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Artículo de método

Preparación y

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DOI:

10.3791/54652

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23 de noviembre de 2016

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1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

En este artículo

Resumen

Aquí, se describe la preparación y uso de una sonda basada en la actividad (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato) que permite la detección y cuantificación de la forma activa de la enzima proinflamatoria N amidasa ácido -acylethanolamine (NAAA), tanto in vitro como ex vivo.

Resumen

perfiles de proteínas basado en las actividades (ABPP) es un método para la identificación de una enzima de interés en un proteoma complejo mediante el uso de una sonda química que se dirige a los sitios activos de la enzima. Una etiqueta de reportero introducido en la sonda permite la detección de la enzima marcada por el análisis en gel de fluorescencia, transferencia de proteínas, la microscopía de fluorescencia, o la espectrometría de cromatografía de masa líquida. Aquí, se describe la preparación y uso de la ARN14686 compuesto, una sonda basada en la actividad de química (CC-ABP) que reconoce selectivamente la enzima N amidasa ácido -acylethanolamine (NAAA). Naaa es una hidrolasa cisteína que promueve la inflamación mediante la desactivación de los agonistas alfa endógenos receptor activado por el proliferador de peroxisomas-(PPAR), tales como palmitoiletanolamida (PEA) y oleoiletanolamida (OEA). NAAA se sintetiza como una proenzima inactiva de longitud completa, que se activa por autoproteolisis en el pH ácido del lisosoma. Los estudios de localización have muestra que NAAA se expresa predominantemente en macrófagos y otras células derivadas de monocitos, así como en los linfocitos B. Proporcionamos ejemplos de cómo ARN14686 se puede utilizar para detectar y cuantificar NAAA activo ex vivo en los tejidos de roedores por transferencia de proteínas y microscopía de fluorescencia.

Introducción

Comúnmente utilizado métodos para investigar los patrones de expresión, interacciones y funciones de las proteínas, incluyendo las plataformas de cromatografía de espectrometría de masas para el análisis de líquidos escopeta 1,2, levadura de dos híbridos de métodos 3,4, y en ensayos in vitro, están limitadas en cuanto a que son no se puede evaluar la actividad de las proteínas en su estado nativo. basados ​​en la actividad de proteína de perfiles (ABPP) se puede utilizar para llenar este vacío. En este enfoque, las sondas de molécula pequeña capaz de unirse covalentemente al sitio activo de una enzima de interés se conjugan con un grupo indicador que permite la detección de blancos. El uso de la química clic (CC), el reportero puede ser integrado en la sonda o puede ser introducido después del acoplamiento de destino se ha producido 5,6. El último procedimiento requiere el uso de sondas que contienen grupos químicos apropiados, tales como un alquino o azida de terminal, que puede ser modificado con un número de reactivos de reportero a través de reacciones bio-ortogonal such como el Cu (I) catalizada Huisgen [3 + 2] cicloadición 7-9 o Staudinger ligadura 10,11.

Recientemente, hemos revelado el ARN14686 compuesto como la primera ABP para la detección in vitro y in vivo de la hidrolasa cisteína, NAAA 12 en. NAAA cataliza la desactivación hidrolítica de FAEs saturados y monoinsaturados, incluyendo oleoiletanolamida (OEA) y palmitoiletanolamida (PEA), que son agonistas endógenos de la anti-inflamatoria receptor nuclear PPAR-alfa 13-15. NAAA se expresa predominantemente en macrófagos y otras células derivadas de monocitos, así como en los linfocitos B 14,16, lo que sugiere un papel en la regulación de la respuesta inmune innata. La enzima se sintetiza en el retículo endoplasmático rugoso en una forma inactiva y se activa en los compartimientos ácidos de la célula por un mecanismo autoproteolítica 17. La escisión autoproteolítica genera una nueva cisteína-terminal de N (C131 en ratones y ratas, C126 en los seres humanos), que es el nucleófilo responsable de FAE hidrólisis 18,19. La inhibición farmacológica de la actividad naaa altera el equilibrio de síntesis / degradación de la FAE en favor de un aumento de los niveles celulares de FAE 16,20,21. Varios derivados de β-lactona y β-lactámicos se ha demostrado que inhiben la actividad de NAAA con alta potencia y selectividad 16,22-26. Estos inhibidores actúan a través de S acilación de la cisteína catalítica 16,27,28.

