Artículo de método

Una nueva técnica para generar y Observación de quimioluminiscencia en un Contexto biológico

DOI:

10.3791/54694

⸱

9 de marzo de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2KAUST Catalysis Center, King Abdullah University of Science and Technology, 3Department of Chemistry, Hunter College, and PhD Program in Chemistry, Graduate Center of City University of New York, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe una nueva técnica de imagen intraoperatoria que utiliza un complejo de rutenio como fuente de emisión de luz quimioluminiscente, produciendo así altas relaciones señal-ruido durante la obtención de imágenes in vivo. Las imágenes intraoperatorias son un campo en expansión que podría revolucionar la forma en que se realizan los procedimientos quirúrgicos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las técnicas de imagen intraoperatoria tienen el potencial de hacer que las intervenciones quirúrgicas sean más seguras y efectivas; por estas razones, dichas técnicas se están trasladando rápidamente al quirófano. Aquí, presentamos un nuevo enfoque que utiliza una técnica aún no explorada para la imagen intraoperatoria: la imagen quimioluminiscente. Este método emplea un reportero quimioluminiscente a base de rutenio junto con un sistema de nebulización hecho a medida para producir imágenes ex vivo o in vivo con altas relaciones señal-ruido. El reportero a base de rutenio produce luz después de la exposición a una solución oxidante acuosa y la rereducción dentro del tejido circundante. Este método nos ha permitido detectar concentraciones reporteras tan bajas como 6,9 pmol/cm2. En este trabajo, presentamos una guía visual de nuestros estudios in vivo de prueba de concepto que involucran inyecciones subdérmicas e intravenosas en ratones. Los resultados sugieren que esta tecnología es una candidata prometedora para futuras investigaciones preclínicas y, en última instancia, podría convertirse en una herramienta útil en el quirófano.

Introducción

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En las últimas décadas, las tecnologías de imágenes han revolucionado la forma en que los médicos a diagnosticar y controlar la enfermedad. Estas tecnologías de la imagen, sin embargo, han sido en gran parte limitada a los sistemas de formación de imágenes de todo el cuerpo, como la tomografía por emisión de positrones (PET), emisión de fotón único tomografía computarizada (SPECT), tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética nuclear (RMN). Especial atención se ha prestado a cáncer, y los avances tecnológicos de imagen han mejorado en gran medida la forma en que esta enfermedad es diagnosticada y tratada. A pesar de estos avances, hay un lugar donde estas tecnologías de imagen simplemente no encajan: la sala de operaciones. Mientras que las técnicas de imagen de todo el cuerpo puede ayudar en la planificación quirúrgica, por lo general carecen de resolución espacial lo suficientemente altas como para ayudar a los médicos a determinar en tiempo real si todo el tejido del tumor ha sido eliminado o tejido tumoral residual permanece oculto en los márgenes quirúrgicos 1. Asegurándose de que no infiltrantelos márgenes del tumor se quedan atrás es uno de los objetivos quirúrgicos más importantes, y los cirujanos deben caminar una cuerda floja entre la resección de tejido rigurosa y prudente. Si se quita demasiado, se exacerban los efectos secundarios no deseados para el paciente; si no hubiese suficiente se retira, las tasas de recurrencia se incrementan 2, 3. Por lo tanto, es crucial para delinear los márgenes tumorales precisos, y creemos que las imágenes intraoperatorias quimioluminiscente puede ayudar a mejorar la precisión de la identificación de los márgenes del tumor, ayudando a los cirujanos visualizar el tejido maligno que de otro modo podrían no ser detectados con técnicas establecidas.

Hay muchas tecnologías de imagen que actualmente se investigan por su posible utilidad como sistemas de imágenes intraoperatorias. Estos incluyen sondas y ß-γ-emisores de radiación de fluorescencia óptica 4, 5, 6 espectroscopia Raman >, 7 y Cherenkov luminiscencia 8, 9. Hasta la fecha, sin embargo, ninguno de ellos se han establecido como herramientas clínicas estándar. imágenes de fluorescencia óptica hasta ahora ha demostrado ser el más prometedor de estas técnicas y por lo tanto es el más explorado. Si bien ya se ha demostrado ser una herramienta valiosa para muchas aplicaciones, no es sin sus limitaciones. De hecho, su principal inconveniente es la fluorescencia de fondo generado por el tejido biológico inherentemente autofluorescent. Esta señal de fondo autofluorescente es un producto de la excitación del tejido circundante, además de la fluoróforo, por la fuente de luz externa necesaria para la generación de una señal fluorescente. Desde una perspectiva práctica, esta autofluorescencia puede potencialmente conducir a bajas relaciones señal-ruido, que pueden limitar la utilidad de esta tecnología en la sala de operaciones.

