе, при фиксированной температуре, определенной желаемой скорости регенерации.
Примечание: physa будет регенерировать недостающие ткани и образуют полную полип при инкубации при температуре от 15 до 27 ° С. Скорость регенерации зависит от температуры в течение первых двух стадий, за исключением. Средний день для достижения Этап 4 для всех температур 7 суток после срезки и это также совпадает с регенерацией при 21 ° C. При 27 ° С, 4 этап достигается примерно 3 дня раньше и при 15 ° С, стадия 4 задерживается примерно на 3 г по сравнению с регенерацией при 21 ° C (также см Reference 10).
4. Оценка Регенерация с постановкой системы Nematostella регенерации (NRSS)
- Забьет physa с помощью стерео-соединение микроскопа с переменной Magnificвания (10 - 80X). Оценка свежесрезанные Nematostella physa в стадии 0 и продолжить счет в то же время каждый день после ампутации (ДПА) , используя NRSS 10.
Примечание: Для ключевых критериев постановки и подробнее см Reference 10.- Оценка physa как стадия 0 (открытая рана), если свежесрезанных physa появляется в виде формы купратах массы, напоминающей вялый воздушный шар, с открытым участок раны, скорее всего виден.
Примечание: края раны также могут склеиваться с самого начала, но ткань будет по-прежнему быть свернуты и не хватает жесткости. Края открытой раны может наблюдаться претерпевает радиальное сжатие, как рана заживает. - Оценка physa как 1 этап (Рана), если рана ампутация появляется закрыто.
Примечание: Раны расположение будет соответствовать будущему оральной полюсу. Наружная поверхность вокруг будущего оральной полюса может начать показывать различные арки, соответствующие нижележащих радиально симметричным энтодермальных мезентериальных вставками. - Показатель рНYSA в Стадии 2 (радиальный) Арчес если поверхность полости рта полюса появляется завышена, открывая восемь поднятых арок, располагающихся в радиально-симметричной рисунком и разделенных канавками. Наблюдать небольшие, полусферических волдыри на вершине арки. Они будут столь же высокой, как широкий, вероятен временный характер, и первоначально включала одним слоем эктодермы клетки.
Примечание: В некоторых случаях двухслойные везикулы может стабилизироваться. Примечание: При этом или более поздних стадиях слизистая слой может появиться инкапсулировать physa (рисунок 2) в мембранном 'оболочки'. Этот герметизирующий материал должен быть удален, чтобы облегчить скоринг. - Оценка physa как стадия 3 (Tentacle), если бутоны щупалец, содержащих эндодермальных и эктодермальные слои ткани стабильно образуются в полости рта конца, по крайней мере некоторых радиальных арок.
Примечание: Щупальца длиннее, чем они широки и минимально подвижны. Physa покажет увеличилась, но переменную инфляции, так что брыжейки зачатки может стать визавикими простирающийся от мезентериальной вставки в полость тела (первичная клетка). - Оценка physa в стадии 4 (линейный мезентериев), если physa содержит восемь различных, видимые мезентерий, которые простираются в первичная клетка из вставок в стенке тела, оральные-аборальная длины, которые более чем в два раза их радиальной ширины, измеренной от того, где они появляются для подключения в глотку на ее аборальной конце (enterostome).
Примечание: Четыре или меньше мезентериев имеют "гофрированные" внутренние свободные края. Глотка видна. Более восьми щупалец видны, подвижны, а иногда они сжимаются в тело. - Оценка physa как стадия 5 (преимущественно плиссе мезентериев) если physa имеет более четырех мезентерий с плиссировка и плиссировка более полно и извилистый, чем на этапе 4. Животное имеет почти "нормальный" взрослый внешний вид, но нет никаких видимых гонад клетки.
- Оценка physa как стадия 0 (открытая рана), если свежесрезанных physa появляется в виде формы купратах массы, напоминающей вялый воздушный шар, с открытым участок раны, скорее всего виден.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Прогрессирование морфологических событий во время регенерации в отрезанной physa показана на рисунке 1А, который включает в себя представительные вид physa на каждом этапе NRSS. Типичный сайт physa разрез показан на взрослого (Arrowheads). На фотографиях на рисунке 1А показывают прогрессивную регенерацию полости рта и тела структур из свежесрезанных physa через полностью сформированные полипа. Рисунок 1B, C показано расположение внутренних перегородок, мезентерий, на стадии 4 и 5 стадии, соответственно. Обратите внимание, что некоторые мезентериев на этапе 4 будет не хватать "плиссировка", но квалифицировать как этап 5 большинство должно разработали складками. Рисунок 1D показывает physa облекают в мембране слизистой , которые могут быть удалены с помощью пинцета (рис 1E). В то время как, как правило, не является вредным для регенерации (если оно необоснованно не улавливает животное), мембрана может препятствовать надрезания physa и сделатьИНГ экспериментальных манипуляций, таких как микроскопия, фиксация образца или заготовки для молекулярного / биохимического анализа. Это лучше всего удаляется после стадии 1 или более поздней версии, если она реформы.