El ARN14686 compuesto fue diseñado sobre la base de la estructura química de la, inhibidor de la β-lactama NAAA serina derivados sistémicamente activo, ARN726 (N-4 cyclohexylbutyl- - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato) 16. El grupo 4-butil-ciclohexil de ARN726 fue sustituido con una cadena alifática saturada C9 teniendo una etiqueta de alquino terminal para la posterior conjugación CC con una etiqueta de reportero azida-cojinete. Hemos elegido para diseñar un SPA de dos pasos para MiniMally alterar la estructura del andamio original, manteniendo así la afinidad de la sonda para NAAA. Además, evitando la introducción de etiquetas voluminosos, una sonda de este tipo podría ser más adecuado para el tratamiento in vivo de un directo ABP. ARN14686 inhibe NAAA con alta potencia (hNAAA IC 50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) mediante la formación de un aducto covalente con la cisteína catalítica de la enzima 12. Experimentos en ratas vivas mostraron que la sonda es selectiva en la captura de NAAA expresa en pulmones. Ceramidasa ácida, otra amidasa cisteína que comparte 33-34% de identidad con NAAA, también fue identificado como un objetivo de baja afinidad utilizando las altas concentraciones de sonda (10 micras de vitro, 10 mg / ml por vía intravenosa, iv) 12. También hemos utilizado ARN14686 para estudiar la presencia de NAAA activo en tejidos de rata inflamadas después de la administración de adyuvante completo de Freund (CFA) 29.

A continuación, se describe un protocolo para los preparatien de ARN14686 (Figura 1) y su aplicación a la investigación de la activación NAAA ex vivo. Como ejemplo, se describe un procedimiento experimental para visualizar NAAA en patas de rata después de la administración CFA. En este experimento, las proteínas se extrajeron a partir de tejido de la pata después de la inyección iv de la sonda, y el proteoma marcado-ABP es sometido a CC con biotina-azida. muestras biotiniladas se enriquecen usando perlas de estreptavidina, y se llevan a cabo transferencias de proteínas. En otra aplicación, se describe la localización de NAAA activo por microscopía de fluorescencia en los pulmones del ratón de los ratones tratados con la sonda. En este caso, el tejido se seccionó y las secciones se someten a CC para la adición de rodamina. Un esquema de flujo de trabajo se ilustra en la Figura 2.

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Protocolo

Precaución: Todas las reacciones de química deben llevarse a cabo en una campana ventilada y con el uso de una bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras. Las reacciones se deben también llevaron a cabo en un ambiente de nitrógeno.

declaración ética: Nuestros procedimientos con animales se llevan a cabo de conformidad con la normativa italiana sobre la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos (DM 116192), y los reglamentos de la Comunidad Económica Europea (DO L 358/1 de la CE 12/18/1986 ).

NOTA: Síntesis de [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] acetato de amonio se describe para los rendimientos a gran escala (50 g de N CBZ-L-serina), pero se pueden escalar fácilmente hacia abajo.

1. Síntesis

NOTA: Véase la Figura 1 para el esquema de reacción de síntesis.