El directorventaja de quimioluminiscencia de imágenes sobre imágenes de fluorescencia es que ninguna luz de excitación es necesario. Como resultado, no hay fondo autofluorescencia. En las imágenes de quimioluminiscencia, la energía de excitación en su lugar se genera químicamente. Este proceso no produce señal de fondo no deseada y por lo tanto puede dar lugar a mayores relaciones de señal a ruido. Esto podría resultar en última instancia, la detección más precisa y exacta de los márgenes quirúrgicos. Sorprendentemente, la utilidad de este enfoque como una técnica de imagen intraoperatoria ha permanecido inexplorado 10. De hecho, el ejemplo más cercano a esta técnica es la oxidación del luminol por la mieloperoxidasa en ratones 11, 12, 13. Por lo tanto, las imágenes biomédicas quimioluminiscente es una zona bastante inexplorada de la investigación que podría ofrecer las siguientes ventajas: (1) autofluorescencia mínima que resulta en una señal de fondo baja con hiGher relaciones de señal a ruido; (2) longitudes de onda sintonizables de las emisiones de quimioluminiscencia que van desde lo visible a lo infrarrojo cercano; y (3) los complejos de quimioluminiscencia funcionalizables que, cuando se combina con las tecnologías de engarce y biomoléculas que ya existen dirigido, proporcionan acceso a bibliotecas enteras de sondas de imagen moleculares específicos 14.

Este estudio de prueba de principio ilustra la utilidad potencial de las imágenes quimioluminiscente en el entorno biomédico utilizando un agente de formación de imágenes basado en rutenio. Las propiedades de este compuesto quimioluminiscente están bien estudiados, con las investigaciones que se remontan a mediados de la década de 1960 15. Tras la activación química, el agente produce la luz en torno a 600 nm 16, que es muy adecuado para los propósitos de imágenes médicas. La energía de activación se proporciona por una reacción redox que conduce a un estado excitado, que tiene una duración de 650 ns en agua 17 -folladeudado por la generación de fotones sobre la relajación de este estado excitado. A través del uso de un nebulizador a distancia especialmente diseñado, hemos sido capaces de detectar el compuesto tanto ex vivo como in vivo. Los resultados de los experimentos iniciales son muy prometedores, lo que sugiere una mayor investigación de esta tecnología.

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Protocolo

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Declaración de la ética: Todos los experimentos con animales en vivo descritos se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado y bajo las directrices éticas del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC).

1. Construcción de un dispositivo de nebulización

  1. Adjuntar parte de madera A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) en posición vertical en el centro de la parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3), utilizando dos tornillos (4 x 25 mm 2). Adjuntar madera parte C (11 × 2,5 × 1,8 cm 3) a la mitad de la parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) mediante un tornillo, de manera que la parte C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) todavía se pueden mover. Ver Figura 1.
  2. Haga dos agujeros a través de la punta inferior de la botella de spray de disparo de un 3 oz mini rociador plástico (D) y empujar una varilla de acero inoxidable (10 cm de "acero 1/16) (E) a través para formar dos bucles, uno a cada lado del gatillo.
  3. Envuelva la parte inferior de la botella de spray con cinta adhesiva (F) para evitar los lazos de cable se deslice. Coloque la botella de spray a la madera la parte C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3), utilizando las dos bridas de plástico (28 cm) (G).
  4. Cortar el motor servo 011 (I) y volverlo a conectar con los cables sueltos de la servo control (H). A continuación, conecte el servomotor a la parte superior de la parte de madera A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) el uso de cinta adhesiva.
  5. Adjuntar un lápiz (J) a la palanca de servomotor con el clip de papel (K). Firmemente conectar las partes más externas del lápiz para los bucles de varilla de acero recubiertas de plástico que utilizan cables de torsión (L) y asegurar los extremos en el lápiz con cinta adhesiva.
  6. Cortar el conector del cable magnético de la unidad de control del motor servo (M) y vuelva a conectarlo al cable del altavoz (N). A continuación, la cinta de la unidad de control del motor servo a la madera de la parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Cortar un cable con conectores magnéticos W1 por la mitad y colocar una parte por el extremo suelto de la s cobrepeaker cable (1 m). Conectar el interruptor de palanca (magnética) i2 y el poder p1 al cable W1 disponible y una batería de 9V.