На рисунке 2 показано , как система стадирования может быть использована , чтобы выиграть результаты эксперимента для оценки влияния ингибирования аутофагию. Physa вырезали и обрабатывали хлорохин со скоростью 10, 50 и 100 мкМ, или physa не обрабатывали (контроль). Хлорохин ингибирует лизосомальные функции, которые необходимы для аутофагии. Критерии NRSS были использованы , чтобы забить physa над ходом регенерации и результаты наносили на график на рисунке 2Е. Фотографии представительного управления (рис 2А) и хлорохин обрабатывали physa (рис 2 B - D) были сделаны , когда управление достигло Этап 5. хлорохин животных , обработанных не продвинулась дальше 4 -й стадии, и они , как правило , выставлены неполные брыжейки regeneraции (большинство не хватало гофрирования), короткий размер щупальце, а в некоторых случаях короткая длина тела.
Рисунок 1. Особенности регенерации. (A) Примеры physa регенерирующейся полости рта и тела структур поставлена в соответствии с NRSS. Панель маркированы взрослых показывает признаки взрослого животного с щупальцами (т) глоткой (Ph), мезентериев (М) и брыжейки вставках (MI). Белые стрелки показывают, где гофрированную область перехода мезентериев к вставке брыжейки, хребет энтодермы, простирающейся на аборальной конца. Этот регион представляет собой physa. Желтые стрелки показывают идеальный сайт physa половинного деления. Панель 0 показывает пять минут после того, как physa бисекции, и панель 0 'представляет собой увеличенный вид одного из этих physa, с открытой раной в центре, определяя стадии 0 изNRSS. Панель 1 показывает physa с раной в настоящее время закрыты, определение Этап 1. Панель 2 показывает physa с поднятыми радиальными арками вокруг полости полюса, с надутыми тканей ниже, что соответствует 2 -й этап (панели 0 - 2 представляют собой виды устного конца). Группа 3 показывает щупальца почки , возникающие в полости рта полюса (повернутый в правую сторону ) продолговатого и накачивания physa, теперь на этапе 3. Примечание элементы рудиментарным брыжейки видны и гортань формируется в темной области в полости рта конца. Группа 4 показывает появление истинных щупалец, а также переходные "волдыри" на устном полюсе, определяющие Стадия 4. Линейные мезентериев видны в надутом physa. Большой круглый масса видна внутри полипа неизвестного происхождения и будет выслан через рот. Панель 5 показывает почти полную регенерацию характеризуется более четырех гофрированных мезентериев, полностью сформированный фазнымиarynx и восемь или более щупальца, которая определяет его как 5 этап. (B, C) Спинные мнения отдельных physa иллюстрируют biradial расположение и морфологии мезентериев. С этой точки зрения, плиссированные мезентериев по всей видимости, имеют выпуклость на полпути ткани (зеленая Arrowhead). Стадии 4 physa имеет четыре или менее гофрированных мезентерий, и сцена 5 physa имеет более четырех (C). Мезентериев с или без гофрирования обозначены зелеными или желтыми стрелками, соответственно. Черный стрелолист в (С) указывает на гофрированной брыжейки , который продлен в радиальном направлении. (D, Е) Удаление слизистой оболочки из physa изображен. Белые стрелки указывают на слизистую оболочку , окружающую physa (D) , которые должны быть удалены , как и в (Е) перед тем самым увеличив счет регенерации. Иногда остаточная ткань (желтые стрелки) могут оказаться в ловушке внутри оболочки, и это также должны быть удалены. Звездочка указывает на устные полюса, где знакредактор Красные полоски размером в 0,5 мм во всех панелях , кроме А5 (1,0 мм). Панели В и С этой фигуре были изменены и перепечатано с разрешения Reference 10. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Влияние хлорохин на регенерацию. Чтобы продемонстрировать применение NRSS, мы тестировали эффекты хлорохин, ингибитора аутофагии. Physa ампутировали и сразу же помещают в 1 / 3x ASW, содержащей 0,1% ДМСО (контроль) или хлорохин в 10, 50, 100 мкМ. Physa оценивали через 24 ч интервалами с использованием NRSS. (A) Представитель конечных точек изображения , взятые из контроля , когда они достигли стадии 5.