  1. Preparación de 2-piridilo carbonato undec-10-inilo y undec-10-inil 2-oxopiridina 1-carboxilato de metilo
    1. En un matraz de 50 ml de fondo redondo, se disuelven 350 mg de undec-10-in-1-ol en 3,5 ml de diclorometano seco.
    2. A la solución en 1.1.1, añadir 25 mg de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y 530 mg de 2-dipyridylcarbonate (DPC). Se agita la mezcla a temperatura ambiente (RT) durante 16 horas.
    3. Añadir 20 ml de diclorometano.
    4. Transferir la mezcla en un embudo de separación. Añadir 15 ml de agua, agitar, y permitir que las dos fases se separen.
    5. Abrir la llave de paso, recoger la fase orgánica (inferior), y luego cerrar la llave de paso. Añadir 15 ml de una solución saturada de NaHCO3. Agitar la ampolla de decantación y dejar que las dos fases separadas. Repita este paso dos veces más.
    6. Se seca la capa orgánica con Na 2 SO 4, se filtra a través de algodón en un matraz de fondo redondo (tara primero), y se evapora a sequedad bajo presión reducida (evaporador rotatorio).
    7. Pesar el matraz y obtener 600 mg de aceite que es una mezcla de 2-piridilo carbonato undec-10-inilo y undec-10-inil 2-oxopiridina 1-carboxilato de etilo en una proporción de 1,7: 1.
      1 H RMN (400 MHz, DMSO-d 6) componente principal δ = 8,39 (dd, J = 5,0, 2,0, 1H), 7,98 (td, J = 7,9, 2,0, 1H), 7,40 (ddd, J = 7,2, 4,9, 0,9, 1H), 7,30 (d, J = 8,2, 1H), 4,22 (t, J = 6,6, 2H), 2,73 (t, J = 2,4, 1H), 2.18 a 2.11 (m, 2H), 1,76 - 1,62 (m, 2H), 1,50 - 1,23 (m, 12H).
      1 H RMN (400 MHz, DMSO-d 6) componente menor δ = 7,74 (dd, J = 7,2, 1,9, 1H), 7,47 (dd, J = 6,7, 2,3, 1H), 6,44 (d, J = 9,4, 1H), 6.30 hasta 6.25 (m, 1H), 4,35 (t, J = 6,5, 2H), 2,72 (t, J = 2,4, 1H), 2.18 a 2.11 (m, 2H), 1,77-1,60 (m, 2H ), 1,52-1,20 (m, 12H).
    8. Utilice el aceite sin ninguna separación o purificación adicional.
  2. Preparación de [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] acetato de amonio
    1. Preparación de bencil N - [(S) -1- (hidroximetil) -2 - [(4-metoxifenil) amino] -2-oxoethil] carbamato.
      1. En un matraz de fondo redondo de 4-L, se disuelven 141,5 g de p anisidina en 1,5 L de tetrahidrofurano y 0,5 l de diclorometano.
      2. Se enfría la solución a 0 ° C en un baño de hielo.
      3. Añadir 50,0 g de N CBZ-L-serina y 43,9 g de N - (3-dimetilaminopropil) - etilcarbodiimida clorhidrato de N '.
      4. Se agita la mezcla con una barra magnética a 0 ° C durante 30 min.
      5. Se elimina la solución del baño de hielo y se agita con una barra magnética a temperatura ambiente durante 16 horas.
      6. Se evaporan los disolventes a presión reducida (evaporador rotatorio).
      7. Añadir 400 ml de 1: 1 de ciclohexano / acetato de etilo, se agita con una espátula, y se decanta.
      8. Repita el paso 1.2.1.7 dos veces más.
      9. Se disuelve el residuo gomoso en 500 ml de acetato de etilo y se lava con 400 ml de solución 0,1 M de HCl (10 veces), con 400 ml de solución saturada de NaHCO3 (2 veces), y con 400 ml de salmuera.
      10. Se seca la capa orgánica conNa 2 SO 4, se filtra la solución a través de algodón en un matraz de fondo redondo (tara primero), y se evapora a sequedad bajo presión reducida (evaporador rotatorio).
      11. Pesar el matraz y obtener 61,4 g de un sólido blanco.
        1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6)? = 9,86 (bs, 1H), 7,52 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 7,42-7,25 (m, 6H), 6,91-6,85 (m, 2H) , 5,06 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 5,02 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 4,98 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 4.24 a 4.15 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,70-3,57 (m, 2H).
    2. Preparación de bencil N - [(S) -1- (4-metoxifenil) -2-oxo-azetidin-3-il] carbamato.
      1. Disolver 58,6 g de N - [(S) -1- (hidroximetil) -2 - [(4-metoxifenil) amino] -2-oxo-etil] carbamato de 1,6 L de N, N-dimetilformamida.
      2. Se enfría la solución a 0 ° C con un baño de hielo.
      3. Añadir 50,6 g de 1,1-sulfonyldiimidazole y se agita con una barra magnética durante 30 minutos.