2. Sensibilidad determinación del método

  1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, preparar soluciones de [Ru (bpy) 3] Cl 2 en el agua de ósmosis inversa (100 l) en cantidades de 260 mg (347 nmol), 52 mg (69 nmol), 26 mg (34 nmol) , 5 g (6,9 nmol), 3 g (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), y 3 ng (3,5 pmol).
  2. Mezclar 100 l de cada [Ru (bpy) 3] Cl 2 solución con 100 l de una solución acuosa de nitrato de cerio amonio ((NH4) 2 Ce (NO 3) 6) en agua (25 mM) en un portaobjetos de microscopio.
  3. Configurar la adquisición en el lector de bioluminiscencia inicializando el software de imágenes.
    1. Iniciar sesión en el perfil de usuario y buscar la adquisición del panel de control. Haga clic en "Iniciar" y esperar hasta que el instrumento está listo.
    2. Busque "Modo de imagen" y asegúrese de que "luminiscente" y "Fotografía" se comprueban y que "fluorescente" no esté marcada.
    3. Cambio "tiempo de exposición" para establecer "luminiscente" a 20 s. Establecer los ajustes restantes para "luminiscente" de la siguiente manera: "Agrupación": Media; "F / parada": 1; y "filtro de emisión": Abierto.
      NOTA: que tenga que ser adaptada de acuerdo con la instrumentación y configuración experimental utilizada Los tiempos de exposición, si es diferente de la configuración presentada.
    4. Por "Fotografía", utilice los siguientes ajustes: "El tiempo de exposición": auto; "Agrupación": Media; y "F / parada": 8. Ajuste el "Asunto Altura" en las imágenes de target.Look para el menú desplegable "Campo de visión". El ajuste inicial es "C" Cambiará a "B" (14 cm de distancia entre la cAmera y etapa de la muestra).
  4. Configurar el nebulizador mediante la colocación de un portaobjetos de microscopio en una hoja de papel de construcción negro en el suelo de la cámara de formación de imágenes para protegerlo de agente oxidante. Mezclar un 100 μLdroplet de [Ru (bpy) 3] 2 Cl solución al con 100 l de una solución acuosa de (NH4) 2 Ce (NO3) 6. Observe el cuadro de cruz verde.
    1. Colocar el tema de imagen en el papel de construcción negro, de tal manera que el área de interés está en el centro de la caja de luz verde en forma de cruz aparece en la etapa de la muestra. Preparar el nebulizador separando la botella con atomizador de plástico del soporte de madera. Llene una solución de trietilamina (1: 3 en agua / etanol) en su depósito de plástico y vuelva a conectarlo al soporte de madera.
    2. Coloque el nebulizador en el interior del lector de bioluminiscencia y asegúrese de que el cable de alimentación está desconectado del cable de nebulizador. Asegúrese de que el interruptor de encendidoestá activado, el interruptor de palanca está apagado, y el LED rojo está encendido Coloque el nebulizador de tal forma que el flujo de pulverización está dirigido hacia el área de interés en la materia de formación de imágenes, al tiempo que minimiza la vista obstrucción de la cámara hacia el tema de formación de imágenes por la cabeza de la boquilla de pulverización.
    3. Colocar las piezas pequeñas, negro de papel de construcción más puntos calientes potenciales (por ejemplo, las marcas blancas en las placas del microscopio o en los sitios de inyección) para protegerlos de aerosol. Coloque al menos 40 cm de la cuerda alejada nebulizador dentro de la cámara de formación de imágenes, de manera que no interfiera con el sujeto de formación de imágenes, el nebulizador, o el pestillo de la puerta magnética. Cierre la puerta del sistema de imagen.
      NOTA: El punto de mira cambiará el tamaño basándose en el "campo de visión" en la configuración "imagen viva"; asegúrese de que está ajustado a "B".
  5. Adquirir una imagen mediante el inicio de la secuencia de imágenes. Haga clic en "Adquirir" en el "Panel de control de adquisición". En la primera imagen lentejcia, permiten el guardado automático si se desea (recomendado) y elija una carpeta de datos. Ignorar el cuadro de diálogo "Editar etiquetas de formación de imágenes" hasta el final de la secuencia.
    NOTA: El software de control muestra las acciones del instrumento paso a paso en tiempo real. Después de preparar la medición y moviendo la etapa de la muestra a la posición correcta, se abre el obturador de la cámara y cuenta el tiempo de medición. La apertura del obturador también puede ser escuchado por un sonido de clic generada por la máquina.
  6. A medida que se abre el obturador, rocíe tres explosiones de una solución de trietilamina (1: 3 en agua / etanol, 0,24 ± 0,04 ml por ráfaga spray) cambiando el interruptor de palanca de tres veces para generar quimioluminiscencia.
    NOTA: La etapa de la muestra se mueva durante la medición. Deje suficiente cable (mínimo 40 cm) dentro del instrumento para permitir esto. Asegúrese de que la solución a pulverizar por el nebulizador puede ser aspirado por el tubo ascendente y que no hay burbujas de aire en la tubería. Tienen varias incluye batería de repuestos para el nebulizador listo en caso necesario.