Рисунок 3. Резюмеключевые особенности этапов NRSS. На этой диаграмме показаны основные морфологические изменения, которые определяют каждый этап в NRSS. Направление движения обозначены красными стрелками и особенности зелеными наконечниками. Стадия 0 изображает открытую рану только после резки (А) и т). Рану кромки подвергаются закрывающий радиальное сжатие по направлению к центру (B). Стадия 1 характеризуется полным закрытием раны (С) и высота арки между оральными обращенных гребнями (D); центр оральной поверхности (стрелки) находится в депрессии. Этап 2 имеет ярко выраженный сводообразования ротовой поверхности (стрелки, Е); physa начинает удлиняться и сужаются (F) с амбулакральных бутонов и видимых пузырьков на вершине арки (стрелки). Этап 3 имеет стабильные щупальца почки (стрелочка, G) и регенерирующий глотка можно рассматривать как плотность при оральном полюсе (оранжевая масса, в Н наконечник стрелы (I) , которые должны быть по крайней мере вдвое дольше, чем они высокие на стыке зева (I '). Четыре или меньше мезентериев может быть плиссированной на их внутреннем крае - на мезентериальной нити (J, J '). Стадия 5 характеризуется более четырех гофрированных мезентериев (К), что может быть лучше всего можно оценить путем просмотра из аборальном конца (K '). Повторная печать с разрешения Reference 10. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование Nematostella в качестве модели заживления ран и регенерации становится все более популярным. Таким образом, важно, чтобы иметь возможность визуализировать морфологические закономерности конкретного протокола, прежде чем эффективных клеточных и молекулярных анализов могут быть назначены и сравнены. Nematostella имеют высокую степень регенеративной «гибкости», будучи в состоянии реформировать практически любую недостающую структуру ампутирована в любом месте, на пост-Planula этапах жизни. Таким образом, различные исследователи исследовали регенерацию в результате ампутации или ранив в различных регионах полипов, в разном возрасте и размерах 7-18.
Система стадирования описанная здесь следует преобразование морфологически однородного участка physa, ампутирована от спинных конца взрослого, к анатомически ювенильного полипа не хватало только репродуктивной ткани (мы еще не определили, когда эти регенерированные несовершеннолетние становятся сексуально мратура). Этот подход рассматривает регенерацию от простого зачатка ткани к одному из почти максимальной сложности. В том числе пять physa как минимальный размер группы рекомендуется нормализовать для потенциальной индивидуальной изменчивости и живучести. Конечно, эта цифра может быть скорректирована с учетом конкретных экспериментальных целей , но протокол NRSS позволяет 2 мл среды на physa , чтобы свести на нет потенциальный "объемный эффект" , как то , что было сообщено влияет на регенерацию гидры 23.
Другие подходы к изучению регенерации Nematostella использовали взрослых надвое в середине тела или в полости рта конца, или ювенильной стадии полипы 4-щупальце надвое в середине тела 7,11-18. Два исследования изучали регенерацию в physa освобожденной естественного деления 16,18, и подходы , использующие ампутировали physa в последнее время появились с NRSS 8,9. Каждый из этих разнообразных подходов имеет свои достоинства и может решать уникальные вопросы о regeneratiве процессов, происходящих при различных ампутации или нанесения увечий режимов, так и среди животных разного возраста. Протокол NRSS для physa ампутации и задира, показано в настоящем исследовании, генерирует относительно однородный набор physa для систематического исследования и позволяет избежать изменение размера physa, состав ткани и последующее прогрессирование регенерации реакций естественного поперечного деления 18,24. Хотя physa ампутация несколько соответствует естественному способу бесполого размножения в Nematostella, молекулярные различия были отмечены между регенерации в результате естественного деления и ампутации в середине тела или на physa 16,18,24. Будь physa, полученный методом ампутации, описанного здесь или естественного деления показывают такие различия еще предстоит определить.
Есть несколько вопросов, которые имеют решающее значение для успеха с ампутацией, разведению и методы, описанные здесь, ведя счет. Полипы, выбранные для ампутации ShouЛД поддерживаться при той же температуре, подобранных по размеру physa, истории питания и, если это возможно возраст (хотя последний не был систематически протестирован, чтобы определить, есть ли возрастное влияние на вариации в прогрессировании стадии). Получение открытую рану с острым стерильным скальпелем, имеющим изогнутое лезвие имеет важное значение для морфологических наблюдений заживления ран между стадией 0 и Стадия 1. Когда physa надувается и изогнутое лезвие скальпеля сотрясается над взрослой ткани, она ампутирована в одно движение, и может быть быстро переданы на лечение и от резки блюдо. Ампутаций, которые включают брыжейки или которые являются результатом обширных физических манипуляций должны быть отброшены.