      4. Se enfría la solucióna -20 ° C con un baño de hielo / NaCl y añadir 10,2 g de hidruro de sodio (60% en aceite mineral) en porciones.
      5. Se agita la mezcla a -20 ° C durante 1 hora, y luego se apaga con 2 ml de metanol y 1 l de agua.
      6. Vacío a filtrar el precipitado, se lava con 200 ml de agua, y secar a vacío.
      7. Obtener 42,2 g de un sólido blanco.
        1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8,08 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,42-7,28 (m, 5H), 7,30 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 6,95 (d , 2H, J = 8,9 Hz), 5,06 (s, 2H), 4,86 ​​(ddd, 1H, J = 8,5, 5,6, 2,6 Hz), 3,90 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 3,73 (s, 3H) , 3,55 (dd, 1H, J = 5,6, 2,6 Hz).
    3. Preparación de bencil N - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato.
      1. Suspender 9,0 g de bencil N - [(S) -1- (4-metoxifenil) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato en 500 ml de acetonitrilo y 400 ml de agua.
      2. Se enfría la solución a 0 ° C en un baño de hielo.
      3. Añadir 45,4 g de Ceric nitrato de amonio en porciones durante 45 min y se agita con una barra magnética a 0 ° C durante 15 minutos.
      4. Añadir 500 ml de solución saturada de NaHCO3 con cautela, y luego añadir 500 ml de acetato de etilo.
      5. Filtrar el precipitado y lavar con 200 ml de acetato de etilo.
      6. Se separa la solución bifásica y se lava la capa acuosa con 200 ml de acetato de etilo (3 veces).
      7. Se seca la capa orgánica con Na 2 SO 4, añadir 5 g de carbón activado, filtro a través de una capa de sílice de diatomeas, y se evapora a sequedad bajo presión reducida (evaporador rotatorio).
      8. Añadir éter dietílico y se agita con una espátula.
      9. Filtrar el sólido y obtener 4,85 g de un sólido de color blanquecino.
        1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7,97 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,94 (bs, 1H), 7.42- 7.30 (m, 5H), 5,05 (s, 2H), 4,67 (ddd, 1H, J = 8,7, 5,4, 2,7 Hz), 3,40 (t, 1H, J = 5,4 Hz,), 3,09 (dd, 1H, J = 5,4, 2,7 Hz).
    4. Preparación de [(S) -2-oxoazetidin-3-il] -amonio de etilo.
      1. Disolver 0,93 ml de ácido acético en 245 ml de acetato de etilo. Marcar esto como "solución de atrapar."
      2. Disolver 3,28 g de bencil- N - [(R) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato en 298 ml de etanol.
      3. Añadir 14,1 ml de ciclohexadieno y 3,27 g de 10% de paladio sobre carbono.
      4. Se agita la suspensión a temperatura ambiente durante 12 horas y después se filtra a través de un lecho corto de tierra de diatomeas. Verter el líquido de elución directamente en la solución de captura.
      5. Se evapora el disolvente a presión reducida (evaporador rotatorio), manteniendo la temperatura por debajo de 35 ° C.
      6. Se tritura el sólido obtenido con tetrahidrofurano y obtener 1,72 g de un sólido blanco.
        1 H RMN (400 MHz, DMSO-d6)? = 7,68 (bs, 1H), 3,99 (ddd, 1H, J = 5,2, 2,4, 1,2 Hz), 3,32 (t, 1H, J = 5,2 Hz), 2,79 (dd, 1H, J = 5,2, 2,4 Hz), 1,90 (s, 3H).
  3. Preparación de undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de
    1. En un matraz de 10 ml de fondo redondo, se disuelven 60 mg de [(3 S) -2-oxoazetidin 3 il--] acetato de amonio en 2 ml de diclorometano seco.
    2. Se enfría la solución a 0 ° C en un baño de hielo y se añaden 81 l de N, N-diisopropiletilamina gota a gota.
    3. Disolver 350 mg de la mezcla en bruto que contiene undec-10-inil 2-oxopiridina 1-carboxilato de etilo en 2 ml de diclorometano seco, añadir a la solución, y se agita a TA durante 15 h. Se evapora el disolvente a sequedad bajo presión reducida (evaporador rotatorio).
    4. Se purifica mediante cromatografía en columna (gel de sílice) usando un aparato de cromatografía en columna automatizada:
      1. Absorber la muestra sobre gel de sílice, equilibrar la columna con ciclohexano, y la carga de la muestra en el cartucho.
      2. Eluir con ciclohexano / acetato de etilo de 100: 0 a 0: 100 y recoger los picos en tubos de ensayo.
      3. Se evapora el disolvente de las fracciones correspondientes al compuesto a sequedad bajo presión reducida (evaporador rotatorio) y obtener 40 mg de un sólido blanco.