3. Después de imágenes in vivo Sistémico inyección intravenosa

  1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, preparar 100 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene entre 8 y 33 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Preparar una solución acuosa de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 en agua (25 mM) al mismo tiempo.
  2. Por vía intravenosa inyectar 100 l de [Ru (bpy) 3] Cl 2 en la vena caudal de ratones sanos (n = 5).
  3. La eutanasia a los ratones 10 minutos después de la inyección mediante asfixia con CO2.
    1. Quitar la piel con un Y-corte del torso, a continuación, quitar el arco costal en forma de U para exponer el corazón y los pulmones. Perfundir los ratones mediante la reducción de una salida en la aurícula derecha y la inyección de 20 ml de PBS a través de una aguja de calibre 24 en el ventrículo izquierdo 18. Corte con cuidado a través del vientrepiel y exponer el riñón y el hígado. Cortar longitudinalmente a través de los órganos para crear un corte visible.
  4. Configurar la adquisición como se describe en los pasos 2,3-2,6, con los siguientes cambios.
    1. Después de lavar a fondo el depósito de plástico nebulizador, llenarlo con una solución de (NH4) 2 Ce (NO3) 6 en agua (25 mM) en lugar de trietilamina.
      NOTA: Es importante aclarar a fondo la boquilla del nebulizador después de cada uso, dado que la cristalización (NH4) 2 Ce (NO3) 6 pueden destruir la boquilla de pulverización después de varios usos.
  5. Utilice el conjunto de muestras de órganos animales o para la imagen.
    1. Para obtener imágenes de todo el abdomen, coloque la carcasa del ratón con el abdomen abierto frente a la cámara y la cabeza apuntando hacia la parte posterior del instrumento. Centrar el órgano para formar una imagen (por ejemplo, el hígado o el riñón) en el cuadro de luz verde en forma de cruz.
    2. Fo individuo de imágenes de órganos y cuantificación, quitar el ratón desde el instrumento de imagen y el pin hacia abajo. A partir de la cavidad del cuerpo ya abierto-, extirpar los órganos internos (por ejemplo, riñón, hígado, pulmón, músculo, bazo, cerebro, y corazón). Corte a través de la piel de la pierna trasera para extirpar el tejido muscular. Abra cuidadosamente el cráneo con un bisturí para cortar el cerebro.
      1. Si el órgano de interés es el hígado, los riñones o el bazo, cortar todos los órganos en la mitad longitudinalmente, coloque cada órgano en una placa de Petri o un pedazo de papel de construcción negro.
    3. Siga el procedimiento descrito en los pasos 2.3-2.6 para establecer la relación de emisión del trazador de quimioluminiscencia de órganos individuales.

4. imágenes in vivo de los ganglios linfáticos

  1. Preparar 10 l de una solución de PBS que contiene 80 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Preparar una solución acuosa de (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 en water (25 mM) al mismo tiempo.
  2. Inyectar 10 l de la solución por vía subdérmica en la pata trasera de ratones sanos (n = 5). Como control negativo, inyectar la pata contralateral con 10 l de PBS puro. Sacrificar los ratones mediante asfixia con CO2 15 minutos después de la inyección. Retire la piel de ambas patas traseras para dejar al descubierto los canales linfáticos hasta los ganglios linfáticos poplíteos.
  3. Configurar la adquisición como se describe en el paso 3.4.
  4. Extraer los ganglios linfáticos poplíteos de ambas patas traseras, cortarlos por la mitad, y rociarlas con oxidante en un plato de Petri, como se ha descrito antes (etapa 3.5.3), con el propósito de cuantificación.