Практика постановки неочищенных physa, чтобы получить чувство индивидуальной изменчивости в популяции испытывается. Вариация между отдельными physa является хотя бы на самых ранних стадиях. Например, все physa находятся в стадии 0 при 0 DPA. Таким же образом все physa достигают этап1 в синхронности на 1 DPA. Появление стадии 2 может быть труднее для наблюдателя различить, потому что «инфляция» является относительным состоянием, которое достигается, однако, на 2 с.н.а. с небольшим изменением. Появление истинной щупальца знаков прогрессии Этап 3. регенерирующие щупальца могут быть скрыты появлением мембранном "кокона", что затрудняет визуализацию щупальца зародыше под ним. Если перепончатая покрытие не была предварительно удалена, это должно быть сделано так теперь. Удаление мембраны с тонкой наконечником пинцетом освободит регенерирующим physa. Различие между Стадии 4 и 5 это число гофрированных мезентериев. Этап 4 имеет четыре или менее гофрированных мезентерий, и 5 этап имеет от пяти до восьми плиссированные мезентерий. В то время как плиссировка можно наблюдать в виде сбоку, точное количество гофрированных мезентериев лучше наблюдаемый с аборальной зрения.
Одна из проблем при изучении взрослых Nematostella регенерации от PHYса рудимент, и действительно с тканями, вырезанных из других сайтов ампутации, является разнообразная ясность живых тканей. Колба physa относительно ясно в неповрежденном взрослого, но это становится весьма непрозрачным из-за сокращения ткани после ампутации. Ясность возвращается постепенно (2 этап), как только рана закрывается (этап 1) и животное начинает раздувать, но даже в этом случае область вокруг раневого участка, где ткани и структуры активно регенерирующий остается несколько затемняется плотных тканей (особенно стадия 3). Повышение уровня инфляции , как правило , сопровождает этап 4 и 5. Закрепление с последующим оптическим разъяснении почти наверняка решить , что происходит в полости рта конца, но более информативным может быть живой, тканеспецифические трансгенные репортеры , которые могут быть проверены для флуоресценции и более легко визуализируются 15, 25-30.
Ампутировали physa, очевидно, не может кормить, так как ему не хватает щупальца, рот и мезентерий (которые укрывают пищеварительных желез), таким образом, requiкольцо регенерации отсутствующих структур тела, чтобы быть достигнуто за счет мобилизации питательных запасов из источников непродовольственных. Physa потенциально может выполнить это с помощью аутофагией, в которых цитоплазма, органеллы и другие клеточные компоненты поглотил внутриклеточно и обработаны с помощью механизма лизосом-зависимой для производства энергии и соединения для анаболических процессов 31-33. Мы считаем, что лечение physa с ингибитором лизосом, хлорохин, вызывает аварийное восстановление мезентериев и щупалец, и общей морфологии тела, что свидетельствует о том, что аутофагии необходим для нормальной регенерации полости рта и тела структур. Аутофагия регулирует стволовые клеточные функции 34-36, и играет существенную роль в регенерации в гидры, планарии и данио 37-41. Дальнейший анализ необходим , чтобы понять , как влияет на регенерацию аутофагия Nematostella на клеточном и молекулярном уровнях, но наш первый эксперимент пас показывает целесообразность использования NRSS как быстрый метод скрининга для небольших молекул, которые могут повлиять на регенерацию.
Генетические, молекулярные и клеточные процессы , которые регулируют регенерацию в Nematostella лишь в зачаточной стадии понимания, но эта модель эмерджентное для регенерации имеет растущий репертуар инструментов для геномной и генной анализа экспрессии. С его аннотированных геном, множеством региональных и специфических тканей генетических маркеров и надежных методов трансгенеза, мутагенеза, гистологии и микроскопии, Nematostella обещает раскрыть механизмы , регулирующие anthozoan гидроидной регенерации и раскрыть ли его регенеративные процессы аналогичны или уникальным среди кишечнополостных и многоклеточные в целом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Нью-Йорк Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Грант на ОТВ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
| Glass Culture Dish, 250 mL | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 mL |
| Glass Culture Dish, 1,500 mL | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 mL |
| Polyethylene transfer pipette, 5 mL | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
| Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
| Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
| #5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
| Pyrex Petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass Petri plates |
| Sterile 6-well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 12-well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 24-well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
| Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
| pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
| artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
| Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
| Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
| Beaker, Graduated, 4,000 mL | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
| Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 - 40X magnification |
References
- Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , The Boxwood Press. (1986).
- Trembley, A. Mémoires pour servir à l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, à bras en forme de cornes. , Jean & Herman Verbeek. (1744).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles? Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).
- Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration? Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).
- Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).
- Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).
- Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).
- Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).
- Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).
- Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
- Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).
- Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).
- Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).
- DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
- Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
- Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).
- Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).
- Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
- Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).
- Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).
- Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
- Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
- Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).
- Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139 (2), 347-357 (2012).
- Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).
- DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
- Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).
- Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).
- Guan, J. L., et al.
- Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).
- Varga, M., Fodor, E., Vellai, T.
- Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).
- Gonzalez-Estevez, C., Salo, E.
- Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
- Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).