2. Preparación de los reactivos CC

  1. Preparación de 5 mM de la solución de moléculas Tag-azida
    1. Disolver 1,5 mg de azida-PEG3-Fluor 545 en 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Hacer alícuotas de 0,5 ml en tubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C.
    2. Disolver 1,1 mg de azida-PEG3-biotina en 0,5 ml de DMSO. Hacer alícuotas de 0,5 ml en tubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C.
  2. Preparación de 50 mM solución madre de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP)
    1. Disolver 14,3 mg de TCEP en 1 ml de agua, y hacerlo de nuevo cada vez.
  3. Preparación de la solución 50 mM de CuSO 4 · 5H 2 O
    1. En un vial de vidrio, se disuelven 12.48 Mg de CuSO 4 · 5H 2 O en 1 ml de agua. Almacenar a temperatura ambiente hasta por un mes.
  4. Preparación de 83,5 mM de solución de Tris [(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (TBTA)
    1. En un vial de vidrio, se disuelven 8,85 mg de TBTA en 200 l de DMSO. Almacenar a temperatura ambiente hasta por un mes.
  5. Preparación de Trabajo 1,7 mM Solución de TBTA (inmediatamente antes del uso)
    1. Añadir 20 l de TBTA 83,5 mM a un vial de vidrio y se diluye con 180 ml de DMSO.
    2. Añadir 800 l de terc-butanol y vórtice.

3. Análisis de Expresión naaa en el tejido de la pata de las ratas tratadas con CFA

NOTA: El uso ratas Sprague-Dawley, con un peso de 175-200 g, y llevar a cabo todos los procedimientos de conformidad con las directrices para el uso ético de los animales. Casa ratas en jaulas ventiladas en un ciclo de luz de 12 horas / oscuridad y darles acceso libre a comida y agua. Para el protocolo de CFUn tratamiento, consulte el artículo publicado por Bonezzi et al. 29 Utilizar animales 7 días después de la administración de CFA.