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Resultados

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El sistema nebulizador se describe en la sección de protocolo 1 puede construirse a partir de materiales fácilmente disponibles a un bajo costo. Se tiene la intención de ser una inserción para-remoto activado pulverización del agente reductor / oxidante dentro de un lector de bioluminiscencia (Figura 1). Nuestro diseño permite la operación segura del nebulizador en el lector de bioluminiscencia a una distancia de 14 cm desde el objetivo. No se observó ningún empañamiento...

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Discusión

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Aquí, hemos presentado una tecnología que es capaz de delinear ópticamente tejido por medio de la emisión de fotones creados por un reportero de quimioluminiscencia. En contraste con otras, más establecido, las tecnologías de 4, 5, 6, 7, 8, 9, este sistema reportero quimioluminiscente emplea una sonda de formación de imágene...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen al Prof. Jan Grimm y al Sr. Travis Shaffer por sus útiles discusiones y al Sr. David Gregory por editar el manuscrito. Se agradece los servicios técnicos prestados por el Centro Central de Imágenes Animales de MSK, respaldado en parte por la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico P30CA008748-48 de los NIH. Los autores agradecen a los NIH (K25 EB016673 y R21 CA191679, T.R. y 4R00CA178205-02, B.M.Z.), al Centro MSK de Imágenes Moleculares y Nanotecnología (T.R.), a la Fundación Tow (B.C.) y a la National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 en Hunter College for B.C. y T.M.S.) por su generoso apoyo. La investigación reportada en esta publicación fue financiada por la Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pieza de madera A (12,5 y veces; 2,5 y veces; 1,8 cm)  131404 de carpinteríaCorte de una hoja de madera contrachapada de abedul de 3/4" x 24" x 30" Pieza de
madera B (12.7 veces; 10.7 veces; 1.8 cm)131404de carpinteríaCorte de una hoja de madera contrachapada de abedul de 3/4" x 24" x 30"
Pieza de madera C (11 veces; 2.5 veces; 1.8 cm)131404 de carpinteríaCorte de 3/4" x 24" x 30 cm rdquo; Hoja de madera contrachapada de abedul
Tornillos (4 y veces; 25 mm)Screwfix79939
Harmon Face Values Mini rociador de 3 ozBed, Bath and Beyond
(10 cm de acero de 1/16")Metals Depot Int. Inc.2192
Pencil Classic HBPapermate58592
ClipOffice Depot221720
cable de altavozRCA Inc.
Pila alcalina Energizer 9VEnergizer Holdings Inc.EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, par de salida de 3.4 kg / cm @ 6VHitech RCD USA Inc.32082S
NombreEmpresaNúmero de catálogo Comentarios
Bridas de plástico de 28 cmGeneral Electric Inc.50725
Cinta adhesiva3M Inc.3939
littleBits w1 cablelittleBits Inc.w1 cable
littleBits p1 potencialittleBits Inc.p1 power
littleBits i2 interruptor de palancalittleBits Inc.de palanca i2
littleBits 011 servolittleBits Inc.011 servo
20 cm bridas de alambre recubiertasde plástico Four Star Plastics71TIE8000
Tris(2,2′-bipiridyl)diclororutenio(II) hexahidratadoSigma-Aldrich Inc.
Nitrato de cemonio (IV)Sigma-Aldrich Inc.22249
IsofluoranoBaxter Healthcare1001936060
PBSSigma-AldrichPBS1
EtanolSigma-Aldrich2854
TrietilaminaSigma-Aldrich Inc.T0886
AguaEl agua se purificó utilizando un Milipore Mili-Q (R≥ 18 MΩ)
Ratones hembra desnudos (endogámicos)Jackson Laboratories1929edad 5 - 6 semanas
Cepa C57BL/6J   
Ratones machos NU/J at Jackson Laboratories2019edad 6 – 8 semanas
Lector de bioluminiscencia IVIS 200Caliper Live Science
Live Image 4.2 softwarePerkin-Elmer128165
Portaobjetos de microscopioThermoScientific4951PLUS4
Varilla de acero inoxidable AH1650SNInterruptor 224758

Referencias

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