  1. La administración intravenosa de ARN14686
    1. Disolver ARN14686 en vehículo (15% de PEG y 15% de solución salina de Tween). Calcular la concentración de la solución en función del peso de la rata (dosis 3 mg / kg, volumen de inyección 5 ml / kg).
    2. Proceder con inyecciones iv de cada tres ingenuo y tres ratas tratadas con CFA. Coloque cada rata en un dispositivo de sujeción de plástico apropiado. A continuación, coloque la cola de rata en agua caliente durante 2-4 minutos para permitir la vasodilatación, e inyectar el compuesto IV a través de la vena de la cola.
    3. Inyectar iv tres ratas (ingenuo y CFA tratos) con el único vehículo.
  2. Colección de la pata y la disección
    1. Sacrificar las ratas por inhalación de CO2 4 horas después de la administración de la sonda o del vehículo y recoger sus patas cortándolos 0,5 cm por encima de la articulación de la rodilla utilizando un bisturí.
    2. Retirar con cuidado la piel mediante la disección de tijera asistida y diseccionar los tejidos blandos mediante el raspado de ellos desde el hueso. Desechar los huesos y recoger los tejidos blandos de las patas. muestras de congelamiento rápido en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C.
  3. La pata de Homogeneización y preparación de proteínas lisosomales
    NOTA: Evite el uso de detergentes y tampones que contienen aminas, ya que pueden inhibir la reacción de CC.
    1. Combinar el tejido pata de 3 ratas (obtenido como se describe en la sección 3.2.1) y homogeneizar en 4 ml de 320 mM de sacarosa en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y un cóctel inhibidor de la proteasa (ver Material / Reactivo Tabla); utilizar un instrumento de dispersión de alto rendimiento (ver Material / reactivo de la tabla).
    2. Centrifugar el homogeneizado de tejido durante 20 minutos a 1000 xga 4 ° C; guardar el sobrenadante.
    3. Añadir 2 ml de sacarosa 320 mM en PBS y el cóctel inhibidor de la proteasa para el sedimento de tejido yhomogeneizar una vez más.
    4. Centrifugar durante 20 min a 1000 xg a 4 ° C, y añadir el sobrenadante a la de la etapa 3.3.2.
    5. Centrifugar los sobrenadantes recogidos durante 30 minutos a 12.000 xga 4 ° C.
    6. Pesar el sedimento y se resuspende en dos volúmenes de PBS (es decir, 200 l por cada 100 mg de pellets). Transferir a un tubo de 1,5 ml de recogida y congelar a -80 ° C durante 1 hora.
    7. Descongelar las muestras y congelar de nuevo durante 1 hora a -80 ° C.
    8. Repetir el ciclo de congelación / descongelación dos veces más.
      NOTA: Este paso está diseñado para solubilizar la proteína. Congelar durante la noche si es necesario.
    9. Centrifugar durante 1 hora a 100.000 xg a 4 ° C. Recoger el sobrenadante, que contiene las proteínas lisosómicas solubles, y desechar el sedimento. Almacenar a -80 ° C o proceder inmediatamente con la cuantificación de proteínas.
    10. Cuantificar el contenido de proteína utilizando un ensayo de proteína BCA 30 kit comercial (ver Material / Tabla de reactivos ), siguiendo las instrucciones del fabricante.
    11. Almacenar las muestras a -80 ° C hasta su uso.
  4. CC con azida-PEG3-biotina
    NOTA: El protocolo de CC y el enriquecimiento de perlas de estreptavidina (pasos 3.4-3.6) están ligeramente modificada del protocolo publicado por Speers y Cravatt 31.
    1. Preparar 500 l (1 mg / ml, en PBS) de las proteínas lisosómicas de las ratas tratadas con vehículo y probe--(ratas ingenuas y tratados con CFA).
    2. muestras preaclarado con 40 l de una suspensión al 50% de agarosa estreptavidina (lavado tres veces con 1 ml de PBS antes de su uso) durante 1 hora a 4 ° C. Se centrifuga durante 4 minutos a 1.000 xg a 4 ° C y tomar el sobrenadante.
    3. Añadir 11,3 l de una solución madre 5 mM de azida-PEG3-biotina y agitar.
    4. Añadir 11,3 l de una madre 50 mM recién preparada de TCEP y agitar.
    5. De premezcla 34 l de una solución de trabajo recién preparada de TBTA 1,7 mM con 11,3 l de una mM CuSO4 50 · 5H 2 O stock.
    6. Añadir 45,3 ml de una solución premezclada TBTA / CuSO 4 · 5H 2 O y vórtice.
    7. Incubar la reacción a 25 ° C durante 2 horas (un tiempo de incubación más largo no afecta a la reacción). Observar la precipitación de proteínas en este paso. Mezclar después de la primera hora de incubación.
  5. La eliminación del exceso de reactivos CC
    1. Centrifugar las muestras durante 4 minutos a 6500 xga 4 ° C y se elimina el sobrenadante.
    2. Añadir 750 l de metanol frío y se vuelve a suspender por tratamiento con ultrasonidos (5 segundos con un aparato de ultrasonidos de sonda).
    3. Centrifugar las muestras durante 4 minutos a 6500 xga 4 ° C y separar el sobrenadante usando una jeringa y la aguja.
    4. Repita el paso 3.5.2 dos veces (no se requiere tratamiento con ultrasonidos).
    5. Después del último lavado, añadir 325 l de dodecilsulfato de sodio (SDS) 2,5% en PBS al sedimento y se somete a ultrasonidos 3 veces de proteína durante 5 s.
    6. Calentar las muestras durante 5 minutos a 65 ° C y sonicar unaganancia.
    7. Centrifugar durante 5 min a 6500 xg a TA y guardar el sobrenadante.
    8. Añadir 1,4 ml de PBS para diluir la concentración de SDS al 0,5%. Almacenar a -20 ° C o continuar con el enriquecimiento de estreptavidina.
  6. Enriquecimiento estreptavidina
    1. Con PBS, llevar el volumen de las muestras obtenidas en el paso 3.5.8 a 4.2 ml. Añadir 40 l de una suspensión al 50% de agarosa estreptavidina usando una punta de corte de extremo (lavado tres veces con 1 ml de PBS antes de su uso).
    2. Incubar durante 2 horas a RT con la rotación y centrifugar durante 2 minutos a 1400 x g.
    3. Eliminar el sobrenadante sin secar los granos de sedimento y se utilizan sobrenadante residual para transferir las cuentas a un 1 ml girar la columna (ver Material / reactivo de la tabla).
    4. Lavar por gravedad con 3x 1 ml de SDS al 1% (en PBS), 3x 1 ml de 6 M urea (en PBS), y 4x 1 ml de PBS.
    5. Uso 2x 500 l de PBS para transferir las perlas a un tubo de 1,5 ml y se centrifuga durante 2 min a 1400 xg a TA. Se aspira suavemente el sobrenadante con una jeringuilla y una aguja.
    6. Eluir las proteínas unidos a la resina mediante la adición de 25 l de tampón de elución (urea 6 M, 2 M tiourea, 2% SDS, y biotina 6 mM, todos en PBS) durante 15 min a TA seguido por 15 min a 95 ° C 32.
  7. proteína Blot
    1. Añadir 5 l de tampón de 6x Laemmli (para 9 ml: 0,5 ml de 1 M Tris-HCl pH 6,8, 5 ml de 20% SDS, 5 mg de azul de bromofenol, 3 ml de glicerol, y H 2 O hasta 9 ml) y añadir 5% β-mercaptoetanol inmediatamente antes del uso. Centrifugar brevemente las muestras a 2000 xg para sedimentar la resina y carga de 25 l del sobrenadante obtenido en un gel de poliacrilamida al 4-12%.
    2. Realizar electroforesis en gel y transferencia de proteínas en una membrana de transferencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante 33.
    3. Saturar la membrana de transferencia durante 1 hora con 10 ml de un tampón de bloqueo (ver Material / Reactivo Tabla) que contiene 0,1% de Tween-20.Evitar el uso de la leche, ya que puede aumentar el fondo.
    4. Se lava la membrana con 10 ml de 0,05% de Tween-20 en PBS y añadir 10 l de estreptavidina fluorescente (ver Material / Reactivo Tabla) disuelto en 10 ml de tampón de bloqueo más 0.1% de Tween-20 durante 1 hora a RT.
    5. Lavar 4 veces con 0,05% de Tween-20 en PBS y una vez con PBS solo (10 min cada uno).
    6. Utilizar un escáner de imágenes (ver Material / reactivo de la tabla). Encienda el instrumento y el ordenador conectado. Espere hasta que esté listo.
    7. Iniciar el programa de adquisición y seleccionar el modo de fluorescencia. Seleccione el área de la membrana y elegir la carpeta de destino para los archivos guardados.
    8. Ajuste los siguientes parámetros de adquisición: 680 nm de longitud de excitación, filtro de BPFR700, 1.000 V tubo fotomultiplicador (PMT) valor (canal 2), y 25 micras de tamaño de píxel. Adquirir la imagen.

4. La localización de naaa catalíticamente activo en los pulmones del ratón por fluorescencia Microsdupdo

NOTA: El uso de sexo masculino ratones de 8 a 10 semanas de edad y llevar a cabo todos los procedimientos de conformidad con las directrices para el uso ético de los animales. Los ratones domésticos en jaulas ventiladas en un ciclo de 12 horas de luz / oscuridad y darles acceso libre a comida y agua.

  1. La administración intravenosa de ARN14686 en ratones
    1. Disolver ARN14686 en vehículo: solución salina 15% de PEG y 15% de Tween-20. Calcular la concentración de la solución de acuerdo al peso del ratón (dosis de 3 mg / kg, volumen de inyección 5 ml / kg).
    2. Proceder a la inyección iv de 3 ratones. Coloque cada ratón en un dispositivo de sujeción de plástico apropiado. A continuación, coloque el ratón de cola en agua caliente durante 2-4 minutos para permitir la vasodilatación e inyectar el compuesto IV a través de la vena de la cola.
    3. Inyectar 3 iv ratones con sólo el vehículo.
  2. Colección de pulmón y la rebanada Preparación
    Advertencia: Manipular con cuidado paraformaldehído en una campana de humos, y use guantes!
    1. Anestesiar a los ratones con Chlohidrato de RAL (400 mg / kg). Confirmar la anestesia con una pizca dedo del pie. Realizar una perfusión transcardial como sigue:
      1. Superficialmente cortar la piel ventral con las tijeras y exponer las superficies de la membrana peritoneal y torácica.
      2. Superficialmente cortar la membrana peritoneal con tijeras, justo por debajo del apéndice xifoides, y exponer el diafragma y los órganos viscerales. Tenga cuidado de no lacerar cualquier vasculatura significativa.
      3. Abra la cavidad torácica por el diafragma de corte desde un aspecto lateral a la otra.
      4. Insertar la aguja 25 G conectada a la bomba de jeringa automatizada e infundir 20 ml de solución salina al 0,9%, seguido de 60 ml de 4% PFA en tampón fosfato (0,1 M, pH 7,4).
    2. Una vez que la perfusión se ha completado, tire del corazón con unas pinzas y diseccionar cuidadosamente hacia fuera. Agarre la tráquea con unas pinzas y cortar completamente a través de él con unas tijeras. Tire suavemente de la tráquea hacia arriba y retire los pulmones de la caja torácica. Diseccionar el tejido deseparar el pulmón derecho desde la izquierda.
    3. Postfix el tejido en paraformaldehído al 4% durante 1 hr, congelar las muestras en frío de 2-metilbutano, y los almacena a -80 ° C.
    4. Recoger 40 micras secciones usando un criostato, montarlos inmediatamente en portaobjetos (uno de cada cinco), y procesarlos para inmunohistoquímica, como se detalla a continuación.
  3. Las rebanadas de tejido permeabilización y el bloqueo de
    1. Lavar con PBS (2 x durante 5 min) y permeabilizar con 0,1% Triton X-100 PBS durante 15 min a TA.
    2. Lavar con PBS (2 x durante 5 min) y bloquear con 3% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS durante 30 min a TA.
    3. Lavar con PBS (2 x durante 5 min) y proceder con CC.
  4. CC con azida-PEG3-Fluor 545 en cortes de tejido
    1. Se prepara una solución mezclando los reactivos CC preparados como se describe en la sección 2. Para 1 ml de solución, añadir: 2 l de azida-PEG3-Fluor 545 (5 mM), 20 l de TCEP (recién preparada stoc 50 mMk), 58,8 l de TBTA (recién preparada solución de trabajo de 1,7 mM), 20 l de CuSO 4 · 5H 2 O (50 mM stock) y 900 l de PBS.
    2. Añadir alrededor de 400 l de mezcla de CC a los cortes de tejido, que fueron preparados de acuerdo con el apartado 4.2. Prestar atención a que el volumen de la mezcla elegida CC es suficiente para cubrir las rebanadas. Se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente protegido de la luz.
    3. Lavar con PBS (1 x para 5 min), metanol frío (1x para 5 min), una solución de EDTA 1% de Tween-20 y 0,5 mM en PBS (3 veces durante 2 min) y PBS (1 x para 5 min).
    4. Aire seco, añadir una gota de medio de montaje antidesvanecimiento con DAPI (ver Material / reactivo de la tabla), cerrar con cubreobjetos (evitando la formación de burbujas), y sellar con el pulimento. Almacenar a 4 ° C hasta su análisis.
  5. Adquisición de imágen
    1. Utilizar un microscopio confocal equipado con 546 nm y 450 nm láseres de excitación (ver Material Tabla / Reactivo) siguientela guía del usuario.
    2. Seleccionar un lente objetivo de 60X con NA = 1,40, asegurándose de vista previa de la diapositiva a través de los oculares y de centrarse en un área de interés.
    3. Determinar los parámetros de adquisición de acuerdo con las características de la muestra y de equipos.

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Resultados

ARN14686 fue diseñado basado en el andamio de la ARN726 inhibidor naaa. El grupo 4-butil-ciclohexil de ARN726 fue sustituido con una cadena alifática saturada C9 teniendo una etiqueta de alquino terminal (Figura 1). La etiqueta de alquino se introdujo con el fin de permitir el uso de un procedimiento de marcaje de dos pasos para añadir un fluoróforo o una molécula de biotina por medio de CC. Esta característica hace que ARN14686 una herramienta muy versátil para sondear ...

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Discusión

La actividad enzimática se finamente regulada a diferentes niveles, incluyendo la transcripción de ARN, síntesis de proteínas, la translocación de proteínas, modificación después de la traducción, y la interacción proteína-proteína. A menudo, la expresión de la enzima sola no tiene en cuenta para su actividad. ABPP fue desarrollado para estudiar la actividad de las proteínas en su estado nativo. Se requieren dos características: una sonda química que se une covalentemente al sitio activo de una enzima de interés y una e...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Centro de Imágenes de Nikon en el Istituto Italiano di Tecnologia, Génova, Italia (NIC@IIT).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,1'-sulfonildiimidazol Sigma Aldrich367818Nocivo
2-dipiridiladcarbonatoFluorochem11331Nocivo
2-metilbutanoSigma AldrichM32631Inflamable, tóxico, peligroso para el medio ambiente acuático
4-(Dimetilamino)piridinaSigma Aldrich107700
Tóxico Ácido acéticoSigma Aldrich695092Inflamable, corrosivo
Acetonitrilo Sigma Aldrich34998Inflamable, Tóxico
Carbón activadoSigma Aldrich161551
Cloruro de amonioSigma AldrichA9434
Azodina-PEG3-BiotinaJena BiosciencesCLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545Jena BiosciencesCLK-AZ109
Kit de ensayo de proteínas BCAThermo Fisher Scientific23227
Columnas de biocentrifugadoBiorad732-6204
BiotinaSigma AldrichB4501
Tampón de bloqueoLi-Cor Biosciences927-40000
β-mercaptoetanolSigma AldrichM6250
Albúmina sérica Bovin altamente tóxica (BSA)Sigma AldrichA7030
Azul de bromofenolSigma AldrichB0126
Bruker Avance III 400Bruker
CeliteSigma Aldrich419931Peligro para la salud
Nitrato de amonio cérico Sigma Aldrich22249Hidrato de cloral oxidante, nocivo
Sigma AldrichC8383
CuSO4.5H2O Sigma Aldrich209198
Tóxico CiclohexadienoSigma Aldrich125415Inflamable, Peligro para la salud
Ciclohexano SigmaAldrich34855Inflamable, Nocivo, Peligro para la salud, Peligro para el medio ambiente
DiclorometanoSigma Aldrich34856Nocivo, Peligro para la salud
Éter dietílicoSigma Aldrich296082Inflamable, Sulfóxido de
dimetilo nocivo (DMSO)Acros Organics348441000
sulfóxido de dimetilo d6 (DMSO-d6)Sigma Aldrich175943
EtanolSigma Aldrich2860Inflamable, Nocivo
Acetato de etiloSigma Aldrich34858Inflamable, Glicerol nocivo
Sigma AldrichG5516
Irdye 680-LT EstreptavidinaLi-Cor Biosciences925-68031
IRDye680-LT Estreptavidina Licor925-68031Centrifugar brevemente antes de usar para precipitar complejos de proteínas
MetanolSigma Aldrich34966Altamente tóxico
MetanolSigma Aldrich34860Inflamable, Tóxico, Peligro
para la saludN-(3-Dimetilaminopropil)-N′ -clorhidrato de etilcarbodiimidaSigma AldrichE7750Dañino, Corrosivo
N,N-diisopropiletilaminaSigma AldrichD125806Inflamable, Corrosivo, Tóxico
N,N-dimetilformamidaSigma Aldrich227056Inflamable, Nocivo, Peligro
N-Cbz-L-SerinaFluorochemM03053Nocivo
Microscopía confocal Nikon A1NikonLeer el manual
de usuario NuPAGE 4-12% Bis-Tris gelThermo Fisher Scientific
Paladio en carbonoSigma Aldrich
p-anisidinaSigma AldrichA88255Tóxico, Peligro para la salud, Peligro
para el medio ambienteParaformaldehídosigma Aldrich 441244Tóxico, respiratorio nocivo, corrosivo, falmable
Poli(etilenglicol) Sigma AldrichP3265
ProLong Gold con DAPI Thermo Fisher ScientificP36931Evite la formación de burbujas
Cóctel inhibidor de proteasaSigma AldrichP8340
Bicarbonato de sodioSigma AldrichS6014
Dodecil sulfato de sodio (SDS) Sigma AldrichL3771Tóxico, corrosivo, falmable
Hidruro de sodio Sigma Aldrich452912
Sulfato de sodioSigma Aldrich239313
Starion FLA-9000 escáner de inmageFUJIFILMLeer el manual de usuario
Estreptavidina agarosaThermo Fisher Scientific20349
SacarosaSigma AldrichS7903
Terc-butanolSigma Aldrich360538Tóxico, inflamable
TetrahidrofuranoSigma Aldrich186562Inflamable, Nocivo, Peligro para la salud
ThioureaAcros Organics424542500Tóxico, caliente a 50 & grados; C para disolver
TrisSigma AldrichRDD008
Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)Sigma AldrichC4706
Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (TBTA)Sigma Aldrich678937
Triton-x100Sigma AldrichX100Tóxico
Tween-20Sigma AldrichP9416
Tween-80Sigma AldrichP1754
Ultra turrax IKA T18 homogeneizador de tejidos básicosIKA
Undec-10-yn-1-olFluorochem13739Urea Nociva
Sigma AldrichU5378Tóxico, caliente a 50 ° C para disolver
para la salud NP0335BOX 330108Montaje antidecoloración inflamable

Referencias

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